Nội tạng cá lóc được lấy từ chợ tại Thành phố Cần Thơ vào các buổi sáng sớm, bao gói bằng bao bì PE và bảo quản trong thùng xốp ở nhiệt độ từ 0 ÷ 4oC bằng nước đá, sau đó đem về phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Cần Thơ. Thời gian vận chuyển nguyên liệu không quá 30 phút.
Nguyên liệu sau khi vận chuyển về đến phòng thí nghiệm tiến hành xử lí sơ bộ, bỏ mang và mỡ rồi tiến hành cấp đông. Khối lượng mỗi mẫu tiền xử lý là 1.000 g. Mẫu sau khi được cấp đông sau 24 giờ được xay nhuyễn và tái đông nhanh đến khi nhiệt độ tâm đạt -18C.
a. Trước xử lý b. Sau xử lý
Hình 3.1: Nguyên liệu trước và sau xử lý 3.2.2 Phương pháp phân tích và đo đạc kết quả
Các chỉ tiêu theo dõi trong khảo sát được tổng hợp trong bảng 3.1.
Bảng 3.1: Phương pháp phân tích các chỉ tiêu
Thành phần Phương pháp
pH Sử dụng pH kế, theo ISO 2917:1999 (E)
Độ ẩm Xác định bằng phương pháp NMKL số 23-1991
Đạm tổng số(*) Xác định bằng phương pháp Kjedahl, TCVN 4328-1:2007 Lipid tổng số(*) Xác định bằng phương pháp Soxhlet, TCVN 4331:2001
3.2.3 Phương pháp thu thập và xử lý kết quả
Thí nghiệm được tiến hành trên cơ sở thay đổi một nhân tố và cố định các nhân tố còn lại. Kết quả của thí nghiệm trước được sử dụng làm thông số cố định cho thí nghiệm kế tiếp. Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại.
Số liệu được thu thập và xử lý bằng phần mềm thống kê Statgraphics Centrution 15.2, Copyright (C) PP, USA và phần mềm Excel. Phân tích phương sai (ANOVA) và kiểm định LSD để kết luận về sự sai khác giữa trung bình các nghiệm thức.
3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Nội tạng cá lóc
Xử lý sơ bộ, cấp đông
Xay nhỏ, cân khối lượng
Trích ly
Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu và nước cất đến hoạt tính lipase trích ly từ nội tạng cá lóc
Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng giá trị pH dung môi trích ly đến hoạt tính lipase trích ly từ nội tạng cá lóc
Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hoạt tính lipase trích ly từ nội tạng cá lóc
Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hoạt tính lipase trích ly từ nội tạng cá lóc
Tự phân Lọc
Xác định hoạt tính enzyme lipase
Hình 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát * Thuyết minh quy trình
Nội tạng cá lóc được lấy từ chợ, sau khi đem về phòng thí nghiệm, tiến hành xử lý sơ bộ. Nội tạng được rửa sạch, nhằm loại bỏ bớt máu, hạn chế sự phát triển của vi sinh vật gây thối. Nước rửa phải sạch và được giữ ở nhiệt độ thấp nhằm tránh các biến đổi sinh hóa trong nguyên liệu, sự phát triển của vi sinh vật. Trong quá trình rửa, đồng thời loại bỏ mang và mỡ. Sau đó nguyên liệu được chứa đựng trong các túi PE chuẩn bị cho quá trình lạnh đông.
Nội tạng cá lóc sau quá trình rửa và xử lý được lạnh đông chậm trong tủ đông (nhiệt độ từ -5 ÷ -15C, tùy điều kiện thực tế). Lạnh đông nguyên liệu nhằm giúp cho quá trình xay cắt được dễ dàng và hạn chế các biến đổi xảy ra. Đồng thời, quá trình lạnh đông nguyên liệu còn giúp bảo quản và chủ động nguồn nguyên liệu trong quá trình tiến hành thí nghiệm, tạo điều kiện cho quá trình thí nghiệm được thuận lợi và liên tục (Nguyễn Văn Mười, 2006).
- Xay nhỏ và cân khối lượng
Quá trình xay nhỏ nguyên liệu nhằm phá vỡ cấu trúc tế bào, giúp enzyme được trích ly ra ngoài một cách dễ dàng. Quá trình xay nhỏ còn góp phần làm nguyên liệu sau xay được đồng nhất.
Cân khối lượng nhằm đồng nhất khối lượng mẫu ban đầu, thuận tiện cho việc tính toán.
- Ngâm trích và tự phân
Phối trộn nguyên liệu đã xay với dung môi (nước cất hoặc các loại dung dịch đệm). Trong quá trình này, enzyme trong nội tạng sẽ hòa tan và khuếch tán vào dung môi. Ủ mẫu trong một khoảng thời gian xác định để giúp lipase từ trong nội bào được giải phóng qua bề mặt liên pha, vào dịch trích.
