nghiên cứu trích ly lipase từ nội tạng cá lóc

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG DƯƠNG Ý THƠ NGHIÊN CỨU TRÍCH LY LIPASE TỪ NỘI TẠNG CÁ LÓC Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Cần Thơ, 2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TRÍCH LY LIPASE TỪ NỘI TẠNG CÁ LÓC Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: Ts. Trần Thanh Trúc Dương Ý Thơ MSSV: 2101960 Lớp Công nghệ thực phẩm khóa 36 Cần Thơ, 2013 LỜI CAM ĐOAN  Đề tài luận văn tốt nghiệp “Nghiên cứu trích ly lipase từ nội tạng cá lóc” công trình nghiên cứu sinh viên Dương Ý Thơ với hướng dẫn Ts. Trần Thanh Trúc. Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực tác giả thực hiện. Cần Thơ, ngày 08 tháng 12 năm 2013 Giáo viên hướng dẫn Người cam đoan Dương Ý Thơ Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ LỜI CẢM TẠ  Nhờ tận tình giúp đỡ thầy cô bạn, đề tài tốt nghiệp em hoàn thành. Có kết này, em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến: Cô Trần Thanh Trúc Thầy Nguyễn Văn Mười, người trực tiếp hướng dẫn giúp đỡ em suốt thời gian thực đề tài. Mặc dù bận rộn với công việc giảng dạy thầy cô thường xuyên theo dõi, hướng dẫn giúp đỡ em tận tình. Thầy cô Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ cho em kiến thức quý báu thời gian học tập trường. Những kiến thức tích lũy từ giảng dạy tận tình quý thầy cô giúp em nhiều trình thực đề tài này. Cán phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ, tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt đề tài mình. Anh Trần Thế Hiển – học viên Cao học ngành Công nghệ thực phẩm khóa 20, anh truyền đạt cho em nhiều kinh nghiệm quý báu, giúp đỡ em tận tình kiến thức phương pháp học tập, nghiên cứu. Các anh chị Cao học Công nghệ thực phẩm khóa 18, khóa 19, bạn sinh viên lớp Công nghệ thực phẩm khoá 36 nhiệt tình đóng góp ý kiến động viên giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài phòng thí nghiệm. Cuối lời em xin gởi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể quý thầy cô trường Đại học Cần Thơ tận tình truyền đạt kiến thức cho em suốt năm học tập trường. Kính chúc quý thầy cô bạn dồi sức khỏe thành công. Em xin chân thành cảm ơn. Cần Thơ, ngày 08 tháng 12 năm 2013 Sinh viên thực Dương Ý Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng Trang i Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ TÓM TẮT  Đề tài thực nhằm mục đích xác định điều kiện thích hợp cho trình trích ly enzyme lipase từ nội tạng cá lóc. Trong phạm vi nghiên cứu đề tài khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu dung môi trích ly, giá trị pH, thời gian nhiệt độ trích ly đến trình thu nhận enzyme lipase. Hoạt tính enzyme xác định theo phương pháp chuẩn độ NaOH 0,05 N với phenolphtalein chất thị. Kết thí nghiệm cho thấy hiệu trích ly lipase đạt tốt với hoạt tính lipase thu 5,94 ± 0,16 U/g CKNL sử dụng đệm phosphate với pH = để trích ly tỷ lệ nguyên liệu dung môi trích ly 1: 4, thời gian trích ly nhiệt độ trích ly 50C. Từ khoá: đệm phosphate, lipase, nhiệt độ trích ly, nội tạng cá lóc, thời gian trích ly Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng Trang ii Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN . ii LỜI CẢM TẠ i TÓM TẮT . ii MỤC LỤC . iii DANH SÁCH HÌNH . v DANH SÁCH BẢNG . vi CHƯƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 TỔNG QUAN 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CHƯƠNG LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU . 2.1 TỔNG QUAN VỀ NGUYÊN LIỆU . 2.1.1 Cá lóc . 2.1.2 Tình hình nuôi trồng cá lóc 2.2 TỔNG QUAN VỀ ENZYME LIPASE . 2.1.1 Giới thiệu . 2.1.2 Đặc điểm cấu trúc lipase 2.2.3 Cơ chế phản ứng 2.2.4 Tính đặc hiệu enzyme lipase . 11 2.2.5 Phân loại enzyme lipase . 11 2.2.6 Một số tính chất lipase . 12 2.2.7 Các nguồn thu nhận . 14 2.2.8 Cơ chế sinh tổng hợp lipase từ vi sinh vật . 15 2.2.9 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp lipase . 17 2.2.10 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzyme lipase . 18 2.2.11 Các phương pháp xác định hoạt tính enzyme lipase 20 2.2.12 Ứng dụng . 21 2.3 QUÁ TRÌNH TRÍCH LY LIPASE TỪ NỘI TẠNG 23 2.3.1 Định nghĩa . 23 2.3.2 Cơ sở lý thuyết trình trích ly enzyme 24 2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình trích ly enzyme 24 2.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN 25 CHƯƠNG PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM . 27 3.1.1 Địa điểm, thời gian . 27 3.1.2 Dụng cụ, thiết bị . 27 3.1.3 Hóa chất dùng thí nghiệm . 27 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 28 3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu 28 3.2.2 Phương pháp phân tích đo đạc kết 28 3.2.3 Phương pháp thu thập xử lý kết . 29 Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng Trang iii Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ 3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU . 29 3.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 29 3.3.2 Phân tích thành phần nguyên liệu . 30 3.3.3 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu nước cất đến hoạt tính enzyme lipase trích ly từ nội tạng cá lóc . 31 3.3.4 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng loại dung môi trích ly pH đến hoạt tính enzyme lipase trích ly từ nội tạng cá lóc . 