TÍNH ENZYME LIPASE TRÍCH LY TỪ NỘI TẠNG CÁ LÓC
Sự chênh lệch nồng độ chất tan giữa nguyên liệu và dung môi càng lớn sẽ thúc đẩy quá trình khuếch tán chất tan (trường hợp này là lipase) ra ngoài dung môi càng tăng. Việc khảo sát tỷ lệ của dung môi sử dụng để ly trích chiếm vai trò quan trọng trong
việc tăng hoạt tính lipase thu được từ nội tạng cá lóc. Trên cơ sở đó, thí nghiệm tiến hành khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giữa nguyên liệu và dung môi (trường hợp này là nước cất) nhằm thu nhận lipase có hoạt tính cao nhất. Kết quả thí nghiệm được tổng hợp và trình bày ở bảng 4.2.
Bảng 4.2: Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu và nước cất đến hoạt tính enzyme lipase thu nhận từ nội tạng cá lóc
Tỷ lệ nguyên liệu: nước cất Hoạt tính enzyme lipase (U/g, tính theo căn bản khô) 1: 1 0,52a 0,11 1: 2 1,07b 0,06 1: 3 1,28bc 0,16 1: 4 1,48c 0,23 1: 5 1,46c 0,04 1: 6 1,47c 0,04
(Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa của các nghiệm thức khảo sát theo kiểm định LSD ở mức độ tin cậy 95%)
Từ kết quả của bảng 4.2 cho thấy, hoạt tính của lipase thu được tăng dần khi tỷ lệ nguyên liệu và dung môi sử dụng tăng từ 1: 1 lên đến giá trị 1: 4 và sau đó không có sự khác biệt ở tỷ lệ 1: 5 và 1: 6. Ở tỷ lệ dung môi sử dụng để ly trích enzyme lipase thấp, hoạt tính lipase thu được thấp. Điều này có thể giải thích là do lượng dung môi sử dụng ít, không đủ xâm nhập vào nguyên liệu (Lonsane và Krishnaiah, 1992), không đủ cho sự khuếch tán chất tan (enzyme) vào dung môi (Madhusudhan et al., 2011). Khi gia tăng tỷ lệ dung môi sử dụng, sự chênh lệch nồng độ chất tan giữa nguyên liệu và dung môi tăng, làm tăng tính tan và tăng sự khuếch tán, vì thế làm tăng hoạt tính enzyme trong quá trình ly trích (Castilho et al., 2000; Madhusudhan et al., 2011). Tuy nhiên, ở các tỷ lệ dung môi sử dụng cao (1: 5 và 1: 6), thì hoạt tính lipase thu được sẽ giảm trở lại do mức độ pha loãng của lipase trong dịch trích tăng (Lonsane và Krishnaiah, 1992). Với tỷ lệ dung dịch đệm sử dụng càng cao thì thể tích dịch trích thu được càng nhiều, trong khi lượng enzyme sinh ra từ quá trình ly trích là không đổi. Kết quả là hoạt tính lipase thu được ở tỷ lệ nguyên liệu và dung môi là 1: 5 và 1: 6 giảm dần. Ngoài ra, khi tỷ lệ nguyên liệu và dung môi gia tăng cũng thúc đẩy quá trình hòa tan enzyme vào dung môi tăng nhanh ở giai đoạn đầu. Với nhiệt độ và thời gian ly trích được giữ cố định, lượng enzyme được hòa tan vào dung môi có thể đạt đến mức cao nhất ở thời gian ngắn hơn khi so sánh với các tỷ lệ nguyên liệu và dung môi thấp hơn, việc duy trì quá trình ly trích vượt quá thời gian thu nhận tối ưu này, enzyme có khả năng bị vô hoạt và giảm hoạt tính (Shata và Farid, 2012).