- Lọc: Sau quá trình tự phân, tiến hành lọc dịch trích bằng vải lọc. Quá trình lọc nhằm loại bỏ tạp chất không tan trong dịch trích, làm cho xác định hoạt tính enzyme được dễ dàng hơn.
- Xác định hoạt tính enzyme
Sau khi thu được dịch lọc, tiến hành xác định hoạt tính enzyme (Phụ lục 1). Mục đích của xác định hoạt tính enzyme là tìm ra những điều kiện tối ưu (tỷ lệ nguyên liệu và dung môi, giá trị pH dung môi, thời gian và nhiệt độ trích ly) của quá trình trích ly nhằm thu được enzyme lipase có hoạt tính cao nhất.
3.3.2 Phân tích thành phần cơ bản của nguyên liệu
Mục đích: Xác định các thành phần hóa lý cơ bản có trong nội tạng cá lóc, làm cơ sở cho việc tiến hành các thí nghiệm tiếp theo sau.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành ngẫu nhiên với các nguồn nguyên liệu được thu mua ở từng thời điểm. Thí nghiệm được thực hiện 3 lần lặp lại ứng với một chỉ tiêu khảo sát.
Cách tiến hành:
- Đối với phần nội tạng, tiến hành rửa rạch, cắt bỏ mang và loại bỏ mỡ bám trên thành ruột, để ráo và phân tích các thành phần có trong nguyên liệu ban đầu.
- Các thao tác trong quá trình xử lý và phân tích phải tiến hành thật nhanh để tránh các biến đổi xảy ra làm thay đổi thành phần hóa học, gây ảnh hưởng đến kết quả trong quá trình thí nghiệm. Quá trình phân tích được thực hiện 3 lần lặp lại ứng với một chỉ tiêu khảo sát.
Chỉ tiêu đánh giá: Độ ẩm, giá trị pH, lipid tổng số và đạm tổng số ban đầu.
Kết quả thu nhận: Xác định các thành phần hóa học cơ bản có trong nguyên liệu nội tạng cá ban đầu làm cơ sở cho các thí nghiệm kế tiếp.
3.3.3 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu và nước cất đến hoạt tính enzyme lipase được trích ly từ nội tạng cá lóc hoạt tính enzyme lipase được trích ly từ nội tạng cá lóc
Mục đích: Xác định tỷ lệ nguyên liệu và nước cất thích hợp để thu được enzyme lipase có hoạt tính cao nhất.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với một nhân tố và 3 lần lặp lại. Nhân tố A: Tỷ lệ nguyên liệu và nước cất (w/v), thay đổi ở các mức độ
A1: 1: 1 A2: 1: 2 A3: 1: 3 A4: 1: 4 A5: 1: 5 A6: 1: 6 Tổng số nghiệm thức: 6
Số mẫu thí nghiệm: 6 x 3 = 18 mẫu
Khối lượng mẫu thí nghiệm: 50 g/mẫu x 18 = 900 g * Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 3.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1
Tiến hành thí nghiệm: Nội tạng cá lóc đông lạnh đã được xay nhuyễn (theo mục 3.2.1), được trích ly bằng nước cất ở các tỷ lệ khác nhau như đã được bố trí. Tiến hành thực hiện thí nghiệm trích ly lipase ở nhiệt độ phòng (30 2oC) và thời gian trích ly 2,5 giờ (Phạm Thị Hồng Nga, 2008). Sau đó, lọc dịch trích bằng vải lọc. Xác định thể tích và hoạt tính dịch trích thu được.
Chỉ tiêu theo dõi: Hoạt tính enzyme lipase (U/g nội tạng cá lóc, tính theo căn bản khô).
Kết quả thu nhận: Tỷ lệ nguyên liệu và nước cất (w/v) thích hợp để thu được enzyme lipase có hoạt tính cao nhất.
