nghiên cứu trích ly protease từ thịt đầu tôm sú

Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu và dung môi w/v trích ly, điều kiện pH của môi trường, đặc biệt là tác động tương tác của nhiệt độ và thời gian trích ly đến hiệu quả thu nhận protease

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU TRÍCH LY PROTEASE

TỪ THỊT ĐẦU TÔM SÚ

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

MSSV: 2101943

Lớp Công nghệ Thực phẩm K36

Cần Thơ, 2013

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của sinh viên Phan Thị Bích Ngọc

với sự hướng dẫn của PGs Ts Nguyễn Văn Mười Các số liệu và kết quả trình

bày trong luận văn là trung thực và do chính tác giả thực hiện Luận văn đính kèm

theo đây, với đề tài “Nghiên cứu trích ly protease từ thịt đầu tôm sú” đã được

hội đồng chấm luận văn thông qua

Cần Thơ, ngày 09 tháng 12 năm 2013 Người hướng dẫn Người viết

Nguyễn Văn Mười Phan Thị Bích Ngọc

LỜI CẢM ƠN



Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

Thầy Nguyễn Văn Mười và cô Trần Thanh Trúc, những người đã trực tiếp hướng

dẫn, giúp đỡ em tận tình Đồng thời cung cấp nhiều kiến thức và tạo điều kiện thuận

lợi cũng như giải đáp những thắc mắc của em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cô Nguyễn Thị Hoàng Minh, cán bộ phòng thí nghiệm D006 đã tạo điều kiện thuận

lợi cho em hoàn thành tốt đề tài của mình

Chân thành cám ơn sự giảng dạy và truyền đạt kiến thức của các Thầy Cô ở Trường

Đại học Cần Thơ, đặc biệt là Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và

Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ

Anh Trần Bạch Long – học viên Cao học ngành Công nghệ Sinh học khóa 19, anh

đã truyền đạt cho em nhiều kinh nghiệm, giúp đỡ em tận tình về kiến thức cũng như

phương pháp học tập, nghiên cứu

Các bạn bè thân yêu và thầy cố vấn học tập kính mến của lớp Công nghệ thực phẩm

khóa 36 đã động viên, chia sẽ kinh nghiệm buồn vui trong suốt thời gian học tập

bên nhau và cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu đề tài

Các anh chị và các bạn thực tập cùng phòng thí nghiệm D006 đã giúp đỡ rất nhiều

trong quá trình nghiên cứu đề tài

Con cảm ơn cha mẹ, những người thân đã trang bị tinh thần lẫn vật chất và là hành

trang cho con bước vào đời

Cuối lời em xin gởi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể quý thầy cô trường Đại học

Cần Thơ đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt bốn năm học tập tại

trường

Kính chúc quý thầy cô và các bạn luôn dồi dào sức khỏe và thành công

Em xin chân thành cảm ơn

Sinh viên thực hiện

TÓM TẮT



Đề tài tiến hành khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng trích ly protease từ

mẫu thịt đầu tôm sú – sản phẩm phụ của ngành chế biến tôm đông lạnh Ảnh hưởng

của tỷ lệ nguyên liệu và dung môi (w/v) trích ly, điều kiện pH của môi trường, đặc

biệt là tác động tương tác của nhiệt độ và thời gian trích ly đến hiệu quả thu nhận

protease từ thịt đầu tôm sú đã được khảo sát theo phương pháp bề mặt đáp ứng với

cấu trúc có tâm Kết quả khảo sát cho thấy, dịch chiết protease thu được từ thịt đầu

tôm sú có hoạt tính tối ưu là 13,48 U/g CKNL (chất khô nguyên liệu) khi sử dụng

dung dịch đệm glycine - NaOH với pH 9 làm dung môi trích ly với tỷ lệ nguyên liệu

và dung môi là 1: 4 (w/v) Việc áp dụng phương pháp bề mặt đáp ứng đã xác định

được điều kiện nhiệt độ và thời gian ủ tối ưu lần lượt là 46 °C và 44,6 phút

Từ khóa: nhiệt độ, pH, protease, thịt đầu tôm sú, thời gian, tỉ lệ dung môi

MỤC LỤC



LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH HÌNH vi

DANH SÁCH BẢNG vii

DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT viii

Chương 1 TỔNG QUAN 1

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2

Chương 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 THỊT ĐẦU TÔM SÚ - NGUỒN NGUYÊN LIỆU LY TRÍCH ENZYME PROTEASE 3

2.1.1 Tôm sú – nguồn thủy sản lạnh đông xuất khẩu 3

2.1.2 Thực trạng xử lý và tiêu thụ thịt đầu tôm sú ở nước ta 5

2.2 KHÁI QUÁT VỀ PROTEASE VÀ HỆ PROTEASE TRONG THUỶ SẢN 6

2.2.1 Tổng quan về protease 6

2.2.2 Hệ serine protease 8

2.2.3 Protease của tôm sú 10

2.2.4 Khả năng ứng dụng protease 11

2.3 CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA VIỆC TRÍCH LY PROTEASE TỪ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 13

