LIPASE TRÍCH LY TỪ NỘI TẠNG CÁ LÓC
Bên cạnh ảnh hưởng của giá trị pH dung môi trích ly, thời gian trích ly cũng là nhân tố quan trọng để nâng cao hiệu suất ly trích và hoạt tính của lipase. Chính vì thế, việc xác định ảnh hưởng của thời gian ly trích đến lipase cần phải được quan tâm. Kết quả
phân tích sự ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hoạt tính lipase được trình bày trong bảng 4.4.
Bảng 4.4: Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hoạt tính lipase thu nhận từ nội tạng cá lóc
Thời gian (giờ) Hoạt tính enzyme lipase
(U/g, tính theo căn bản khô)
1,0 3,80a 0,04 1,5 4,03bc 0,03 2,0 4,09c 0,09 2,5 4,29d 0,07 3,0 4,39d 0,05 3,5 3,96b 0,12 4,0 3,95b 0,06
(Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa của các nghiệm thức khảo sát ở mức độ tin cậy 95%)
Từ kết quả bảng 4.4, cho thấy hoạt tính lipase gia tăng khi thời gian ly trích lipase tăng từ 1 giờ đến 3 giờ và giảm dần khi thời gian ly trích tiếp tục tăng từ 3,5 giờ đến 4 giờ. Hoạt tính lipase thu được cao nhất ở thời gian ly trích là 3 giờ. Khi thời gian ly trích quá ngắn (1 giờ) hay quá dài (4 giờ) đều làm giảm hoạt tính lipase. Ở cùng tỷ lệ dung môi sử dụng, thời gian ly trích ngắn sẽ không đủ cho quá trình ngấm dung môi vào nguyên liệu, giảm hiệu suất thu nhận enzyme (Negi et al., 2011). Ngược lại, nếu thời gian ly trích quá dài sẽ làm giảm hoạt tính của enzyme (Ghildyal et al., 1991).
4.5 ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ TRÍCH LY ĐẾN HIỆU QUẢ THU NHẬN LIPASE TỪ NỘI TẠNG CÁ LÓC
Ngoài chịu ảnh hưởng của các yếu tố như pH, tỷ lệ nguyên liệu và dung môi, thời gian, thì nhiệt độ trích ly cũng có sự ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính lipase ở các nhiệt độ từ 20C đến 70C được trình bày ở bảng 4.5.
Bảng 4.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hoạt tính enzyme lipase từ nội tạng cá lóc
Nhiệt độ (C) Hoạt tính enzyme lipase (U/g, tính theo căn bản khô) 20 3,85a 0,10 30 4,38b 0,04 40 5,36c 0,06 50 5,94d 0,16 60 5,88d 0,04 70 4,52b 0,17
(Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa của các nghiệm thức khảo sát ở mức độ tin cậy 95%)
Từ kết quả bảng 4.5 cho thấy theo sự gia tăng nhiệt độ trích ly hoạt tính enzyme lipase tăng dần và đạt giá trị cao nhất ở 50C, hoạt tính enzyme đạt 5,94 0,16 (U/g, theo căn bản khô). Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng cao hơn 60C, hoạt tính enzyme bắt đầu có xu hướng giảm. Sự giảm hoạt tính được giải thích là do các phân tử đóng vai trò trung tâm hoạt động enzyme lipase bị phá vỡ bởi nhiệt. Do đó, khi enzyme được gia nhiệt, các phân tử này bị phá vỡ, trung tâm hoạt động của enzyme trở nên bất hoạt. Vì vậy, enzyme biến đổi và mất đi vai trò xúc tác (Alyward et al., 1969). Ở các nhiệt độ thấp hơn, các thành phần cấu tạo lipase có ít năng lượng để di chuyển so với các nhiệt độ khảo sát khác (20 ÷ 40ºC) do đó tốc độ phản ứng chậm hơn.