3.3.4 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi trích ly và pH đến hoạt tính enzyme lipase được trích ly từ nội tạng cá lóc hoạt tính enzyme lipase được trích ly từ nội tạng cá lóc
Mục đích: Xác định khoảng pH thích hợp (điều chỉnh bằng các dung dịch đệm khác nhau) để thu được lipase từ nội tạng cá lóc có hoạt tính cao nhất.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với một nhân tố và 3 lần lặp lại Nhân tố B: pH dung môi, thay đổi ở các mức độ
B1: pH = 3,0 B2: pH = 4,0 B3: pH = 5,0 B4: pH = 6,0 B5: pH = 7,0 B6: pH = 8,0
B7: pH = 9,0 B8: pH = 10,0 B0: Đối chứng (nước cất) Tổng số nghiệm thức: 8 + 1 mẫu đối chứng (trích ly bằng nước cất)
A1 A2 A3 A4 A5 A6
Trích ly Nguyên liệu
Dung môi
Lọc
Số mẫu thí nghiệm: 9 x 3 = 27 mẫu
Khối lượng mẫu thí nghiệm: 50 g/mẫu x 27 = 1.350 g * Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 3.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2
Tiến hành thí nghiệm: Sau khi xác định được tỷ lệ nguyên liệu và nước cất thích hợp, tiến hành thí nghiệm 2 tương tự như thí nghiệm 1. Tiến hành trích ly enzyme lipase từ nội tạng cá lóc bằng các dung dịch đệm khác nhau ở các pH khác nhau (từ pH = 3,0 đến pH = 10,0 ; trong đó pH 3 và 4 sử dụng đệm glycine – HCl ; pH từ 5 đến 8 sử dụng đệm phosphate và pH 9, 10 sử dụng đệm glycine NaOH). Tiến hành thực hiện thí nghiệm trích ly lipase ở nhiệt độ phòng (30 2oC) và thời gian trích ly 2,5 giờ.
Chỉ tiêu theo dõi: Hoạt tính enzyme lipase (U/g nội tạng cá lóc, tính theo căn bản khô).
Kết quả thu nhận: Loại dung môi và pH thích hợp để thu được lipase có hoạt tính cao nhất.
3.3.5 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hoạt tính enzyme lipase được trích ly từ nội tạng cá lóc enzyme lipase được trích ly từ nội tạng cá lóc
Mục đích: Xác định thời gian thích hợp để thu được enzyme lipase có hoạt tính cao nhất.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với một nhân tố và 3 lần lặp lại Lọc
Xác định hoạt tính enzyme lipase
B0 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 Nguyên liệu
Trích ly
Nhân tố C: Thời gian (giờ), thay đổi ở các mức độ
C1: 1,0 giờ C2: 1,5 giờ C3: 2,0 giờ C4: 2,5 giờ C5: 3,0 giờ C6: 3,5 giờ C7: 4,0 giờ
Tổng số nghiệm thức: 7
Số mẫu thí nghiệm: 7 x 3 = 21 mẫu
Khối lượng mẫu thí nghiệm: 20 g/mẫu x 21 = 420 g * Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 3.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3
Tiến hành thí nghiệm: Sau khi xác định được loại dung môi và pH thích hợp cho quá trình trích ly lipase, tiến hành thí nghiệm 3 tương tự như thí nghiệm 1 và 2. Tiến hành trích ly enzyme lipase từ nội tạng cá lóc ở các mức thời gian khác nhau (từ 1 giờ đến 4 giờ). Tiến hành thực hiện thí nghiệm trích ly lipase ở nhiệt độ phòng (30 2oC).
Chỉ tiêu theo dõi : Hoạt tính enzyme lipase (U/g nội tạng cá lóc, tính theo căn bản khô).
Kết quả thu nhận : Thời gian trích ly thích hợp để thu được enzyme lipase có hoạt tính cao nhất.
C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7
Trích ly Nguyên liệu
Lọc
Xác định hoạt tính enzyme lipase
3.3.6 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hoạt tính enzyme lipase được trích ly từ nội tạng cá lóc enzyme lipase được trích ly từ nội tạng cá lóc
Mục đích: Xác định nhiệt độ thích hợp để thu được enzyme lipase có hoạt tính cao nhất.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với một nhân tố và 3 lần lặp lại Nhân tố D: Nhiệt độ (C), thay đổi ở các mức độ
D1: 20C D2: 30C D3: 40C D4: 50C D5: 60C D6: 70C Tổng số nghiệm thức: 6
Số mẫu thí nghiệm: 6 x 3 = 18 mẫu
Khối lượng mẫu thí nghiệm: 50 g/mẫu x 18 = 900 g * Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 3.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 4
Tiến hành thí nghiệm: Sau khi xác định được thời gian trích ly thích hợp, tiến hành thí nghiệm 4 tương tự như thí nghiệm 1, 2 và 3. Thí nghiệm được tiến hành các mức nhiệt độ khác nhau (từ 20C đến 70C).
Chỉ tiêu theo dõi: Hoạt tính enzyme lipase (U/g nội tạng cá lóc, tính theo căn bản khô).
Kết quả thu nhận: Nhiệt độ trích ly thích hợp để thu được enzyme lipase có hoạt tính cao nhất.