2.3.1 Lý thuyết chung 13

2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly của enzyme 14

2.4 QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN TRÍCH LY THÍCH HỢP BẰNG PHƯƠNG PHÁP BỀ MẶT ĐÁP ỨNG (RSM) 16

2.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ TRÍCH LY VÀ ỨNG DỤNG CỦA PROTEASE NGUỒN GỐC ĐỘNG VẬT 17

2.5.1 Nghiên cứu trong nước 17

2.5.2 Nghiên cứu ngoài nước 17

Chương 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM 19

3.1.1 Địa điểm, thời gian thí nghiệm 19

3.1.2 Dụng cụ thí nghiệm 19

3.1.3 Hóa chất sử dụng 19

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.2.1 Nguyên liệu 20

3.2.2 Phương pháp chuẩn bị mẫu 20

3.2.3 Phương pháp trích ly enzyme protease từ thịt đầu tôm sú 20

3.2.4 Phương pháp phân tích và đo đạc kết quả 20

3.2.5 Phương pháp thu thập và xử lý kết quả 21

3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 22

3.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 22

3.3.2 Xác định thành phần hóa lý và hoạt tính protease ban đầu có trong thịt đầu tôm 22

3.3.3 Thí nghiệm 1: Xác định tỷ lệ mẫu và dung môi trích ly protease từ thịt đầu tôm sú phù hợp 23

3.3.4 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường đến hiệu quả trích ly protease 24

3.3.5 Thí nghiệm 3: Xác định tương tác của nhiệt độ và thời gian ủ đến hiệu quả trích ly protease 26

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

4.1 THÀNH PHẦN HÓA LÝ CƠ BẢN CỦA THỊT ĐẦU TÔM 29

4.2 ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ NGUYÊN LIỆU VÀ DUNG MÔI ĐẾN QUÁ TRÌNH TRÍCH LY ENZYME PROTEASE TỪ THỊT ĐẦU TÔM SÚ 30

4.3 ẢNH HƯỞNG CỦA VIỆC ĐIỀU CHỈNH pH MÔI TRƯỜNG ĐẾN HIỆU QUẢ TRÍCH LY PROTEASE 31

4.4 ẢNH HƯỞNG CỦA TƯƠNG TÁC NHIỆT ĐỘ VÀ THỜI GIAN TRÍCH LY ĐẾN HIỆU QUẢ THU NHẬN PROTEASE TỪ THỊT ĐẦU TÔM SÚ 32

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38

5.1 KẾT LUẬN 38

5.2 ĐỀ NGHỊ 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

PHỤ LỤC 1 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ix

PHỤ LỤC 2 KẾT QUẢ THỐNG KÊ xiii

PHỤ LỤC 3 SỐ LIỆU XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN TYROSINE xix

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Tôm sú Penaeus monodon 4

Hình 2.2 Phản ứng thủy phân liên kết peptide do tác động của protease 6

Hình 2.3 Cơ chế xúc tác của endopeptidase và exopeptidase 7

Bảng 2.2 Một số serine protease có nguồn gốc động vật thông dụng hiện nay 8

Hình 2.4 Sơ đồ các bước xúc tác cơ bản của nhóm serine protease 8

Hình 2.5 Hình dạng các gốc amino acid ở các túi khác nhau của serine protease 9

Bảng 3.1 Phương pháp phân tích và đo đạc kết quả được sử dụng 20

Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 22

Hình 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 24

Hình 3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 25

Hình 3.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3 28

Hình 4.3 Ảnh hưởng của các thừa số khảo sát (tương tác đơn, tương tác đa) đến quá trình trích ly protease từ thịt đầu tôm sú 34

Hình 4.4 Đồ thị biểu diễn sự tương tác của nhiệt và thời gian đến hoạt tính của enzyme protease được chiết tách 35

Hình 4.5 Đồ thị biểu diễn sự tương tác của nhiệt độ và thời gian trích ly đến hoạt tính của enzyme protease được chiết tách 36

Hình 4.6 Đồ thị tương quan giữa họat tính protease xác định bằng thực nghiệmvà tính toán theo phương trình hồi quy 36

Hình PL1 Đường chuẩn Tyrosine xx

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần hóa lý cơ bản của thịt đầu tôm sú 5

Bảng 2.2 Một số serine protease có nguồn gốc động vật thông dụng hiện nay 7

Bảng 3.1 Ma trận quy hoạch thực nghiệm quá trình trích ly protease từ thịt đầu tôm 27

Hình 4.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu và dung môi đến quá trình trích ly protease từ thịt đầu tôm sú 30

Bảng 4.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH ứng với dung môi đến hiệu quả trích ly protease 32

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của các nhân tố mã hóa đối với phương trình hồi quy 33