Mỗi một enzyme hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ tối ưu nhất định. Khi nhiệt độ lệch sang hai bên nhiệt độ tối ưu hoạt động của enzyme giảm và tốc độ phản ứng sẽ giảm theo. Sự tăng nhiệt độ làm cho làm cho động năng của enzyme và cơ chất tăng, chúng chuyển động nhanh hơn, va chạm nhiều hơn. Các phức chất enzyme – cơ chất hình thành nhiều hơn, phản ứng xảy ra nhanh hơn. Tuy nhiên nếu nhiệt độ quá cao, enzyme bị biến tính. Khi cấu hình vị trí xúc tác không còn phù hợp với cơ chất, enzyme mất hoạt tính xúc tác. Khi nhiệt độ hạ thấp hơn nhiệt độ tối ưu, cơ chất và phân tử enzyme chuyển động chậm. Tần số va chạm giữa chúng thấp, phức hợp enzyme – cơ chất hình thành ít và tốc độ phản ứng giảm. Nói cách khác, việc gia tăng nhiệt độ ly trích có tác động tích cực trong việc gia tăng tính tan của dung môi, làm tăng vận tốc chuyển động và thúc đẩy quá trình thẩm thấu dung môi vào cơ chất và gia tăng khả năng khuếch tán, hay ly trích enzyme trong nội bào của tế bào động vật ra bên ngoài môi trường. Tuy nhiên, nhiệt độ ly trích cao có thể là nguyên nhân dẫn đến sự kém ổn định và ức chế hoạt động của enzyme.
Kết quả thu được phù hợp với đặc tính chung của lipase từ động vật. Pahojar và Sethar (2002) đã ghi nhận hoạt tính của lipase, điều kiện trích ly lipase từ động vật có liên quan chặt chẽ với vị trí của enzyme trong nội tạng, điều này cũng tác động đến
điều kiện trích ly hay hoạt động của lipase. Knospe và Plendi (1997, trích dẫn bởi Pahojar và Sethar, 2002) đã tìm thấy điều kiện trích ly lipase từ nội tạng của dê là 5,6 ÷ 6,5 và khoảng nhiệt độ ly trích thích hợp là 43 ÷ 60C. Điều này một lần nữa khẳng định, ở điều kiện khảo sát, nhiệt độ phù hợp cho quá trình trích ly lipase từ nội tạng cá lóc đạt được ở mức nhiệt độ 50 ÷ 60ºC tương ứng thời gian ly trích là 3 giờ với việc sử dụng dung môi trích ly là đệm phosphate pH 6.
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1 KẾT LUẬN
Kết quả nghiên cứu đã cho thấy triển vọng của việc thu nhận enzyme lipase từ nội tạng cá lóc.
Thí nghiệm đã xác định được các thông số cơ bản của quá trình trích ly lipase từ nội tạng cá lóc gồm:
- Tỷ lệ nguyên liệu và dung môi trích ly là 1: 4 (w/v)
- Dung môi thích hợp để trích ly lipase là đệm phosphate có pH 6
- Thời gian tối ưu cho quá trình trích ly là 3 giờ tương ứng với nhiệt độ trích ly 50C.
Hoạt tính lipase thu được cao nhất đạt 5,94 ± 0,16 (U/g, theo căn bản khô).
5.2 KIẾN NGHỊ
Do thời gian nghiên cứu có giới hạn nên qua quá trình nghiên cứu, xin đề nghị khảo sát thêm:
- Tương tác của các nhân tố trích ly đến hiệu quả thu nhận enzyme lipase từ nội tạng cá lóc.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
Bùi Hồng Quân và Nguyễn Đức Lượng, 2009. Tối ưu hóa sinh tổng hợp lipase từ Pichia anomala
VTCC Y0787 sử dụng ma trận Plackett-Burman và phương pháp đáp ứng bề mặt – phương án cấu trúc có tâm. Tạp chí Công nghệ Sinh học, 7(4): 493-500.
Đỗ Quý Hai, 2004. Giáo trình công nghệ và ứng dụng enzyme, ĐH KH Huế.
Đặng Thị Thu và Nguyễn Thị Xuân Sâm, 2009. Công nghệ enzyme. Trích dẫn từ: Cơ sở công nghệ sinh học (chủ biên Đặng Thị Thu), NXB Giáo dục, Việt Nam.
Lê Ngọc Tú, 2002. Hóa sinh Công nghiệp. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
Ngô Tiến Hiển, 2001. Ứng dụng công nghệ tiên tiến trong chế biến nông sản thực phẩm. Hội nghị Khoa học, Công nghệ và Môi trường các tỉnh miền Đông Nam bộ lần 7, 314-320.
Nguyễn Bin, 2008. Các quá trình, thiết bị trong công nghệ hóa chất và thực phẩm, tập 4. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy, 2011. Giáo trình Kỹ thuật thực phẩm 3 (Quá trình sinh hóa trong chế biến thực phẩm). Nhà xuất bản Đại học Cần Thơ.
Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phương, 1989. Công nghệ chế biến thực phẩm thủy sản (tập 1 và 2), Nxb. Nông nghiệp.
Phạm Thị Hồng Nga, 2008. Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá. Luận văn tốt nghiệp Đại học ngành Kỹ thuật thực phẩm. Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. Trường Đại học Bách Khoa. Thành phố Hồ Chí Minh.
Quyền Đình Thi, Lê Thị Thu Giang và Nguyễn Thị Thảo, 2004. Biểu hiện cao lipase kiềm và chịu nhiệt của chủng Ralstonia sp. M1 ở E.coli. Tạp chí Di truyền và ứng dụng, 4: 38-42.
Trần Đắc Định, Shibukawa Koichi, Nguyễn Thanh Phương, Hà Phước Hùng, Trần Xuân Lợi, Mai Văn Hiếu và Utsugi Kenzo, 2013. Mô tả định loại cá Đồng bằng sông Cửu Long, Việt Nam. Nhà xuất bản Đại học Cần Thơ.
Trần Thị Bé Lan, Nguyễn Minh Nam, Tạ Thị Thanh Thúy và Phan Ngọc Hòa, 2012. So sánh một số tính chất của chế phẩm enzyme lipase từ Candida rugosa và Porcine pancreas. Tạp chí khoa học, 22b: 210-220.
Vương Bảo Thy, Trần Bích Lam và Lưu Duẩn, 2011. Nghiên cứu thu nhận, tinh sạch và xác định tính chất của enzyme lipase từ gan tụy cá tra (pangasius). Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ, 14(3): 5-11.
Tiếng Anh
Abramic, M., I. Lescic, T. Korica, L. Vitale, W. Saenger and J. Pigac, 1999. Purification and properties of extracellular lipase from Streptomyces rimosus. Enzyme and Microbial Technology, 25: 522-529.
Alyward, F. and D.R. Haisian, 1969. Oxidation system in fruits and vegetables their relation to the quality of pressured products. Advances in Food research, 17: 1-76.
Arpigny, J.L. and K.E. Jaeger, 1999. Bacterial lipolytic enzymes: classification and properties.
Biochem. J., 343: 177-183.
Belarbi, E.H., E. Molina and Y. Chisti, 2000. A process for high yield and scaleable recovery of high purity eicosapentaenoic acid esters from microalgae and fish oil. Enzyme Microb Technol, 26: 516-529.
Berglund, P. and K. Hutt, 2000. Biocatalytic synthesis of enantiopure compounds using lipases. In: Patel RN, editor. Stereoselective biocatalysis. New York: Marcel Dekker.
Cardenas, J., E. Alvarez, de Castro-Alvarez M-S, Sanchez-Montero J-M, M. Valmaseda, S.W. Elson and Sinisterra J-V, 2001. Screening and catalytic activity in organic synthesis of novel fungal and yeast lipases. J Mol Catal B: Enzym, 14:111-123.
Castilho, L.R., T.L.M. Alves and R.A. Medronho, 2000. Production and extraction of pectinases obtained by solid state fermentation of agro-industrial residues with Aspergillus niger.
Bioresource Technology, 71: 45-50.
Chartrain, M., L. Katz, C. Marcin, M. Thien, S. Smith, E. Fisher, K. Goklen, P. Salmon, T. Brix, K. Price and R. Greasham, 1993. Purification and characterization of a novel bioconverting lipase from Pseudomonas aeruginosa MB 5001. Enzyme and Microbial Technology, 15(7): 575-580. Colman, M.H. and A.R. Macrae, 1980. UK Patent No. 1577933.
Cordenons, A., R. Gonzalez, R. Kok, K.J. Hellingwerf and C. Nudel, 1996. Effect on nitrogen sources on the regulation of extracellular lipase production in Acinetobacter calcoaceticus
strains. Biotechnology Letters, 6: 633-638.
Dugi, K.A., H.L. Dechek, G.D. Tally, H.B. Brewer and S. Santamaria-Fojo, 1992. Human lipoprotein lipase: The loop covering the catalytic site is essential for interaction with lipid substrates. J Biol Chem, 267 (35): 25086-25091.