Lọc
Xác định hoạt tính enzyme lipase
D1 D2 D3 D4 D5 D6
Trích ly Nguyên liệu
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1 THÀNH PHẦN HOÁ LÝ CƠ BẢN CỦA NỘI TẠNG CÁ LÓC
Các thành phần hoá lý trong nguyên liệu như độ ẩm, pH, hàm lượng protein, hàm lượng lipid,… có ảnh hưởng quan trọng đến quá trình trích ly enzyme từ nguyên liệu. Do đó việc xác định các thành phần hóa lý cơ bản và hoạt tính lipase ban đầu của nội tạng cá lóc là việc cần thiết và đầu tiên trước khi tiến hành các thí nghiệm khảo sát tiếp theo. Kết quả phân tích và thống kê được tổng hợp ở bảng 4.1.
Bảng 4.1: Thành phần hoá lý cơ bản của nội tạng cá lóc
Chỉ tiêu khảo sát Giá trị
pH 6,81 0,29
Độ ẩm (%) 71,01 0,54 Đạm tổng số (%cbk) 38,98 0,46 Lipid tổng số (%cbk) 60,92 0,72
Từ kết quả phân tích cho thấy, hàm lượng ẩm trong nội tạng cá lóc khá cao, đạt 71,01 0,54%. Bên cạnh đó, nội tạng cá cũng chứa một lượng đạm lớn, đạt giá trị 38,98 0,46 (%cbk). Hàm lượng ẩm cùng với protein cao tạo điều kiện cho vi sinh vật gây hư hỏng phát triển, đồng thời là môi trường thuận lợi cho enzyme hoạt động. Giá trị pH của nội tạng cá là 6,81 0,29 cho thấy nguyên liệu có giá trị pH ở mức pH của mẫu nguyên liệu ở giai đoạn ngay sau khi thu hoạch (Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phương, 1989). Điều này chứng tỏ nguyên liệu thu hoạch vẫn còn độ tươi. Tuy nhiên, với giá trị pH vào khoảng trung tính, là điều kiện thích hợp cho vi sinh vật hoạt động, đặc biệt với hàm lượng lipid tổng số trong nội tạng cá lóc rất cao (17,66 0,23 hay 60,92 0,72%cbk), đây là cơ chất thích hợp phản ứng thủy phân chất béo của enzyme lipase và là điểu kiện thích hợp thúc đẩy cho hoạt động enzyme lipase trong nội tạng. Tuy nhiên, trong điều kiện có oxy, sự hiện diện của hàm lượng lipid cao có thể là nguyên nhân xảy ra quá trình oxy hóa chất béo, tạo ra các gốc tự do, làm giảm hoạt tính enzyme lipase có trong nguyên liệu (Lê Ngọc Tú, 2005). Chính vì vậy, việc trữ đông nội tạng cá lóc ngay sau khi thu mua và xử lý là điều cần thiết để giúp duy trì hoạt tính của lipase ổn định.
4.2 ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ NGUYÊN LIỆU VÀ NƯỚC CẤT ĐẾN HOẠT TÍNH ENZYME LIPASE TRÍCH LY TỪ NỘI TẠNG CÁ LÓC TÍNH ENZYME LIPASE TRÍCH LY TỪ NỘI TẠNG CÁ LÓC
Sự chênh lệch nồng độ chất tan giữa nguyên liệu và dung môi càng lớn sẽ thúc đẩy quá trình khuếch tán chất tan (trường hợp này là lipase) ra ngoài dung môi càng tăng. Việc khảo sát tỷ lệ của dung môi sử dụng để ly trích chiếm vai trò quan trọng trong
việc tăng hoạt tính lipase thu được từ nội tạng cá lóc. Trên cơ sở đó, thí nghiệm tiến hành khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giữa nguyên liệu và dung môi (trường hợp này là nước cất) nhằm thu nhận lipase có hoạt tính cao nhất. Kết quả thí nghiệm được tổng hợp và trình bày ở bảng 4.2.
Bảng 4.2: Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu và nước cất đến hoạt tính enzyme lipase thu nhận từ nội tạng cá lóc
Tỷ lệ nguyên liệu: nước cất Hoạt tính enzyme lipase (U/g, tính theo căn bản khô) 1: 1 0,52a 0,11 1: 2 1,07b 0,06 1: 3 1,28bc 0,16 1: 4 1,48c 0,23 1: 5 1,46c 0,04 1: 6 1,47c 0,04
(Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa của các nghiệm thức khảo sát theo kiểm định LSD ở mức độ tin cậy 95%)
Từ kết quả của bảng 4.2 cho thấy, hoạt tính của lipase thu được tăng dần khi tỷ lệ nguyên liệu và dung môi sử dụng tăng từ 1: 1 lên đến giá trị 1: 4 và sau đó không có