Bảng PL1 Xây dựng đường chuẩn nồng độ tyrosine ix

Bảng PL2 Phương pháp xác định lượng tyrosine trong mẫu x

Bảng PL3 Bố trí thí nghiệm xây dựng đường chuẩn tyrosine xix

Bảng PL4 Số liệu xây dựng đường chuẩn tyrosine xix

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Ứng dụng enzyme trong chế biến thực phẩm và nhiều lĩnh vực khác đã và đang là một trong những vấn đề mang tính cấp thiết và có ý nghĩa thực tiễn Hiện nay, các nước phát triển đang áp dụng các chế phẩm enzyme trong sản xuất để tạo ra những sản phẩm có năng suất và chất lượng cao với giá thành hạ (Saurel, 2003; Suutarinenn và Autio, 2004; Ngô Tiến Hiển, 2001) Việt Nam là nước giàu tiềm năng về nông sản, nhu cầu các loại enzyme phục vụ trong chế biến thực phẩm là rất lớn Tuy nhiên, ở Việt Nam hoàn toàn không có xưởng sản xuất chế phẩm enzyme, hàng năm nước ta vẫn phải nhập ngoại một khối lượng lớn những loại enzyme này (Đặng Thị Thu và Nguyễn Thị Xuân Sâm, 2009b)

Protease là enzyme thủy phân có giá trị thương mại rất lớn, chiếm khoảng 60% tổng lượng enzyme công nghiệp được cung cấp trên thị trường thế giới (Joo và Chang, 2006) với nhiều ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp, nông nghiệp, mỹ phẩm và đặc biệt trong y học hiện hiện đại (Joo và Chang, 2006 ; Nedra

et al., 2011) Hơn thế nữa, các nghiên cứu ứng dụng protease gần đây đã chỉ ra vai

trò tích cực của việc sử dụng các protease trung tính và đặc biệt là protease ưa kiềm trong việc tầm soát các bệnh liên quan đến sự nghẽn mạch do sự đông tụ của fibrin

(Phan Thị Bích Trâm et al., 2007) hay ứng dụng trong thủy phân protein, làm mềm

thịt (Heu và Kim, 2002), thủy phân tạo dịch trích protein từ phụ phẩm cá (Prasertsan và Prachumratana, 2013), khử protein trong phụ phẩm tôm, giúp quá

trình chiết tách chitin, chitosan đạt hiệu quả tốt (Nedra et al., 2011) Chính điều này

đã mở ra triển vọng cho việc nghiên cứu trích ly enzyme protease từ thịt đầu tôm sú, giúp tận dụng triệt để lượng phụ phẩm của tôm trong quá trình chế biến và tăng hiệu quả kinh tế cho ngành thủy sản nói chung, ngành xuất khẩu tôm nói riêng

Với tỷ lệ đầu tôm được loại bỏ trong quá trình chế biến khoảng 34% khối lượng

ban đầu (Tran et al., 2011), trung bình hàng năm Việt Nam có khoảng 35.000 ÷

46.000 tấn đầu tôm được thải ra từ các nhà máy Hiện nay, lượng đầu tôm chủ yếu dùng làm phân bón, thức ăn gia súc, thủy sản Tuy nhiên giá trị thành phẩm của các sản phẩm này chưa cao Việc nghiên cứu sản xuất chitosan từ vỏ đầu tôm trong thời gian gần đây là một hướng mới nhằm sử dụng có hiệu quả nguồn đầu tôm phụ phẩm, đây được xem như là một loại bao bì có tính năng bảo vệ và có thể

sử dụng như thực phẩm mà không hề ảnh hưởng đến môi trường chung quanh

(Trung et al., 2003) Tuy nhiên, việc sản xuất chitosan đòi hỏi phải loại bỏ lượng

thịt trong đầu tôm (chiếm đến 15,25% khối lượng đầu tôm và 5,5% so với nguyên

liệu tôm sú tươi), tạo ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường Chính vì thế, yêu cầu đặt ra là nghiên cứu biện pháp sử dụng nguồn nguyên liệu giàu protein và enzyme protease nhằm nâng cao giá trị thương phẩm của tôm sú, đồng thời làm giảm tác động ô nhiễm môi trường do quá trình xử lý đầu tôm gây ra là vấn đề có tính cấp thiết

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Mục đích chung của đề tài là xác định một số yếu tố cơ bản có ảnh hưởng đến hiệu quả trích ly protease từ thịt đầu tôm sú Để đạt được mục tiêu đã được đặt ra, đề tài tập trung vào các nội dung cụ thể sau:

 Xác định tỷ lệ nguyên liệu và dung môi (w/v) trích ly protease thích hợp

 Xác định pH của dung môi thích hợp giúp gia tăng hiệu quả trích ly protease

 Tối ưu hóa nhiệt độ và thời gian trích ly protease từ thịt đầu tôm sú

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 THỊT ĐẦU TÔM SÚ - NGUỒN NGUYÊN LIỆU LY TRÍCH ENZYME PROTEASE

2.1.1 Tôm sú – nguồn thủy sản lạnh đông xuất khẩu

2.1.1.1 Tổng quan

Tôm sú (có tên khoa học là Penaeus monodon, Fabricius, 1798, trích dẫn bởi

Holthuis, 1980) là loài sống ở nơi đáy bùn pha cát với độ sâu từ ven bờ đến 40 m nước Khi tôm trưởng thành thường di chuyển xa bờ vì chúng thích sống vùng nước sâu hơn

Tôm sú được phân loại như sau:

(Holthuis, 1980)