Ở điều kiện khảo sát, tỷ lệ nguyên liệu: dung môi sử dụng để ly trích là 1: 4, hoạt tính của lipase đạt cực đại khi so sánh với các mức độ pha loãng cao hay thấp hơn (giá trị hoạt tính lipase tương ứng là 1,48 ± 0,23 U/g, theo căn bản khô). Tuy nhiên, hoạt tính lipase khác biệt không ý nghĩa về mặt thống kê ở hai tỷ lệ nguyên liệu và dung môi là 1: 5 (1,46± 0,04 U/g CKNL) và 1: 6 (1,47± 0,04 U/g CKNL). Tỷ lệ nguyên liệu và dung môi để ly trích là 1: 4 vẫn được ưu tiên chọn lựa do những lý do sau: (i) Hoạt tính ở tỷ lệ 1: 4 vẫn cao hơn so với tỷ lệ 1: 5 và 1: 6; (ii) Khi trong trường hợp hiệu suất enzyme thu được không có sự khác biệt thì việc ly trích enzyme ở tỷ lệ 1: 4 có tính kinh tế hơn so với tỷ lệ 1: 5 và 1: 6 nhờ tiết kiệm được một phần thể tích dung môi sử dụng trong quá trình ly trích và giảm lượng hóa chất sử dụng trong quá trình tinh sạch enzyme (Castilho et al., 2000). Nghiên cứu của Phạm Thị Hồng Nga (2008) cho thấy, tỷ lệ nội tạng cá tra và dung môi trích ly là 1: 2,5 (theo khối lượng) thu được dịch trích lipase có hoạt tính cao nhất. Trong khi đó, Trần Quốc Hiền và Lê Văn Việt Mẫn (2006) cho thấy việc trích ly protease cũng từ nội tạng cá tra lại có hiệu quả thu nhận enzyme tốt nhất ở tỷ lệ 1 : 4. Việc trích ly lipase từ nội tạng cá lóc chưa được công bố, tuy nhiên kết quà thu được đã cho thấy tỷ lệ dung môi thích hợp cho quá trình trích ly enzyme phụ thuộc vào từng loại enzyme, nguồn nguyên liệu và có thể phụ thuộc cả vào điều kiện sơ chế, tốc độ ly tâm (Đặng Thị Thu và Nguyễn Thị Xuân Sâm, 2009).
Dựa trên kết quả khảo sát, tỷ lệ nguyên liệu và dung môi sử dụng cho quá trình ly trích lipase từ nội tạng cá lóc được lựa chọn là 1: 4 (v/w).
4.3 ẢNH HƯỞNG CỦA VIỆC DIỀU CHỈNH pH BAN ĐẦU CỦA DUNG MÔI TRÍCH LY ĐẾN HOẠT TÍNH ENZYME LIPASE TRÍCH LY TỪ NỘI TẠNG CÁ LÓC
Giá trị pH là một trong những yếu tố quan trọng có ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme lipase. Mỗi enzyme chỉ hoạt động trong một khoảng pH nhất định (Đỗ Quý Hai, 2004). Chính vì vậy, việc điều chỉnh pH của dung dịch đệm sử dụng đến hiệu quả thu nhận enzyme lipase từ nội tạng cá lóc được khảo sát.
Dựa trên nghiên cứu ảnh hưởng của việc điều chỉnh pH của dung môi đến quá trình trích ly enzyme, dung dịch đệm ở các giá trị pH khác nhau được sử dụng để nghiên cứu ly trích lipase. Mẫu dịch trích enzyme được ly trích bằng nước cất là mẫu đối chứng. Kết quả phân tích đánh giá sự ảnh hưởng của pH đến hoạt tính tương đối của lipase được thể hiện ở bảng 4.3.