El-Shafei, H.A. and L.A. Rezkallah, 1997. Production, purification and characterization of Bacillus
lipase. Microbiol Res, 52: 199-208.
Fullbrook, P.D., 1996. Practical applied kinetics. In: T. Godfrey and S. West (editors). Industrial enzymology. 2nd ed. New York: Stockton Press, 1996. pp. 483–540.
Gao, Y. and C. Breuil, 1995. Extracellular lipase production by a sapwood-staining fungus
Ophiostoma piceae. World J Microbiol Biotechnol, 11: 638-642.
Ghosh, P.K., T.K. Saxena, R. Gupta, R.P. Yadav and S. Davidson, 1996. Microbial lipases: production and applications. Sci Prog, 79: 119-157.
Ghildyal, N.P., M. Ramakrishna, B.K. Lonsane and N.G. Karanth, 1991. Efficient and simple extraction of mouldy bran in a pulsed column extractor for recovery of amyloglucosidase in concentrated form. Process Biochemistry, 26: 235-241.
Gill, I. and R. Valivety, 1997. Polyunsaturated fatty acids: Part 1. Occurrence, biological activities and applications. Trends Biotechnol, 15: 401-409.
Gill, I. and R. Valivety, 1997. Polyunsaturated fatty acids: Part 2. Biotransformations and biotechnological applications. Trends Biotechnol, 15: 470-478.
Girousse A. and D. Langin, 2012. Adipocyte lipases and lipid droplet-associated proteins: insight from transgenic mouse models. International Journal of Obesity, 36: 581-594.
Guit, R.P.M., M. Kloosterman, G.W. Mindersma, M. Mayer and E.M. Meijer, 1991. Lipase kinetics: hydrolysis of triacetin by lipase from Candida cylindracea in a hollow fiber membrane reactor.
Biotechnol Bioeng, 38: 727–732.
Han, S.J., J.H. Back, M.Y. Yoon, P.K. Shin, C.S. Cheong, M.H. Sung, S.P. Hong, I.Y. Chung and Y.S. Han, 2003. Expression and characterization of a novel enantioselective lipase from
Acinetobacterspecies SY-01. Biochimie, 85: 501-510.
Hjorth, A., E. Carriere and C. Cudrey, 1993. A structural domain (the lid) found in pancreatic lipases is absent in the guinea pig (phospholipase) lipase. Biochemistry, 32.
Izumi, T., K. Nakamura and T. Fukase, 1990. Purification and characterization of a thermostable lipase from newly isolated Pseudomonas sp. KWI-56. Agric Biol Chem, 54: 1253-1258.
Jaeger, K.E. and T.M. Reetz, 1998. Microbial lipases from versatile tools for biotechnology. Trends Biotechnol, 16: 396-403.
Janssen, P.H., C.R. Monk and H.W. Morgan, 1994. A thermophilic, lipolytic Bacillus sp., and continuous assay of its p-nitrophenyl-palmitate esterase activity. FEMS Microbiol Lett, 120: 195-200.
Jensen, R.G., 1983. Detection and determination of lipase (acylglycerol hydrolase) activity from various sources. Lipids, 18: 650-657.
John, M.D., 2000. Chemical and Physical Properties of Fatty Acids. In: Ching Kuang Chow (editor). Fatty acids in foods and their health implications. USA. 1041 pp.
Kamini, N.R., T. Fujii, T. Kurosu and H. Lefuji, 2000. Production, purification and characterization of an extracellular lipase from the yeast, Cryptococcus sp. S-2. Process Biochem., 36: 317-324. Kanchana, R., 2007. Proteases and Lipases from the Marine Protists, Thraustochytrids.
Kazlauskas, R.J. and U.T. Bornscheuer, 1998. Biotransformations with lipases. In: H.J. Rehm, G. Pihler, A. Stadler and P.J.W. Kelly (editors). Biotechnology. New York: VCH, 8: 37-192. Kim, H.K., S.Y. Park, J.K. Lee and T.K. Oh, 1998. Gene cloning and characterization of
thermostable lipase from Bacillus stearothermophilus L1. Biosci Biotechnol Biochem, 62: 66-71. Klibanov, A.M., 1997. Why are enzymes less active in organic solvents than in water?. Trends
Biotechnol, 15: 97-101.