Hình 2.1 Tôm sú Penaeus monodon

(Nguồn: http://healthyrecipes.wikia.com/wiki/File:Black_Tiger_Prawn_Jumbo_Size.jpg)

2.1.1.2 Tình hình sản xuất tôm đông lạnh ở Việt Nam

Tôm đông lạnh đã và đang là một mặt hàng xuất khẩu có kim ngạch cao ở Việt Nam

và đang cạnh tranh mạnh mẽ với thị trường xuất khẩu lớn trên thế giới đặc biệt Thái Lan đang gặp khó khăn do vấn đề tôm bệnh Hơn thế nữa, nguồn cung tôm thế giới

bị hạn chế bởi sản lượng tôm từ Thái Lan giảm mạnh do ảnh hưởng của EMS khiến giá tôm tăng trên toàn cầu Nhờ đó, giá trị xuất khẩu tôm Việt Nam sang các thị trường lớn tăng lên

Trong đó, tôm sú là sản phẩm chính, chiếm hơn 50% tổng lượng tôm xuất khẩu trong cả nước Theo số liệu của VASEP (2010), tổng khối lượng xuất khẩu của mặt hàng tôm sú là 121.399 tấn, chiếm 10,44% tổng giá trị xuất khẩu thủy sản trong cả nước và 56,7% tổng giá trị xuất khẩu ngành tôm Đến cuối tháng 6 năm 2013, tổng lượng xuất khẩu tôm sú có sụt giảm, nhưng vẫn là ngành hàng chủ lực nhất Trong

đó, mặt hàng tôm sú bỏ đầu HLSO là sản phẩm được ưa chuộng trên nhiều thị trường, đặc biệt trên thị trường Nhật Bản Tôm sú HLSO Việt Nam cỡ 16/20 cuối tháng 6/2013 tăng thêm 5,5 USD/kg so với tháng 1/2013, từ 10,72 USD/kg lên 16,23 USD/kg Tôm sú HLSO cỡ 16/20 từ Ấn Độ cũng tăng thêm gần 5 USD/kg, từ 11,03 USD/kg lên 15,95 USD/kg

(Nguồn: khau-tom-Viet-Nam.htm)

http://www.vasep.com.vn/Tin-Tuc/378_30440/Hien-trang-va-tiem-nang-thi-truong-xuat-Tình hình hiện nay mở ra hướng khai thác nguồn thịt đầu tôm sú dồi dào này cho chế biến các sản phẩm giá trị gia tăng, nâng cao giá trị của con tôm sú ở Việt Nam

2.1.2 Thực trạng xử lý và tiêu thụ thịt đầu tôm sú ở nước ta

Kết quả phân tích thành phần hóa học cơ bản của thịt đầu tôm sú (bảng 2.1) cho thấy, đây chính là nguồn giàu protein, đồng thời thịt đầu tôm có giá trị pH khá cao (7,3) khi so sánh với pH của thịt tôm tươi (pH = 6,8 ÷ 6,9; Nguyễn Xuân Phương, 2003) Điều này cho thấy, thịt đầu tôm rất dễ chịu sự tấn công của các vi sinh vật

và các biến đổi sinh hóa, hóa học gây hư hỏng (Tran et al., 2011)

Bảng 2.1 Thành phần hóa lý cơ bản của thịt đầu tôm sú

(Nguồn: Tran et al., 2011)

Một trong những ứng dụng phổ biến nhất là sử dụng đầu tôm trong chế biến chitin,

chitosan Ngô Thị Hoài Dương et al., 2008 cũng đã nghiên cứu đưa ra giải pháp tiền

xử lý bằng acid formic trong quy trình sản xuất chitosan từ đầu tôm nhằm giảm thiểu lượng hóa chất và chất thải gây ô nhiễm môi trường Nguyễn Văn Thiết và Đỗ Ngọc Tú (2008) đã nghiên cứu tách chiết chitin từ đầu – vỏ tôm bằng các phương pháp sinh học (sử dụng Bromelanin trong dịch ép vỏ dứa) Nhiều nghiên cứu trong nước đã tận dụng nguồn đầu tôm chủ yếu cho chế biến thức ăn gia súc Phan Thị Bích Trâm và Phạm Thu Cúc (2004) đã xác nhận thành công của việc xử lý vỏ đầu tôm với rỉ đường và enzyme dùng làm thức ăn cho gia súc, gia cầm Trịnh Ngọc

Vinh (2006) đã tiến hành ủ chua đầu vỏ tôm có thêm vi khuẩn Lactobacillus spp

giúp quá trình lên men được nhanh hơn Sau đó, khảo sát nồng độ đường, nồng độ

muối, nồng độ vi khuẩn Lactobacillus spp thích hợp trong việc bảo quản đầu vỏ

tôm bằng phương pháp lên men ủ chua Qua đó, góp phần tạo ra sản phẩm thức ăn gia súc có chất lượng cao hơn, có tính phổ biến rộng rãi, giá trị kinh tế cao và giảm thiểu việc gây ô nhiễm môi trường Phạm Thị Đan Phượng và các cộng sự (2008) cũng đã nghiên cứu xử lý carotenoprotein thu hồi từ quá trình sản xuất chitin và bước đầu thử nghiệm phối trộn thức ăn cá