Bảng 4.3: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme lipase thu nhận từ nội tạng cá lóc
pH Hoạt tính enzyme lipase (U/g, tính theo căn bản khô) ĐC 3,0 1,47a 0,23 1,96b 0,01 4,0 1,97b 0,01 5,0 2,30c 0,08 6,0 4,28e 0,04 7,0 3,52d 0,28 8,0 2,19bc 0,25 9,0 2,51c 0,32 10,0 2,34c 0,19
(Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa của các nghiệm thức khảo sát ở mức độ tin cậy 95%)
Từ kết quả thu được ở bảng 4.3, cho thấy hoạt tính enzyme có sự thay đổi theo giá trị pH dung môi trích ly, đồng thời sự điều chỉnh pH giúp cải thiện đáng kể hoạt tính lipase thu được khi so sánh với mẫu đối chứng là nước cất (không điều chỉnh pH). Điều này được giải thích là do việc điều khiển pH cũng là một trong giải pháp hiệu quả giúp điều chỉnh khả năng hòa tan của enzyme vào dung môi, do đó tăng hiệu suất thu nhận enzyme (Price và Steven, 2002).
Ở giá trị pH của dung dịch ly trích là 6,0, lipase thu được có hoạt tính cao nhất. Hoạt tính lipase cao nhất (4,28 ± 0,04 U/g, theo căn bản khô) ở trường hợp giá trị pH là 6,0, cao hơn 3 lần hoạt tính lipase thu được ở mẫu đối chứng (ly trích bằng nước). Nghiên cứu của Senthilkumar và Selvakumar (2008) đưa ra giá trị pH tối ưu để thu nhận lipase ngoại bào từ Bacillus sp. SS-1 là 8,0. Trong khi đó, theo Sirisha et al.
(2010) giá trị pH là 7,0 là giá trị pH tối ưu để thu nhận lipase từ vi khuẩn có trong đất chứa dầu. Điều này là do mỗi enzyme chỉ hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH xác định gọi là pH tối ưu. Sự thay đổi pH môi trường có ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, đặc biệt là độ bền của enzyme.
Dựa trên kết quả khảo sát, đệm phosphate với pH 6,0 được sử dụng làm dung dịch ly trích enzyme cho các khảo sát tiếp theo.
4.4 ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN TRÍCH LY ĐẾN HOẠT TÍNH ENZYME LIPASE TRÍCH LY TỪ NỘI TẠNG CÁ LÓC LIPASE TRÍCH LY TỪ NỘI TẠNG CÁ LÓC
Bên cạnh ảnh hưởng của giá trị pH dung môi trích ly, thời gian trích ly cũng là nhân tố quan trọng để nâng cao hiệu suất ly trích và hoạt tính của lipase. Chính vì thế, việc xác định ảnh hưởng của thời gian ly trích đến lipase cần phải được quan tâm. Kết quả
phân tích sự ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hoạt tính lipase được trình bày trong bảng 4.4.
Bảng 4.4: Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hoạt tính lipase thu nhận từ nội tạng cá lóc
Thời gian (giờ) Hoạt tính enzyme lipase
(U/g, tính theo căn bản khô)
1,0 3,80a 0,04 1,5 4,03bc 0,03 2,0 4,09c 0,09 2,5 4,29d 0,07 3,0 4,39d 0,05 3,5 3,96b 0,12 4,0 3,95b 0,06
(Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa của các nghiệm thức khảo sát ở mức độ tin cậy 95%)
Từ kết quả bảng 4.4, cho thấy hoạt tính lipase gia tăng khi thời gian ly trích lipase tăng từ 1 giờ đến 3 giờ và giảm dần khi thời gian ly trích tiếp tục tăng từ 3,5 giờ đến 4 giờ. Hoạt tính lipase thu được cao nhất ở thời gian ly trích là 3 giờ. Khi thời gian ly trích quá ngắn (1 giờ) hay quá dài (4 giờ) đều làm giảm hoạt tính lipase. Ở cùng tỷ lệ dung môi sử dụng, thời gian ly trích ngắn sẽ không đủ cho quá trình ngấm dung môi vào nguyên liệu, giảm hiệu suất thu nhận enzyme (Negi et al., 2011). Ngược lại, nếu thời gian ly trích quá dài sẽ làm giảm hoạt tính của enzyme (Ghildyal et al., 1991).