32 3.3.5 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng thời gian trích ly đến hoạt tính enzyme lipase trích ly từ nội tạng cá lóc 33 3.3.6 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ trích ly đến hoạt tính enzyme lipase trích ly từ nội tạng cá lóc 35 CHƯƠNG KẾT QUẢ THẢO LUẬN . 36 4.1 Thành phần hoá lý nội tạng cá lóc 36 4.2 Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu nước cất đến hoạt tính enzyme lipase trích ly từ nội tạng cá lóc . 36 4.3 Ảnh hưởng việc điều chỉnh pH ban đầu dung môi trích ly đến hoạt tính enzyme lipase trích ly từ nội tạng cá lóc . 38 4.4 Ảnh hưởng thời gian trích ly đến hoạt tính enzyme lipase từ nội tạng cá lóc 39 4.5 Ảnh hưởng nhiệt độ trích ly đến hiệu thu nhận lipase từ nội tạng cá lóc 40 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 5.1 KẾT LUẬN . 43 5.2 KIẾN NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 44 PHỤ LỤC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH . vii PHỤ LỤC KẾT QUẢ THỐNG KÊ . xiv Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng Trang iv Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1: Cá lóc (Channa argus) . Hình 2.2: Cấu trúc tinh thể lipase Thermomyces lanuginose Hình 2.3: Hoạt tính bề mặt lipase Hình 2.4: Trung tâm hoạt động lipase Thermomyces lanuginose Hình 2.5: Phản ứng thủy phân triacylglycerol enzyme lipase . Hình 2.6: Phản ứng thủy phân triacylglycerol theo bậc enzyme lipase . 10 Hình 2.7: Cơ chế phản ứng thuỷ phân lipase 10 Hình 3.1: Nguyên liệu trước sau xử lý . 28 Hình 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát . 29 Hình 3.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 32 Hình 3.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 33 Hình 3.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 34 Hình 3.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 35 Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng Trang v Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1: Ba nhóm phương pháp xác định hoạt tính enzyme lipase . 20 Bảng 2.2: Ứng dụng lipase công nghiệp . 21 Bảng 3.1: Phương pháp phân tích tiêu 28 Bảng 4.1: Thành phần hoá lý nội tạng cá lóc 36 Bảng 4.2: Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu nước cất đến hoạt tính enzyme lipase thu nhận từ nội tạng cá lóc . 37 Bảng 4.3: Ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme lipase thu nhận từ nội tạng cá lóc . 39 Bảng 4.4: Ảnh hưởng thời gian trích ly đến hoạt tính lipase thu nhận từ nội tạng cá lóc. 40 Bảng 4.5: Ảnh hưởng nhiệt độ trích ly đến hoạt tính enzyme lipase từ nội tạng cá lóc . 41 Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng Trang vi Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 TỔNG QUAN Trong năm gần đây, việc sản xuất chế phẩm enzyme loại phát triển mạnh mẽ quy mô công nghiệp. Thực tế có hàng nghìn chế phẩm enzyme bán thị trường giới, chế phẩm khai thác tinh chế có mức độ tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp ứng dụng. Các chế phẩm enzyme phổ biến amylase, protease, catalase, cellulase, lipase, glucoseoxydase,… Chế phẩm enzyme không ứng dụng y học mà ứng dụng nhiều lĩnh vực công nghiệp khác nhau, nông nghiệp, hóa học,… Có thể nói ý nghĩa việc sử dụng enzyme lĩnh vực thực tế không so với ý nghĩa việc sử dụng lượng nguyên tử (Ngô Tiến Hiển, 2010). Trong 20 năm cuối kỷ XX năm đầu kỷ XXI có nhiều enzyme khác thương mại hóa ứng dụng thực tiễn hầu hết lĩnh vực đời sống, Ở Việt Nam bước đầu có nhiều nghiên cứu ứng dụng enzyme chế biến nông sản, thực phẩm, lĩnh vực sản xuất bia, rượu, chế biến tinh bột (Ngô Tiến Hiển, 2010). Lipase (glycerol ester hydrolase, EC 3.1.1.3) enzyme ứng dụng nhiều ngành công nghiệp thực phẩm, công nghiệp hóa học, mỹ phẩm, da, y dược ngành công nghiệp khác có khả xúc tác thủy phân triglyceride thành di, mono glyceride glycerol acid béo nhờ hoạt động bề mặt phân pha dầu nước. Trong công nghiệp dầu chất béo, việc sử dụng lipase phổ biến. Có khoảng 100 lipase khác dùng để chuyển đổi lipid thành chất khác (Marae Hammond, 1985). Hiện nay, Việt Nam sử dụng lượng lớn lipase công nghiệp thực phẩm, công nghiệp tẩy rửa, hóa học y học… song chế phẩm enzyme sử dụng phần lớn nhập với giá thành cao. Vì thế, việc nghiên cứu, sản xuất chế phẩm enzyme có nguồn gốc tự nhiên đòi hỏi cấp thiết nhiều quốc gia giới có Việt Nam. Do vậy, mục đích đề tài tập trung nghiên cứu thu nhận enzyme lipase từ nột tạng cá lóc phương pháp trích ly nhằm thu enzyme có hoạt tính cao nhất. 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Xác định thông số trình trích ly lipase có hiệu suất cao từ nội tạng cá lóc. Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng Trang Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Girousse A. and D. Langin, 2012. Adipocyte lipases and lipid droplet-associated proteins: insight from transgenic mouse models. International Journal of Obesity, 36: 581-594. Guit, R.P.M., M. Kloosterman, G.W. Mindersma, M. Mayer and E.M. Meijer, 1991. Lipase kinetics: hydrolysis of triacetin by lipase from Candida cylindracea in a hollow fiber membrane reactor. Biotechnol Bioeng, 38: 727–732. Han, S.J., J.H. Back, M.Y. Yoon, P.K. Shin, C.S. Cheong, M.H. Sung, S.P. Hong, I.Y. Chung and Y.S. Han, 2003. Expression and characterization of a novel enantioselective lipase from Acinetobacter species SY-01. Biochimie, 85: 501-510. Hjorth, A., E. Carriere and C. Cudrey, 1993. A structural domain (the lid) found in pancreatic lipases is absent in the guinea pig (phospholipase) lipase. Biochemistry, 32. Izumi, T., K. Nakamura and T. Fukase, 1990. Purification and characterization of a thermostable lipase from newly isolated Pseudomonas sp. KWI-56. Agric Biol Chem, 54: 1253-1258. Jaeger, K.E. and T.M. Reetz, 1998. Microbial lipases from versatile tools for biotechnology. Trends Biotechnol, 16: 396-403. Janssen, P.H., C.R. Monk and H.W. Morgan, 1994. A thermophilic, lipolytic Bacillus sp., and continuous assay of its p-nitrophenyl-palmitate esterase activity. FEMS Microbiol Lett, 120: 195-200. Jensen, R.G., 1983. Detection and determination of lipase (acylglycerol hydrolase) activity from various sources. Lipids, 18: 650-657. John, M.D., 2000. Chemical and Physical Properties of Fatty Acids. In: Ching Kuang Chow (editor). Fatty acids in foods and their health implications. USA. 1041 pp. Kamini, N.R., T. Fujii, T. Kurosu and H. Lefuji, 2000. Production, purification and characterization of an extracellular lipase from the yeast, Cryptococcus sp. S-2. Process Biochem., 36: 317-324. Kanchana, R., 2007. Proteases and Lipases from the Marine Protists, Thraustochytrids. Kazlauskas, R.J. and U.T. Bornscheuer, 1998. Biotransformations with lipases. In: H.J. Rehm, G. Pihler, A. Stadler and P.J.W. Kelly (editors). Biotechnology. New York: VCH, 8: 37-192. Kim, H.K., S.Y. Park, J.K. Lee and T.K. Oh, 1998. Gene cloning and characterization of thermostable lipase from Bacillus stearothermophilus L1. Biosci Biotechnol Biochem, 62: 66-71. Klibanov, A.M., 1997. Why are enzymes less active in organic solvents than in water?. Trends Biotechnol, 15: 97-101. Lee, D., Y. Kok, K. Kim, B. Kim, H. Choi, D. Kim, M.T. Suhartono and Y. Pyun, 1999. Isolation and characterization of a thermophilic lipase from Bacillus thermoleovorans ID-1. FEMS Microbiol Lett, 179: 393-400. Lohse, P., C.Z. Soheyla, L. Pia and S. Dietrich, 1997. Human lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase and human gastric lipase: identification of the catalytically active serine, aspartic acid, and histidine residues. Journal of Lipid Research, 38: 892-903. Lonsane, B.K. and M.M. Krishnaiah, 1992. Product leaching and downstream processing. In: H.W. Doelle, D.A. Mitchell & C.E. Rolz (editors). Solid substrate Cultivation. Elsevier Science Publishers. UK, 147-153. Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng Trang 46 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Litthauer, D., A. Ginster and E. Skein, 2002. Pseudomonas luteola lipase: A new member of the 320residue Pseudomonas lipase family. Enzyme Microb. Tech., 30: 209-215. Madhusudhan, M.C., M.C. Lakshmi and K.S.M.S. Raghavarao, 2011. Aqueous Two-Phase Extraction of Enzymes for Food Processing. In: F. Lebovka, N. Vorobiev and E. Chemat (editors). Enhancing Extraction Processes in the Food Industry, CRC Press. Malcata, F.X., H.R. Reyes, H.S. Garcia, C.G. Hill and C.H. Amundson, 1992. Kinetics and mechanisms of reactions catalyzed by immobilized lipases. Enzyme Microb Technol, 14: 426446. Masse, L., K. J. Kennedy and S.P. Chou, 2001. The effect of an enzymatic pretreatment on the hydrolysis and size reduction of fat particles in slaughterhouse wastewater. J Chem Technol Biotechnol, 76: 629-635. Mukherjee, K.D. and M.J. Mills, 1994. Lipases from plants. Lipases. Cambridge University Press, Cambridge, 49. Negi, J.S., P. Singh and B. Rawat, 2011. Chemical constituents and biological importance of swertiaa review. Current Chemical Research, 3: 1-15. Nelson, J.S., 1994. Fishes of the world: New York, John Wiley, 600 p. Pabai, F., S. Kermasha and A. Morin, 1995. Interesterification of butter fat by partially purified extracellular lipases from Pseudomonas putida, Aspergillus niger and Rhizopus oryzae. World J Microbiol Biotechnol, 11: 669-677. Pabai, F., S. Kermasha and A. Morin, 1995. Lipase from Pseudomonas fragi CRDA 323: partial purification, characterization and interesterification of butter fat. Appl Microbiol Biotechnol, 43: 42-51. Pahoja V.M. & Sethar M.A., 2002. A review of enzymatic properties lipase in plants, animals and microorganisms. Pakistan Journal of Applied Sciences 2(4): 474-484. Pencreac’h, G. and J.C. Baratti, 1996. Hydrolysis of p-nitrophenyl palmitate in n-heptane by Pseudomonas cepacia lipase: a simple test for the determination of lipase activity in organic media. Enzyme Microb Technol, 18: 417-422. Rubin, B. and E.A. Dennis (editors), 1997. Lipases: Part A. Biotechnology Methods in enzymology. Inc. New York: Academic Press, 284: 1-408. Rubin, B. and E.A. Dennis (editors), 1997. Lipases: Part B. Enzyme characterization and utilization Methods in enzymology. Inc. New York: Academic Press, 286: 1-563. Ricardo, B.R., R.E. Broughton, E.O. Wiley, K. Carpenter, J.A. López, C. Li, N.I. Holcroft, D. Arcila, M. Sanciangco, J.C. Cureton II, F. Zhang, T. Buser, M.A. Campbell, J.A. Ballesteros, A.R. Varon, S. Willis, W.C. Borden, T. Rowley, P.C. Reneau, D.J. Hough, G. Lu, T. Grande, G. Arratia and G. Ortí, 2013. The Tree of Life and a New Classification of Bony Fishes. PLOS Currents Tree of Life. Senthilkumar, R. and G. Selvakumar, 2008. Isolation and Characterization of an Extracellular Lipase Producing Bacillus sp. SS-1 from Slaughterhouse Soil. Advanced Biotech, 24-25. Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng Trang 47 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Sharma, R., Y. Chisti and U. Chand Banerjee, 2001. Production, purification, characterization, and applications of lipases. Biotechnology Advances, 19: 627-662. Sharon, C., S. Furugoh, T. Yamakido, H.I. Ogawa and Y. Kato, 1998. Purification and characterization of a lipase from Pseudomonas aeruginosa KKA-5 and its role in castor oil hydrolysis. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 20(5): 304-307. Shata, H.A. and M.A.F. Farid, 2012. Optimization of Extraction Parameters for Keratinase Recovery from Fermented Feather under Solid State Fermentation by Streptomyces sp. NRC 13S. Journal of Applied Biological Chemistry, 55(3): 149-156. Sidhu, P., R. Sharma, S.K. Soni and J.K. Gupta, 1998. Production of extracellular alkaline lipase by a new thermophilic Bacillus sp Folia Microbiol, 43: 51-54. Sirisha, E., N. Rajasekar and M. Lakshmi Narasu, 2010. Isolation and Optimization of Lipase Producing Bacteria from Oil Contaminated Soils. Advances in Biological Research, 4(5): 249252. Snellman, E.A., E.R. Sullivan and R.R. Colwell, 2002. Purification and properties of the extracellular lipase, LipA, of Acinetobacter sp. RAG-1. European Journal of Biochemistry, 269(23): 57715779. Takamoto, T., H. Shirasaka, H. Uyama and S. Kobayashi, 2001. Lipase-catalyzed hydrolytic degradation of polyurethane in organic solvent. Chem Lett, 6: 492-493. Tembhurkar, V.R., M.B. Kulkarni and S.A. Peshwe, 2012. Optimization of Lipase Production by Pseudomonas spp. in submerged batch process in shake flask culture. Science Research Reporter, 2(1): 46-50. Teugels, G.G. and J. Daget, 1984. Parachanna nom. nov. for the African snake-heads and rehabilitation of Parachanna insignis (Sauvage, 1884) (Pisces, Channidae): Cybium, 8(4): 1-7. Undurraga, D., A. Markovits and S. Erazo, 2001. Cocoa butter equivalent through enzymic interesterification of palm oil midfraction. Process Biochem, 36: 933-939. Vulfson, E.N., 1994. Industrial applications of lipases. In: P. Woolley and S.B. Peterson (editors). Lipases – their structure, biochemistry and applications. Cambridge: Cambridge Univ. Press, 271-288. Walter, R., J.R. Courtenay and D.W. James, 2004. Snakeheads (Pisces, Channidae) – A Biological Synopsis and Risk Assessment, Wang, Y., K.C. Srivastava, G.J. Shen and H.Y. Wang, 1995. Thermostable alkaline lipase from a newly isolated thermophilic Bacillus strain, A30-1 (ATCC 53841). J Ferment Bioeng, 79: 433438. Wong, D.W.S., 1995. Food Enzymes: Structure and Mechanism. Chapman & Hall. New York. 3784. Wickner, S., M.R. Maurizi and S. Gottesman, 1999. Posttranslational quality control: folding, refolding, and degrading proteins. Sciences, 286: 1888-1893. Winkler, F.K., A. D’arcy and W. Hunziker, 1990. Structure of human pancreatic lipase. Nature, 343: 771-774. Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng Trang 48 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Yeoh, H.H., F.M. Wong and G. Lin, 1986. Screening for fungal lipases using chromogenic lipid substrates. Mycologia, 78: 298-300. Zhu, K., A. Jutila, E.K.J Tuominen, S.A Patkar, A. Svendsen and P.K. Kinnunen, 2001. Impact of the tryptophan residues of Humicola lanuginosa lipase on its thermal stability. J Biochim Biophys Acta, 1547: 329-338. Zygmunt, S.D. and D. Urszula, 1992. The crystal and molecular structure of the Rhizomucor miehei triacylglyceride lipase at 1,9 A resolution. Journal of Molecular Biology, 227(3): 818-839. Internet http://www.1cro.com/campbell/hottopics/hibernation/hibernation.html Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng Trang 49 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 1. Xác định ẩm phương pháp sấy khô đến khối lượng không đổi Nguyên lý: Dùng nhiệt làm bay hết nước sản phẩm, cân khối lượng sản phẩm trước sấy sau sấy, từ tính % ẩm sản phẩm. Tiến hành: Sấy khô cốc nhôm đến khối lượng không đổi cho vào cốc g mẫu đem sấy nhiệt độ 100 ÷ 105°C, thời gian tối thiểu giờ. Mỗi lần đem mẫu cân phải sử dụng bình hút ẩm để tránh cho mẫu bị hút ẩm trở lại. Kết tính theo công thức: X G1  G2 100 (%) G1  G Trong X: % ẩm có 100 g thực phẩm G: Khối lượng cốc không mẫu (g) G1: Khối lượng cốc mẫu trước sấy (g) G2: Khối lượng cốc mẫu sau sấy (g). 2. Phương pháp xác định pH (ISO 2917:1999 (E)) a. Nguyên tắc Giá trị pH xác định thông qua chênh lệch điện điện cực thủy tinh điện cực chuẩn chúng đặt dịch trích mẫu. b. Thiết bị dụng cụ  pH kế có điện cực kèm  Máy xay đồng hóa  Cân phân tích có độ xác 0,01 g  Cốc thủy tinh 150 mL  Bình định mức 1000 mL  Ống đong. c. Hóa chất  Dung dịch pH chuẩn 4,00, 7,00 9,00 Đức sản xuất  Potassium chloride (KCl), PA  Dietyl ether (C2H5OC2H5), PA Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng Trang vii Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ  Ethanol (C2H5OH), PA  Nước cất hai lần. d. Pha chế hóa chất  Dung dịch potassium chloride 0,1 M: Cân 7,5 g muối potassium chloride (KCl) hòa tan 800 mL nước cất, định mức đến 1000 mL.  