Các nghiên cứu này đều cho thấy tầm quan trọng của việc ứng dụng một hệ enzyme protease nhằm trợ giúp cho quá trình thủy phân dịch protein có sẵn trong nguồn nguyên liệu đầu tôm này là cần thiết Đặc biệt, việc trích ly enzyme protease có sẵn trong nội tại của đầu tôm là vấn đề có ý nghĩa quan trọng

2.2 KHÁI QUÁT VỀ PROTEASE VÀ HỆ PROTEASE TRONG THUỶ SẢN

2.2.1 Tổng quan về protease

2.2.1.1 Khái niệm enzyme protease

Protease là nhóm enzyme xúc tác phản ứng thủy phân liên kết peptide của protein:

Hình 2.2 Phản ứng thủy phân liên kết peptide do tác động của protease

(Barrett, 2001)

2.2.1.2 Phân loại enzyme protease

Việc phân loại nhóm enzyme protease được thay đổi qua các thời kỳ (Barrett, 2001) Theo Grassmann và Dyckerhoff, 1928 (trích dẫn bởi Barrett, 2001) protease phân chia thành proteinase và peptidase Theo Bergmann và Ross (1936, trích dẫn bởi Barrett, 2001) gọi chung việc thủy phân liên kết peptide nên sử dụng danh từ peptidase và được chia thành hai nhóm là endopeptidase và exopeptidase Dựa trên việc phân tích nghĩa rộng và nghĩa hẹp của từ “peptidase” nên để tránh nhầm lẫn theo yêu cầu của IUBMB protease được coi là peptidase nhưng chia làm hai loại là endopeptidase (proteinase) và exopeptidase Năm 1960, Hartley (trích dẫn bởi Phan Thị Bích Trâm, 2010) đã phân loại enzyme thủy phân protein theo bốn nhóm dựa theo tên hóa học các amino acid tham gia vào tâm vị trí xúc tác:

- Aspartic peptidase là những protease chứa nhóm carboxyl (-COOH) trong trung tâm hoạt động, tác động lên liên kết peptide tạo phức hợp trung gian bằng liên kết không cộng hóa trị giữa enzyme và cơ chất Các nhóm carboxyl này thuộc mạch bên R của aspartic, glutamic hoặc có thể là nhóm carboxyl đầu C của chuỗi polypeptide Aspartic peptidase thường hoạt động trong vùng pH acid và bị ức chế đặc hiệu bởi pepstatin

- Cysteine peptidase: Các enzyme thuộc nhóm này có nhóm thiol (-SH) của cysteine trong trung tâm hoạt động, tác động lên nhóm –CO của liên kết peptide tạo phức hợp trung gian thiolacyl-enzyme Các cysteine peptidase thường hoạt động mạnh ở vùng pH trung tính, chúng chỉ hoạt động khi nhóm thiol ở trạng thái không bị bao vây Do đó các chất như cysteine, acid ascorbic thường có tác dụng làm bền và hoạt hóa enzyme này Cystatin, leupeptin là các chất ức chế thuận nghịch và E64 chất ức chế không thuận nghịch cho nhóm cysteine peptidase rất thông dụng hiện nay

- Kim loại peptidase là những protease trong trung tâm hoạt động có chứa các ion kim loại trực tiếp tham gia phản ứng, chúng tác động lên liên kết peptidase tạo phức hợp trung gian bằng liên kết không cộng hóa trị giống như nhóm aspartic peptidase Nhóm kim loại peptidase hoạt động mạnh nhất

ở vùng pH trung tính và bị giảm hoạt tính dưới tác dụng của EDTA

- Serine peptidase: Là những protease có nhóm hydroxyl (-OH) của serine trong trung tâm hoạt động Các peptidase serine này thường là hoạt động ở vùng pH khá rộng từ trung tính đến kiềm, nhóm –OH của serine tác động lên nhóm –CO của liên kết peptide tạo hợp chất trung gian acyl-enzyme Các enzyme thuộc nhóm này thông dụng nhất là trypsin và chymotrypsin Chúng

bị ức chế bất thuận nghịch dưới tác dụng diisopropyl-phosphofluoridate (DFP), phenylmethanesulfonyl flouride (PMSF), coumarin và một số chất ức chế thuận nghịch như antitrypsin ở đậu nành (SBTI), aprotinin, chymostatin Trong các nhóm protease được phân loại, ứng dụng rộng rãi ở nhiều lãnh vực nhất là nhóm serine protease do chúng có khả năng thích ứng trong khoảng

pH khá rộng từ trung tính đến kiềm mạnh đã làm tăng khả năng ứng dụng nhóm enzyme này so với các nhóm protease khác Đặc biệt được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp thuộc da và chất tẩy rửa Hiện nay nhóm serine protease đã được phát hiện và nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác nhau với các tên thông dụng ở bảng 2.2

Hình 2.3 Cơ chế xúc tác của endopeptidase và exopeptidase

(Nguồn: Đặng Thị Đăng Phương, 2005)