4.5 ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ TRÍCH LY ĐẾN HIỆU QUẢ THU NHẬN LIPASE TỪ NỘI TẠNG CÁ LÓC
Ngoài chịu ảnh hưởng của các yếu tố như pH, tỷ lệ nguyên liệu và dung môi, thời gian, thì nhiệt độ trích ly cũng có sự ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính lipase ở các nhiệt độ từ 20C đến 70C được trình bày ở bảng 4.5.
Bảng 4.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hoạt tính enzyme lipase từ nội tạng cá lóc
Nhiệt độ (C) Hoạt tính enzyme lipase (U/g, tính theo căn bản khô) 20 3,85a 0,10 30 4,38b 0,04 40 5,36c 0,06 50 5,94d 0,16 60 5,88d 0,04 70 4,52b 0,17
(Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa của các nghiệm thức khảo sát ở mức độ tin cậy 95%)
Từ kết quả bảng 4.5 cho thấy theo sự gia tăng nhiệt độ trích ly hoạt tính enzyme lipase tăng dần và đạt giá trị cao nhất ở 50C, hoạt tính enzyme đạt 5,94 0,16 (U/g, theo căn bản khô). Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng cao hơn 60C, hoạt tính enzyme bắt đầu có xu hướng giảm. Sự giảm hoạt tính được giải thích là do các phân tử đóng vai trò trung tâm hoạt động enzyme lipase bị phá vỡ bởi nhiệt. Do đó, khi enzyme được gia nhiệt, các phân tử này bị phá vỡ, trung tâm hoạt động của enzyme trở nên bất hoạt. Vì vậy, enzyme biến đổi và mất đi vai trò xúc tác (Alyward et al., 1969). Ở các nhiệt độ thấp hơn, các thành phần cấu tạo lipase có ít năng lượng để di chuyển so với các nhiệt độ khảo sát khác (20 ÷ 40ºC) do đó tốc độ phản ứng chậm hơn.
Mỗi một enzyme hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ tối ưu nhất định. Khi nhiệt độ lệch sang hai bên nhiệt độ tối ưu hoạt động của enzyme giảm và tốc độ phản ứng sẽ giảm theo. Sự tăng nhiệt độ làm cho làm cho động năng của enzyme và cơ chất tăng, chúng chuyển động nhanh hơn, va chạm nhiều hơn. Các phức chất enzyme – cơ chất hình thành nhiều hơn, phản ứng xảy ra nhanh hơn. Tuy nhiên nếu nhiệt độ quá cao, enzyme bị biến tính. Khi cấu hình vị trí xúc tác không còn phù hợp với cơ chất, enzyme mất hoạt tính xúc tác. Khi nhiệt độ hạ thấp hơn nhiệt độ tối ưu, cơ chất và phân tử enzyme chuyển động chậm. Tần số va chạm giữa chúng thấp, phức hợp enzyme – cơ chất hình thành ít và tốc độ phản ứng giảm. Nói cách khác, việc gia tăng nhiệt độ ly trích có tác động tích cực trong việc gia tăng tính tan của dung môi, làm tăng vận tốc chuyển động và thúc đẩy quá trình thẩm thấu dung môi vào cơ chất và gia tăng khả năng khuếch tán, hay ly trích enzyme trong nội bào của tế bào động vật ra bên ngoài môi trường. Tuy nhiên, nhiệt độ ly trích cao có thể là nguyên nhân dẫn đến sự kém ổn định và ức chế hoạt động của enzyme.
Kết quả thu được phù hợp với đặc tính chung của lipase từ động vật. Pahojar và Sethar (2002) đã ghi nhận hoạt tính của lipase, điều kiện trích ly lipase từ động vật có liên quan chặt chẽ với vị trí của enzyme trong nội tạng, điều này cũng tác động đến
điều kiện trích ly hay hoạt động của lipase. Knospe và Plendi (1997, trích dẫn bởi Pahojar và Sethar, 2002) đã tìm thấy điều kiện trích ly lipase từ nội tạng của dê là 5,6 ÷ 6,5 và khoảng nhiệt độ ly trích thích hợp là 43 ÷ 60C. Điều này một lần nữa khẳng định, ở điều kiện khảo sát, nhiệt độ phù hợp cho quá trình trích ly lipase từ nội tạng cá lóc đạt được ở mức nhiệt độ 50 ÷ 60ºC tương ứng thời gian ly trích là 3 giờ với việc sử dụng dung môi trích ly là đệm phosphate pH 6.