Dung dịch rửa điện cực: + Dung dịch diethyl ether bão hòa nước: thêm từ từ nước cất vào diethyl ether nước hòa tan vào diethyl ether nữa. + Dung dịch etanol 95%: hòa tan mL nước cất hai lần vào 95 mL ethanol. d. Tiến hành  Chuẩn bị mẫu Đồng hóa mẫu máy xay thịt, nhiệt độ mẫu không vượt 30C. Xác định pH sau mẫu đồng hóa. Nếu mẫu không phân tích phải cho mẫu vào túi PE, đóng kín miệng túi lưu mẫu ÷ 8C. Thời gian lưu trữ mẫu không 24 giờ. Cân 10 g mẫu đồng hóa vào cốc thủy tinh 150 mL, cho vào 100 mL potassium chloride 0,1 M. Đồng mẫu máy xay.  Hiệu chuẩn máy đo pH Lần lượt hiệu chuẩn thiết bị dung dịch pH chuẩn cho pH mẫu cần xác định phải nằm khoảng dung dịch pH chuẩn. Sau lần hiệu chuẩn, rửa đầu dò nước cất loại bỏ nước cất điện cực giấy mềm trước hiệu chuẩn dung dịch pH chuẩn tiếp theo. Rửa điện cực đầu dò, tiến hành đo mẫu.  Xác định pH Đặt cốc thủy tinh 150 mL chứa mẫu đồng lên máy khuấy từ. Đưa điện cực pH vào cốc. Điều chỉnh nhiệt độ pH kế nhiệt độ dịch trích. Nếu pH kế hệ thống hiệu chỉnh nhiệt độ nhiệt độ dịch trích phải nằm khoảng 28 ± 2C. Sau chờ giá trị số đo pH kế ổn định, đọc trực tiếp giá trị xác đến 0,01. e. Vệ sinh điện cực máy đo pH Lau điện cực vải mềm thấm dung dịch diethyl ether bão hòa, sau lau lại giấy mềm thấm ethanol. Cuối rửa lại nước cất, bảo quản theo hướng dẫn nhà sản xuất. Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng Trang viii Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ f. Báo cáo kết Kết báo cáo kết trung bình hai lần đo song song. Sự chênh lệch tuyệt đối hai kết thử nghiệm đơn độc lập, loại mẫu, loại máy móc thiết bị, khoảng thời gian ngắn không vượt 0,04 đơn vị pH. 3. Xác định đạm tổng số phương pháp Kjedahl 3.1 Nguyên tắc Nitơ có thành phần hợp chất hữu cơ, tác dụng H2SO4 đậm đặc với diện chất xúc tác thích hợp tất chất hữu bị oxy hoá, NH3 giải phóng liên kết với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4. Dùng kiềm mạnh (NaOH, MgO) để đẩy NH3 từ muối (NH4)2SO4 hình thành thể tự do. Định lượng NH3 dung dịch acid có nồng độ xác định. Các hợp chất hữu + H2SO4 (đậm đặc)  (NH4)2SO4 3.2 Tiến hành  Đốt đạm (vô hoá)  Cân xác g mẫu cho vào bình Kjedahl cho tiếp vào g chất xúc tác, 10 mL H2SO4 đậm đặc, để nghiêng bình Kjedahl bếp đun từ từ đến thu dung dịch suốt không màu có màu xanh lơ CuSO4 để nguội. 3.3 Cất đạm Sau vô hoá mẫu hoàn toàn, cho nước cất vào bình Kjedahl để tráng cho vào bình định mức 100 mL, tráng rửa bình Kjedahl vài lần cho tiếp vào bình định mức. Đưa nước bình định mức lên đến 100 mL. Dùng pipet hút 10 mL mẫu cho vào bình cầu hệ thống kéo đạm cho tiếp 10 ÷ 15 mL NaOH 40% vào. Sau gia nhiệt để cất kéo nước hứng NH thoát ra, ngưng tụ bình tam giác 100 mL có chứa sẵn 20 mL dung dịch acid boric 20 g/L thu 100 mL dung dịch. Định lượng dung dịch hứng H2SO4 0,1N. Tính kết quả: Hàm lượng nitơ tổng số = 0,0014 .V .10  100% m Trong V: thể tích H2SO4 0,1N (mL) m: khối lượng nguyên liệu vô vơ hoá (g) 10: hệ số pha loãng 0,0014: số gam nitơ tương ứng với mL H2SO4 0,1N Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng Trang ix Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Hàm lượng protein tổng số: % protein tổng số = % nitơ tổng số  H Với H: hệ số protein. Đối với thực phẩm có nguồn gốc động vật H = 6,25. 4. Xác định lipid tổng số (phương pháp Soxhlet) a. Nguyên lý Dùng dung môi nóng để hòa tan tất chất béo tự thực phẩm. Sau bay hết dung môi, cân chất béo lại tính hàm lượng lipid có 100 g thực phẩm. b. Tiến hành Cân xác g mẫu sấy ẩm giờ, nghiền nhỏ đồng đều, gói lại giấy lọc gòn, cột mẫu sấy ẩm giờ. m1 = mmẫu m2 = m giấy + m gòn + mchỉ m3 = m1 + m Cho mẫu vào ống chiết (Soxhlet). Sau cho dung môi vào khoảng 2/3 bình cầu, cho nước lạnh chảy qua ống sinh hàn. Đun sôi cách thủy đến chất béo cất hết. Thời gian khoảng ÷ 12 (trong dung môi tràn từ ống chiết bình chứa không 5, lần không nhiều 8, 10 lần). Khi nghỉ chạy máy cần giữ gói giấy ngập eter dầu hỏa. Thử xem trích ly hết chất béo chưa cách lấy đũa thủy tinh lấy giọt dầu từ hệ thống Soxhlet thử mặt đĩa petri, không thấy có vết loang coi trình trích ly hoàn toàn. Sau trình cất béo kết thúc, lấy dụng cụ đựng mẫu đem sấy nhiệt độ 105 °C đến khối lượng không đổi. Để nguội bình hút ẩm 30 phút cân khối lượng. Tính toán kết quả: mbéo = m3 – m4 %béo (c.b.k) = mbéo 100 m1 %béo (c.b.