Lee, D., Y. Kok, K. Kim, B. Kim, H. Choi, D. Kim, M.T. Suhartono and Y. Pyun, 1999. Isolation and characterization of a thermophilic lipase from Bacillus thermoleovorans ID-1. FEMS Microbiol Lett, 179: 393-400.
Lohse, P., C.Z. Soheyla, L. Pia and S. Dietrich, 1997. Human lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase and human gastric lipase: identification of the catalytically active serine, aspartic acid, and histidine residues. Journal of Lipid Research, 38: 892-903.
Lonsane, B.K. and M.M. Krishnaiah, 1992. Product leaching and downstream processing. In: H.W. Doelle, D.A. Mitchell & C.E. Rolz (editors). Solid substrate Cultivation. Elsevier Science Publishers. UK, 147-153.
Litthauer, D., A. Ginster and E. Skein, 2002. Pseudomonas luteola lipase: A new member of the 320- residue Pseudomonas lipase family. Enzyme Microb. Tech., 30: 209-215.
Madhusudhan, M.C., M.C. Lakshmi and K.S.M.S. Raghavarao, 2011. Aqueous Two-Phase Extraction of Enzymes for Food Processing. In: F. Lebovka, N. Vorobiev and E. Chemat (editors). Enhancing Extraction Processes in the Food Industry, CRC Press.
Malcata, F.X., H.R. Reyes, H.S. Garcia, C.G. Hill and C.H. Amundson, 1992. Kinetics and mechanisms of reactions catalyzed by immobilized lipases. Enzyme Microb Technol, 14: 426- 446.
Masse, L., K. J. Kennedy and S.P. Chou, 2001. The effect of an enzymatic pretreatment on the hydrolysis and size reduction of fat particles in slaughterhouse wastewater. J Chem Technol Biotechnol, 76: 629-635.
Mukherjee, K.D. and M.J. Mills, 1994. Lipases from plants. Lipases. Cambridge University Press, Cambridge, 49.
Negi, J.S., P. Singh and B. Rawat, 2011. Chemical constituents and biological importance of swertia- a review. Current Chemical Research, 3: 1-15.
Nelson, J.S., 1994. Fishes of the world: New York, John Wiley, 600 p.
Pabai, F., S. Kermasha and A. Morin, 1995. Interesterification of butter fat by partially purified extracellular lipases from Pseudomonas putida, Aspergillus niger and Rhizopus oryzae. World J Microbiol Biotechnol, 11: 669-677.
Pabai, F., S. Kermasha and A. Morin, 1995. Lipase from Pseudomonas fragi CRDA 323: partial purification, characterization and interesterification of butter fat. Appl Microbiol Biotechnol, 43: 42-51.
Pahoja V.M. & Sethar M.A., 2002. A review of enzymatic properties lipase in plants, animals and microorganisms. Pakistan Journal of Applied Sciences 2(4): 474-484.
Pencreac’h, G. and J.C. Baratti, 1996. Hydrolysis of p-nitrophenyl palmitate in n-heptane by
Pseudomonas cepacia lipase: a simple test for the determination of lipase activity in organic media. Enzyme Microb Technol, 18: 417-422.
Rubin, B. and E.A. Dennis (editors), 1997. Lipases: Part A. Biotechnology Methods in enzymology. Inc. New York: Academic Press, 284: 1-408.
Rubin, B. and E.A. Dennis (editors), 1997. Lipases: Part B. Enzyme characterization and utilization Methods in enzymology. Inc. New York: Academic Press, 286: 1-563.
Ricardo, B.R., R.E. Broughton, E.O. Wiley, K. Carpenter, J.A. López, C. Li, N.I. Holcroft, D. Arcila, M. Sanciangco, J.C. Cureton II, F. Zhang, T. Buser, M.A. Campbell, J.A. Ballesteros, A.R. Varon, S. Willis, W.C. Borden, T. Rowley, P.C. Reneau, D.J. Hough, G. Lu, T. Grande, G. Arratia and G. Ortí, 2013. The Tree of Life and a New Classification of Bony Fishes. PLOS Currents Tree of Life.
Senthilkumar, R. and G. Selvakumar, 2008. Isolation and Characterization of an Extracellular Lipase Producing Bacillus sp. SS-1 from Slaughterhouse Soil. Advanced Biotech, 24-25.
Sharma, R., Y. Chisti and U. Chand Banerjee, 2001. Production, purification, characterization, and applications of lipases. Biotechnology Advances, 19: 627-662.