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1 KẾT LUẬN
Kết quả nghiên cứu đã cho thấy triển vọng của việc thu nhận enzyme lipase từ nội tạng cá lóc.
Thí nghiệm đã xác định được các thông số cơ bản của quá trình trích ly lipase từ nội tạng cá lóc gồm:
- Tỷ lệ nguyên liệu và dung môi trích ly là 1: 4 (w/v)
- Dung môi thích hợp để trích ly lipase là đệm phosphate có pH 6
- Thời gian tối ưu cho quá trình trích ly là 3 giờ tương ứng với nhiệt độ trích ly 50C.
Hoạt tính lipase thu được cao nhất đạt 5,94 ± 0,16 (U/g, theo căn bản khô).
5.2 KIẾN NGHỊ
Do thời gian nghiên cứu có giới hạn nên qua quá trình nghiên cứu, xin đề nghị khảo sát thêm:
- Tương tác của các nhân tố trích ly đến hiệu quả thu nhận enzyme lipase từ nội tạng cá lóc.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
Bùi Hồng Quân và Nguyễn Đức Lượng, 2009. Tối ưu hóa sinh tổng hợp lipase từ Pichia anomala
VTCC Y0787 sử dụng ma trận Plackett-Burman và phương pháp đáp ứng bề mặt – phương án cấu trúc có tâm. Tạp chí Công nghệ Sinh học, 7(4): 493-500.
Đỗ Quý Hai, 2004. Giáo trình công nghệ và ứng dụng enzyme, ĐH KH Huế.
Đặng Thị Thu và Nguyễn Thị Xuân Sâm, 2009. Công nghệ enzyme. Trích dẫn từ: Cơ sở công nghệ sinh học (chủ biên Đặng Thị Thu), NXB Giáo dục, Việt Nam.
Lê Ngọc Tú, 2002. Hóa sinh Công nghiệp. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
Ngô Tiến Hiển, 2001. Ứng dụng công nghệ tiên tiến trong chế biến nông sản thực phẩm. Hội nghị Khoa học, Công nghệ và Môi trường các tỉnh miền Đông Nam bộ lần 7, 314-320.
Nguyễn Bin, 2008. Các quá trình, thiết bị trong công nghệ hóa chất và thực phẩm, tập 4. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy, 2011. Giáo trình Kỹ thuật thực phẩm 3 (Quá trình sinh hóa trong chế biến thực phẩm). Nhà xuất bản Đại học Cần Thơ.
Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phương, 1989. Công nghệ chế biến thực phẩm thủy sản (tập 1 và 2), Nxb. Nông nghiệp.
Phạm Thị Hồng Nga, 2008. Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá. Luận văn tốt nghiệp Đại học ngành Kỹ thuật thực phẩm. Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. Trường Đại học Bách Khoa. Thành phố Hồ Chí Minh.
Quyền Đình Thi, Lê Thị Thu Giang và Nguyễn Thị Thảo, 2004. Biểu hiện cao lipase kiềm và chịu nhiệt của chủng Ralstonia sp. M1 ở E.coli. Tạp chí Di truyền và ứng dụng, 4: 38-42.
Trần Đắc Định, Shibukawa Koichi, Nguyễn Thanh Phương, Hà Phước Hùng, Trần Xuân Lợi, Mai Văn Hiếu và Utsugi Kenzo, 2013. Mô tả định loại cá Đồng bằng sông Cửu Long, Việt Nam. Nhà xuất bản Đại học Cần Thơ.
Trần Thị Bé Lan, Nguyễn Minh Nam, Tạ Thị Thanh Thúy và Phan Ngọc Hòa, 2012. So sánh một số