ư) = mbéo 100 m1  mam 5. Xác định hoạt tính lipase Hoạt tính enzyme lipase xác định theo phương pháp Tembhurkar et al., (2012). Cơ chất nhũ tương dầu olive (10%) 2% gum arabic. Hỗn hợp phản ứng gồm mL nhũ tương dầu, 1,6 mL dung dịch đệm Tris-HCl (0,1 M, pH = 7,2), 0,4 mL enzyme lipase. Trong bình đối chứng (mẫu trắng), thay lipase nước. Để Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng Trang x Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ yên cho phản ứng xảy nhiệt độ 30 C. Sau 30 phút, thêm mL acetone để dừng phản ứng. Tiến hành chuẩn độ với dung dịch NaOH chuẩn 0,05 N, với phenolphtalein chất thị. Đến dung dịch phản ứng chuyển sang màu hồng bền (pH = 10,5) (Jensen, 1983) ngừng chuẩn độ. Đọc thể tích NaOH (mL) sử dụng. Lượng NaOH cần thiết để chuẩn độ giải phóng = Lượng NaOH cần thiết để chuẩn độ mẫu thử nghiệm – Lượng NaOH cần thiết để chuẩn độ mẫu trắng Phương trình chuẩn độ (Bettelheim Landesberg, 2000): N1 V1 = N V2 Với: N1: Nồng độ acid béo giải phóng (10-3 µM) V1: Thể tích hỗn hợp phản ứng (mL) N2: Nồng độ dung dịch NaOH 0,05 N dùng để chuẩn độ (N) V2: Thể tích dung dịch NaOH cần thiết dùng để chuẩn độ N1 = N V2 / V Một đơn vị hoạt tính enzyme lipase định nghĩa lượng lipase cần thiết để giải phóng µM acid béo phút điều kiện thí nghiệm. Đơn vị enzyme (µM/phút) = Nồng độ acid béo giải phóng (µM) / Thời gian ủ (phút) 6. Cách pha nhũ tương dầu Cho khoảng 100 mL nước nóng (khoảng 70 – 80C) vào 10 g gum arabic, khuấy đến gum tan hoàn toàn. Định lượng dung dịch đến 200 mL. Hút xác 20 mL dầu olive cho vào 180 mL dung dịch gum vừa pha. Cho hỗn hợp vào máy xay, cho máy vận hành phút, tắt máy giữ lạnh phút 4C (tiến hành lần) nhận thể nhũ tương. Thể nhũ tương sử dụng không bị phân thành pha giữ lạnh bảo quản 4C. 7. Cách pha dung dịch đệm 7.1 Dung dịch đệm Glycine – HCl (pH = 2,2 – 3,6) - Dung dịch glycine 0,2 M (a): Cân 15,01 g glycine, hòa tan định mức đến 1000 mL nước cất. - Dung dịch HCl 0,2 M (b): Cân 16,8 mL HCl đặc (37%) pha thành 1000 mL. Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng Trang xi Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Dung dịch đệm Glycine có pH khác lấy 50 mL dung dịch (a) X mL dung dịch (b) định mức đến 200 mL. X pH X pH 5,0 3,6 16,8 2,8 6,4 3,4 24,2 2,6 8,2 3,2 32,4 2,4 11,4 3,0 44,0 2,2 7.2 Dung dịch đệm phosphate (pH = 5,7 – 8,0) - Dung dịch mononatri orthophosphate 0,2 M (a): Cân 27,8 g NaH2PO4, hòa tan định mức đến 1000 mL. - Dung dịch dinatri hydrophosphate 0,2 M (b): Cân 53,05 g Na2HPO4.7H2O, 71,7 g Na2HPO4.12H2O hòa tan định mức đến 1000 mL. Dung dịch đệm phosphate có pH khác phụ thuộc vào số mL dung dịch (a) số mL dung dịch (b) định mức đến 200 mL. a B pH a b pH 93,5 6,5 5,6 45,0 55,0 6,9 92,0 8,0 5,8 39,0 61,0 7,0 90,0 10,0 5,9 33,0 67,0 7,1 87,7 12,3 6,0 28,0 72,0 7,2 85,0 15,0 6,1 23,0 77,0 7,3 81,5 18,5 6,2 19,0 81,0 7,4 77,5 22,5 6,3 16,0 84,0 7,5 73,5 26,5 6,4 13,0 87,0 7,6 68,5 31,5 6,5 10,5 89,5 7,7 62,5 37,5 6,6 8,5 91,5 7,8 56,5 43,5 6,7 7,0 93,0 7,9 51,0 49,0 6,8 5,3 94,7 8,0 7.3 Dung dịch đệm Glycine – NaOH (pH = 8,6 – 10,6) - Dung dịch glycine 0,2 M (a): Cân 15,01 g glycine, hòa tan định mức đến 1000 mL. - Dung dịch NaOH 0,2 M (b): Cân g NaOH hòa tan định mức đến 1000 mL. Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng Trang xii Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Dung dịch đệm Glycine có pH khác lấy 50 mL dung dịch (a) X (ml) dung dịch (b) định mức đến 200 mL. X pH X pH 4,0 8,6 22,4 9,6 6,0 8,8 72,2 9,8 8,8 9,0 32,0 10,0 12,0 9,2 38,6 10,4 16,8 9,4 45,5 10,6 Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng Trang xiii Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC KẾT QUẢ THỐNG KÊ 1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu nước cất đến hoạt tính enzyme lipase trích ly từ nội tạng cá lóc One-Way ANOVA - Hoat tinh enzyme lipase by Ti le nguyen lieu va nuoc cat Dependent variable: Hoat tinh enzyme lipase (U/g) Factor: Ty le nguyen lieu va nuoc cat Number of observations: 18 Number of levels: ANOVA Table for Hoat tinh enzyme lipase by Ty le nguyen lieu va nuoc cat Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2.12573 0.425147 25.12 0.0000 Within groups 0.203067 12 0.0169222 Total (Corr.) 2.3288 17 Table of Means for Hoat tinh enzyme lipase by Ty le nguyen lieu va nuoc cat with 95.0 percent LSD intervals Stnd. error Level Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit 1:1 0.516667 0.0751049 0.400956 0.632377 1:2 1.07 0.0751049 0.954289 1.18571 1:3 1.28333 0.0751049 1.16762 1.39904 1:4 1.47667 0.0751049 1.36096 1.59238 1:5 1.46 0.0751049 1.34429 1.57571 1:6 1.47333 0.0751049 1.35762 1.58904 Total 18 1.21333 Multiple Range Tests for Hoat tinh enzyme lipase by Ty le nguyen lieu va nuoc cat Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups X 1:1 0.516667 X 1:2 1.07 XX 1:3 1.28333 X 1:5 1.46 X 1:6 1.47333 X 1:4 1.47667 Contrast Sig. Difference +/- Limits 1:1 - 1:2 * -0.553333 0.231422 1:1 - 1:3 * -0.766667 0.231422 1:1 - 1:4 * -0.96 0.231422 1:1 - 1:5 * -0.943333 0.231422 1:1 - 1:6 * -0.956667 0.231422 1:2 - 1:3 -0.213333 0.231422 1:2 - 1:4 * -0.406667 0.231422 1:2 - 1:5 * -0.39 0.231422 1:2 - 1:6 * -0.403333 0.231422 1:3 - 1:4 -0.193333 0.231422 1:3 - 1:5 -0.176667 0.231422 1:3 - 1:6 -0.19 0.231422 1:4 - 1:5 0.0166667 0.231422 1:4 - 1:6 0.00333333 0.231422 1:5 - 1:6 -0.0133333 0.231422 * denotes a statistically significant difference. 