Bảng 2.2 Một số serine protease có nguồn gốc động vật thông dụng hiện nay

Hệ thống tiêu hóa ở động vật và một số loài khác

Hệ thống tiêu hóa ở động vật và một số loài khác

Hệ thống tiêu hóa ở động vật và một số loài khác Máu

Trung tâm hoạt động của nhóm enzyme này chứa các amono acid aspartic, histidine và serine trong đó serine giữ vai trò trực tiếp gắn với cơ chất theo cơ chế được trình bày ở Hình 2.4

Hình 2.4 Sơ đồ các bước xúc tác cơ bản của nhóm serine protease

(Nguồn: Phan Thị Bích Trâm, 201 1 )

Cơ chế theo hình 2.4 gồm 3 phản ứng:

Phản ứng 1: Nhóm –OH của serine trong trung tâm hoạt động enzyme kết hợp với nhóm C=O của liên kết peptide trong chuỗi polypeptide tạo phức hợp chuyển tiếp

tứ diện (tretahedral complex)

Phản ứng 2: Ở trạng thái phức hợp chuyển tiếp tứ diện thường kém bền nên chuyển diện tích lên O tạo nhóm C=O mới làm đứt liên kết peptide giải phóng mạch polypeptide đầu N và hình thành các hợp chất trung gian acyl-enzyme mới Phản ứng 3: Với sự có mặt của nước sẽ giải phóng mạch polypeptide đầu C còn lại

và khôi phục trung tâm hoạt động của serine protease

Như vậy, ngoài cơ chế chung các enzyme thuộc nhóm này có tính chất cắt riêng biệt là do trong phân tử protein có một “túi” (pocket) luôn được định vị gần trung tâm hoạt động nhóm serine (Hình 2.5)

Hình 2.5 Hình dạng các gốc amino acid ở các túi khác nhau của serine protease

(Nguồn: Phan Thị Bích Trâm, 201 1 )

Hình dạng và sự tích điện của túi khác nhau sẽ cho các vị trí cắt chuyên biệt của từng serine protein khác nhau

Chymotrypsine với túi chỉ chứa các nhánh amino acid kỵ nước vì vậy nhóm này chỉ thích hợp với các mạch bên -R của phenylalanin, tryptophan, tyrosine của chuỗi polypeptide

Trypsine với các túi chứa aspartic ở vị trí trong cùng nên chỉ thích hợp với các mạch bên R của các amino acid tích điện dương như arginine, lysine

Elastase với túi chứa hai phân tử valine nên chỉ chứa đủ các amino acid của mạch bên R như glycine, alanine và valine

Plasmin thuộc nhóm serine protease (EC 3.4.21.7) là enzyme quan trọng có mặt trong máu để thủy phân các cục máu nghẽn fibrin, hoạt động giống trypsine có khả năng thủy phân các liên kết peptide có mạch bên R của asginine và lysine trong chuỗi polypeptide

(Gupta et al., 2002)

2.2.3 Protease của tôm sú

Sự tiêu hoá và trao đổi chất protein và các hợp chất nitơ khác giữa các loài giáp xác khác nhau rất nhiều Hầu hết, các cơ chế tiêu hoá và hấp thụ khác với động vật có xương sống Các enzyme tiêu hoá, đặc biệt các enzyme tiêu hoá protein ở giáp xác nói chung và của tôm nói riêng khá giống với enzyme có trong dạ dày của cá Các protease tìm thấy trong tôm bao gồm carboxypeptidases A và B, trypsine,

chymotrypsine, cathepsine, và collagenase (Hernandez - Cortes et al., 1997; Honjo

et al., 1990; Kim et al., 1992; Liu and Cheung 1989; Nip et al., 1985; Roy et al., 1996; Tsai et al., 1986; Van Worrnhoudt et al., 1992)

Protease của tôm cũng như của các loài động vật thuỷ sinh khác là các protease nội bào, nó tập trung nhiều nhất ở cơ quan tiêu hoá, sau đó đến nội tạng và cơ thịt Đặc biệt ở tôm do đặc điểm hệ tiêu hoá nội tạng nằm ở phần đầu nên hệ enzyme sẽ tập trung nhiều nhất ở phần đầu sau đó đến các cơ quan khác

Phần lớn các nhóm enzyme thuộc protease của tôm thường có tính chất chung của một enzyme:

- Hòa tan được trong nước, dung dịch nước muối sinh lý đệm phosphate trung tính, đệm Tris-HCl và một số dung môi hữu cơ nên dựa vào những đặc tính này để tách chiết chúng

- Bị kết tủa thuận nghịch bởi một số muối trung hòa (sulfate amonium), ethanol, acetone… để thu nhận chế phẩm enzyme

- Hoạt tính của enzyme có thể tăng hoặc giảm dưới tác dụng của các chất hoạt hóa hay ức chế

- Độ hoạt động của enzyme chịu ảnh hưởng rất lớn bởi các yếu tố: Nhiệt độ,

pH môi trường

Theo kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Trân Châu (1993) về protease đầu tôm biển

và Nguyễn Thị Mỹ Trang (2004) về protease đầu tôm bạc nghệ cho thấy các enzyme tiêu hoá protein là các enzyme hoạt động mạnh trong môi trường kiềm