2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng loại dung môi trích ly pH đến hoạt tính enzyme lipase trích ly từ nội tạng cá lóc One-Way ANOVA - Hoat tinh enzyme lipase by pH Dependent variable: Hoat tinh enzyme lipase (U/g) Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng Trang xiv Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Factor: pH Number of observations: 27 Number of levels: ANOVA Table for Hoat tinh enzyme lipase by pH Source Sum of Squares Df Mean Square Between groups 18.0283 2.25353 Within groups 0.6762 18 0.0375667 Total (Corr.) 18.7045 26 F-Ratio 59.99 P-Value 0.0000 Table of Means for Hoat tinh enzyme lipase by pH with 95.0 percent LSD intervals Stnd. error pH Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit 10 2.34 0.111903 2.17376 2.50624 3 1.96 0.111903 1.79376 2.12624 1.97333 0.111903 1.80709 2.13957 2.30667 0.111903 2.14043 2.47291 4.28333 0.111903 4.11709 4.44957 3.52 0.111903 3.35376 3.68624 2.19 0.111903 2.02376 2.35624 2.51 0.111903 2.34376 2.67624 DC 1.47 0.111903 1.30376 1.63624 Total 27 2.50593 Multiple Range Tests for Hoat tinh enzyme lipase by pH Method: 95.0 percent LSD pH Count Mean Homogeneous Groups X DC 1.47 X 3 1.96 X 1.97333 XX 2.19 X 2.30667 X 10 2.34 X 2.51 X 3.52 X 4.28333 Contrast 10 - 10 - 10 - 10 - 10 - 10 - 10 - 10 - DC 3-4 3-5 3-6 3-7 3-8 3-9 - DC 4-5 4-6 4-7 4-8 4-9 - DC 5-6 5-7 5-8 Sig. * * * * * * * * * * * * * * * * * Difference 0.38 0.366667 0.0333333 -1.94333 -1.18 0.15 -0.17 0.87 -0.0133333 -0.346667 -2.32333 -1.56 -0.23 -0.55 0.49 -0.333333 -2.31 -1.54667 -0.216667 -0.536667 0.503333 -1.97667 -1.21333 0.116667 +/- Limits 0.332481 0.332481 0.332481 0.332481 0.332481 0.332481 0.332481 0.332481 0.332481 0.332481 0.332481 0.332481 0.332481 0.332481 0.332481 0.332481 0.332481 0.332481 0.332481 0.332481 0.332481 0.332481 0.332481 0.332481 Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng Trang xv Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ 5-9 -0.203333 0.332481 - DC * 0.836667 0.332481 6-7 * 0.763333 0.332481 6-8 * 2.09333 0.332481 6-9 * 1.77333 0.332481 - DC * 2.81333 0.332481 7-8 * 1.33 0.332481 7-9 * 1.01 0.332481 - DC * 2.05 0.332481 8-9 -0.32 0.332481 - DC * 0.72 0.332481 - DC * 1.04 0.332481 * denotes a statistically significant difference. 3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng thời gian trích ly đến hoạt tính enzyme lipase trích ly từ nội tạng cá lóc One-Way ANOVA - Hoat tinh enzyme lipase by Thoi gian Dependent variable: Hoat tinh enzyme lipase (U/g) Factor: Thoi gian Number of observations: 21 Number of levels: ANOVA Table for Hoat tinh enzyme lipase by Thoi gian Source Sum of Squares Df Mean Square Between groups 0.757095 0.126183 Within groups 0.0732 14 0.00522857 Total (Corr.) 0.830295 20 F-Ratio 24.13 P-Value 0.0000 Table of Means for Hoat tinh enzyme lipase by Thoi gian with 95.0 percent LSD intervals Stnd. error Thoi gian Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit 3.79667 0.0417475 3.73335 3.85998 1.5 4.02667 0.0417475 3.96335 4.08998 4.09333 0.0417475 4.03002 4.15665 2.5 4.28667 0.0417475 4.22335 4.34998 3 4.38667 0.0417475 4.32335 4.44998 3.5 3.95333 0.0417475 3.89002 4.01665 3.95 0.0417475 3.88669 4.01331 Total 21 4.07048 Multiple Range Tests for Hoat tinh enzyme lipase by Thoi gian Method: 95.0 percent LSD Thoi gian Count Mean Homogeneous Groups X 3.79667 X 3.95 X 3.5 3.95333 XX 1.5 4.02667 X 4.09333 X 2.5 4.28667 X 3 4.38667 Contrast - 1.5 1-2 - 2.5 1-3 - 3.5 1-4 1.5 - 1.5 - 2.5 1.5 - 1.5 - 3.5 Sig. * * * * * * * * Difference -0.23 -0.296667 -0.49 -0.59 -0.156667 -0.153333 -0.0666667 -0.26 -0.36 0.0733333 +/- Limits 0.126628 0.126628 0.126628 0.126628 0.126628 0.126628 0.126628 0.126628 0.126628 0.126628 Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng Trang xvi Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ 1.5 - 0.0766667 0.126628 - 2.5 * -0.193333 0.126628 2-3 * -0.293333 0.126628 - 3.5 * 0.14 0.126628 2-4 * 0.143333 0.126628 2.5 - -0.1 0.126628 2.5 - 3.5 * 0.333333 0.126628 2.5 - * 0.336667 0.126628 - 3.5 * 0.433333 0.126628 3-4 * 0.436667 0.126628 3.5 - 0.00333333 0.126628 * denotes a statistically significant difference. 4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ trích ly đến hoạt tính enzyme lipase trích ly từ nội tạng cá lóc One-Way ANOVA - Hoat tinh enzyme lipase by Nhiet Dependent variable: Hoat tinh enzyme lipase (U/g) Factor: Nhiet Number of observations: 18 Number of levels: ANOVA Table for Hoat tinh enzyme lipase by Nhiet Source Sum of Squares Df Mean Square Between groups 11.1676 2.23351 Within groups 0.147133 12 0.0122611 Total (Corr.) 11.3147 17 F-Ratio 182.16 P-Value 0.0000 Table of Means for Hoat tinh enzyme lipase by Nhiet with 95.0 percent LSD intervals Stnd. error Nhiet Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit 20 3.85 0.0639299 3.75151 3.94849 30 4.38333 0.0639299 4.28484 4.48183 40 5.36333 0.0639299 5.26484 5.46183 50 5.94 0.0639299 5.84151 6.03849 60 5.88 0.0639299 5.78151 5.97849 70 4.52 0.0639299 4.42151 4.61849 Total 18 4.98944 Multiple Range Tests for Hoat tinh enzyme lipase by Nhiet Method: 95.0 percent LSD Nhiet Count Mean Homogeneous Groups X 20 3.85 X 30 4.38333 X 70 4.52 X 40 5.36333 X 60 5.88 X 50 5.94 Contrast 20 - 30 20 - 40 20 - 50 20 - 60 20 - 70 30 - 40 30 - 50 30 - 60 30 - 70 40 - 50 40 - 60 40 - 70 50 - 60 Sig. * * * * * * * * * * * Difference -0.533333 -1.51333 -2.09 -2.03 -0.67 -0.98 -1.55667 -1.49667 -0.136667 -0.576667 -0.516667 0.843333 0.06 +/- Limits 0.196988 0.196988 0.196988 0.196988 0.196988 0.196988 0.196988 0.196988 0.196988 0.196988 0.196988 0.196988 0.196988 Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng Trang xvii Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ 50 - 70 * 1.42 0.196988 60 - 70 * 1.36 0.196988 * denotes a statistically significant difference. Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng Trang xviii [...]... trong nghiên cứu này, Trần Thị Bé Lan và cộng sự (2012) đã kết luận rằng cả hai enzyme đều bị ảnh hưởng bởi các ion Ca2+, Mg2+ và Al3+ Phạm Thị Hồng Nga (2008) đã nghiên cứu về trích ly lipase từ nội tạng cá tra Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng quy trình trích ly tiến hành ở nhiệt độ 30C, thời gian trích ly là 2,5 giờ, pH dung môi trích ly (dung dịch Na2CO3) là 9, tỷ lệ nội tạng và dung môi trích ly là... được lipase từ P aeruginosa MB5001 Enzyme tinh chế có khối lượng phân tử 29 kDa, hoạt tính enzyme thể hiện cao nhất ở nhiệt độ 55C và pH = 8,0 Từ các nghiên cứu thực tế trong và ngoài nước ở lĩnh vực trích ly và ứng dụng lipase từ nguồn động vật, một số vấn đề cơ bản cần quan tâm là: - Sự ổn định của nguồn nguyên liệu cung cấp lipase Các điều kiện trích ly enzyme phụ thuộc rất lớn vào đặc điểm từng... ứng sẽ tạo đủ bề mặt tiếp xúc cần thiết (Sharma et al., 2001) 2.2.7 Các nguồn thu nhận Lipase có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau, điển hình như lipase từ thực vật, lipase từ động vật và lipase từ vi sinh vật, đặc biệt là từ vi khuẩn và nấm Đã có một vài lipase thu nhận từ vi sinh vật có giá trị thương mại 2.2.7.1 Lipase từ vi sinh vật Đây là nguồn enzyme được quan tâm và sản xuất nhiều nhất... mục tiêu nghiên cứu đã được đặt ra, đề tài tiến hành các nội dung nghiên cứu chủ yếu sau:  Xác định tỷ lệ nguyên liệu và dung môi (nước cất) sử dụng thích hợp cho quá trình trích ly đến hiệu quả thu nhận lipase  Ảnh hưởng của loại dung dịch đệm và pH sử dụng đến độ ổn định của lipase thu nhận  Sự thay đổi hoạt tính lipase thu nhận do tác động tương tác của nhiệt độ và thời gian trích ly Ngành Công... (Baba et al., 1991) Nguồn lipase từ động vật quan trọng nhất là từ tụy tạng của bò, cừu và lợn Lipase từ tụy tạng lợn là một trong những lipase được biết đến sớm nhất và khá thông dụng Hạn chế của lipase từ tụy tạng là chúng chứa những hợp chất có mùi và vị khó chịu như trypsine, tạo vị đắng nên không được ưa chuộng Bên cạnh đó, nguồn lipase này còn có khả năng lây truyền virus từ động vật sang người... 2.1.1 Cá lóc Cá lóc hay còn gọi là cá quả, cá chuối, cá sộp, cá xộp, cá tràu, cá đô tùy theo từng vùng, là loài cá thuộc họ Channidae Họ này có hai chi là Channa có 26 loài ở châu Á, và Parachanna (Teugels và Daget, 1984) có 3 loài ở châu Phi Ở Việt Nam chủ yếu là Channa maculata (có tài liệu gọi là Ophiocephalus maculatus/ Bostrychus maculatus) và Channa argus (hay còn gọi là Ophiocephalus argus, tức cá. .. Điều này kéo theo tỷ lệ phụ phẩm từ cá lóc gia tăng Chính vì vậy, việc nghiên cứu tận dụng nguồn phụ phẩm này trong chế biến các chế phẩm sinh học, thực phẩm chức năng có ý nghĩa rất quan trọng Nội tạng cá lóc cũng như các loài cá là nguồn nguyên liệu thuận tiện cho vi sinh vật phát triển, nhưng cũng là nguồn cung cấp nhiều enzyme quan trọng, điển hình là protease, lipase và cellulase (Trần Quốc Hiền... dụng nội tạng cá lóc trong ly trích enzyme là hướng tích cực giúp tăng giá trị kinh tế của nguồn nguyên liệu này và giúp hạn chế chất thải vào môi trường 2.2 TỔNG QUAN VỀ ENZYME LIPASE 2.1.1 Giới thiệu Lipase (glycerol ester hydrolase hay triacylglycerol acylhydrolase – EC 3.1.1.3), thuộc nhóm phụ enzyme thủy phân có Serine của họ enzyme thủy phân α/β, xúc tác thủy phân các nối ester của triacylglycerol... 2010) 2.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN Lipase là enzyme được ứng dụng trong nhiều ngành như công nghiệp thực phẩm, công nghiệp hóa học, mỹ phẩm, da,… Các nghiên cứu về tính chất và hoạt động của lipase đã và đang được nhận được sự quan tâm của các nhà khoa học trong và ngoài nước Trần Thị Bé Lan và cộng sự (2012) đã nghiên cứu những điều kiện tối ưu của hai chế phẩm enzyme lipase từ Candida rugosa... tổng hợp lại glyceride từ acid béo tự do và glycerol (theo chiều nghịch) Các phản ứng này xảy ra tại bề mặt phân cách giữa cơ chất và pha nước nên gây khó khăn cho việc phân tích động học và khảo sát hoạt tính của lipase Lipase thủy phân triacylglycerols (TAG) theo từng bậc, tạo ra diacylglycerols (DAG), monoacylglycerols (MAG) và acid béo (FA), rồi cuối cùng thủy phân hoàn toàn tạo ra glycerol và acid . thiệu 5 2. 1 .2 Đặc điểm cấu trúc của lipase 6 2. 2.3 Cơ chế phản ứng 9 2. 2.4 Tính đặc hiệu của enzyme lipase 11 2. 2.5 Phân loại enzyme lipase 11 2. 2 .6 Một số tính chất của lipase 12 2. 2.7 Các. hoạt tính enzyme lipase 20 2. 2. 12 Ứng dụng 21 2. 3 QUÁ TRÌNH TRÍCH LY LIPASE TỪ NỘI TẠNG 23 2. 3.1 Định nghĩa 23 2. 3 .2 Cơ sở lý thuyết của quá trình trích ly enzyme 24 2. 3.3 Các yếu tố ảnh hưởng. trong thí nghiệm 27 3 .2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 3 .2. 1 Phương pháp chuẩn bị mẫu 28 3 .2. 2 Phương pháp phân tích và đo đạc kết quả 28 3 .2. 3 Phương pháp thu thập và xử lý kết quả 29 Luận văn tốt