Theo Nguyễn Việt Dũng (1999) thì protease của tôm sú lại thể hiện hoạt tính cao ở môi trường gần trung tính

Để ly trích protease từ đầu tôm sú, môi trường được sử dụng tương tự nhau Theo một số nghiên cứu cho thấy, hoạt tính protease trên một đơn vị khối lượng nội tạng cao hơn nhiều so với đầu tôm ở cùng chế độ tách chiết (gấp từ 3,41 ÷ 4,33 lần) Điều này dễ hiểu vì nội tạng tôm là cơ quan tiêu hóa nên tập trung nhiều enzyme, còn đầu tôm thì lại có thêm cả phần vỏ và thịt tôm có ít hoạt tính sinh học Hoạt tính protease cao của nội tạng tôm cũng giúp giải thích, sự hư hỏng xảy ra thường thấy nhất ở tôm là hiện tượng long đầu, và thời gian bảo quản tôm đã bỏ đầu, tách chỉ bao giờ cũng dài hơn tôm nguyên con ở cùng điều kiện chế biến và bảo quản (Nguyễn Lệ Hà, 2011)

Protease đầu tôm đều thể hiện hoạt tính rất yếu ở vùng acid, đạt cực đại ở vùng trung tính pH = 7 và giảm dần khi pH tăng trong vùng điều kiện, điều này phù hợp với đặc điểm của hệ enzyme tôm là không có pepsin hoạt động trong môi trường

acid (Baranowski et al., 1984) Protease từ nội tạng tôm nhạy cảm với pH hơn và

protease từ đầu tôm còn nhạy cảm hơn nữa, việc tăng nhẹ pH trong vùng điều kiện cũng làm hoạt tính của chúng giảm đáng kể

2.2.4 Khả năng ứng dụng protease

2.2.4.1 Các ứng dụng cơ bản

Protease là nhóm enzyme được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp chế biến thực phẩm, y học, nông nghiệp, công nghiệp thuộc da, công nghiệp sản xuất xà phòng

- Trong chế biến thực phẩm: Sử dụng nhiều nhất để cải tiến công nghệ sản xuất nước mắm hoặc nước tương từ các chế phẩm cá, bánh dầu đậu nành bằng việc bổ sung protease từ giai đoạn thô sơ dùng dịch chiết mủ đu đủ xanh, vỏ dứa, ruột cá, ruột lợn đến giai đoạn cao hơn dùng chế phẩm enzyme thêm vào quá trình thủy phân như chế phẩm bromelain, papain, ficin, chế

phẩm protease từ nấm mốc A oryzae, vi khuẩn Bacillus subtilis hoặc nấm sợi

và cả các chế phẩm từ đầu tôm Những kết quả nghiên cứu cho thấy khi bổ sung protease vào cá thì hàm lượng đạm amin tăng cao, quá trình thủy phân nhanh hơn nên rút ngắn được thời gian chế biến nước mắm

- Một lĩnh vực khác nghiên cứu sản xuất bột đạm cao cấp cho trẻ em và người lớn tuổi từ bột đậu nành sử dụng chế phẩm prozima có chứa bromelain để cải biến kích thước phân tử protein và xử lý các protein ức chế tiêu hóa có sẵn trong nguyên liệu, hoặc sử dụng các protease thương mại Alcalase, Novozyme, Flavourzyme thủy phân bột đậu nành tách béo nhằm làm tăng

thủy phân làm giảm thiểu sự hoạt động của vi sinh vật Ngoài ra, enzyme protease còn được sử dụng trong các lĩnh vực chế biến thực phẩm khác như làm phomat, làm mềm thịt…

- Trong y học: Một số protease như trypsine, -chymotrypsine dùng sản xuất thuốc chữa bệnh kém tiêu hóa, tiêu mủ các ổ viêm, làm thông đường hô hấp rất thông dụng trên thị trường dược phẩm Nghiên cứu chế phẩm protease có tên gọi “prozimabo” trong điều trị bỏng giúp giả mạc rụng nhanh, vết bỏng nhanh khỏi Đặc biệt hiện nay protease được ứng dụng trong điều trị bệnh tim mạch, chúng rất đa dạng và có nguồn gốc khác nhau: Từ động vật, thực vật, đến vi sinh vật, chúng thuộc nhóm serine protease có khả năng thủy phân fibrin, fibrinogen

- Trong nông nghiệp: Protease được bổ sung vào thức ăn động vật nuôi nhằm tăng khả năng tiêu hóa, chúng được xử lý trực tiếp vào thức ăn trước khi sử dụng hoặc xử lý sơ bộ thức ăn Hiện nay, các chế phẩm vi sinh chứa hỗn hợp protease và các enzyme thủy phân khác cũng được sử dụng cho ngành nuôi trồng thủy sản làm tăng hệ số tiêu hóa, làm giảm thiểu sự ô nhiễm môi trường nước nuôi

Ngoài ra protease còn ứng dụng rộng rãi trong một số ngành khác như công nghiệp thuộc da để làm mềm da, tăng cường khả năng tách lông ra khỏi da nhưng không làm ảnh hưởng đến chất lượng da Trong công nghệ sản xuất xà phòng làm tăng khả năng tẩy vết bẩn có thành phần là protein

(Phan Thị Bích Trâm, 201 1 )

2.2.4.2 Ứng dụng của protease kiềm nguồn gốc động vật

Protease ưa kiềm là nguồn cung cấp enzyme chủ yếu trên thị trường enzyme thế giới (Godfrey và West, 1996) Bên cạnh nguồn protease ưa kiềm nguồn gốc vi khuẩn được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực công nghiệp, điển hình như Alkazym (Novodan, Conpenhagen, Đan Mạch), Tergazyme (Alconox, NewYork, USA), Ultrasil (Henkel, Dusseldorf, Đức), còn có nhiều enzyme nguồn gốc động vật, điển hình như Pronod 153 L được ly trích từ máu, keratin protease (trích ly từ

da, lông heo) cũng được biết đến với nhiều ứng dụng trong lĩnh vực sản xuất xà phòng, xử lý chất thải, ứng dụng trong chế biến thức ăn gia súc nhờ vào việc thủy phân dịch protein các phụ phẩm của thủy sản

2.3 CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA VIỆC TRÍCH LY PROTEASE TỪ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

2.3.1 Lý thuyết chung

Giai đoạn đầu của quá trình tách chiết enzyme là thu nhận dịch chiết từ một vật liệu sinh học nghiền nát sơ bộ nào đó (bột, mầm thóc, hạt nảy mầm, một mô động vật nào đó, một sinh khối vi khuẩn hoặc nấm…) trong dịch chiết đương nhiên chứa protein và enzyme

Trong việc nghiên cứu enzyme người ta thường hay sử dụng dịch nghiền đồng thể

Để thu nhận loại dịch này khối vật liệu sinh học được rửa sạch và nghiền trong cối hoặc trong một thiết bị chuyên dụng Trong khi nghiền người ta thêm nước hoặc dung dịch đệm và kính nghiền nát để giúp phá vỡ tế bào Sản phẩm thu được sau khi nghiền được gọi chung là dịch đồng thể Trong khối dịch này chứa các mãnh tế bào, nhân, lục lạp của lá, ty thể và các bộ phận khác của tế bào như sắc tố, protein hòa tan…

Dịch nghiền sau đó được ly tâm phân đoạn ở các tốc độ tăng dần khác nhau Để thu nhận các enzyme trong dịch chiết hoặc từ các phân đoạn dưới tế bào có thể dùng nước, dung dịch đệm, dung dịch muối, hỗn hợp glycerine với nước hoặc dung môi hữu cơ Cho đến nay không có phương pháp ly trích và tinh sạch chung cho các enzyme Để tách và tinh chế một enzyme nào đó cần biết lựa chọn và phối hợp một cách có hiệu quả nhất các biện pháp khác nhau

(Mai Xuân Lương, 2004)

Quá trình ly trích enzyme từ cơ chất rắn, dựa trên sự phân tách cấu tử (enzyme) từ chất rắn (nguyên liệu) do tác động của dung môi, tuân theo định luật Fick (McCable

J*Az: Thông lượng chất khuếch tán A theo phương z, kgmolA/ m2.giây

DAB: Hệ số khuếch tán của chất A vào B (dung môi), m2/giây

xA: Phân mol chất A trong hệ thống

z: Khoảng cách khuếch tán (m)

Dấu (-) về mặt vật lý nghĩa là quá trình khuếch tán xảy ra theo chiều giảm nồng độ của chất khuếch tán

Nói cách khác, vận tốc truyền của một quá trình truyền tỷ lệ thuận với động lực của

quá trình và tỷ lệ nghịch với trở lực của quá trình (McCabe et al., 1993) Động lực

của quá trình ly trích enzyme phụ thuộc vào sự chênh lệch nồng độ chất tan giữa dung môi và cơ chất rắn (Lonsane và Krishnaiah, 1992); chịu sự chi phối của mức

độ xuyên thấu của dung môi vào cơ chất (mô tế bào động vật, nguyên liệu sử dụng trích ly enzyme) hay khoảng cách khuếch tán – trở lực của quá trình ly trích (Harris, 1995)

Dựa trên phương trình (2.1), hiệu quả của quá trình ly trích phụ thuộc vào một số yếu tố cơ bản:

- Sự chênh lệch nồng độ

- Diện tích tiếp xúc

- Khả năng hòa tan của chất tan (hay enzyme) vào dung môi

- Độ nhớt của dung môi

- Khả năng khuếch tán của dung môi vào bên trong cơ chất rắn

Nói cách khác, đặc điểm của nguồn nguyên liệu – một trong những động lực thúc đẩy sự chênh lệch nồng độ của enzyme trong cơ chất và dung môi, các điều kiện

ly trích như loại dung dịch đệm, pH của dung dịch sử dụng ly trích, thời gian cũng như nhiệt độ ly trích là những yếu tố có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả thu hồi enzyme

2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly của enzyme

2.3.2.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi và nguyên liệu

Sự chênh lệch nồng độ chất tan giữa dung môi và canh trường bề mặt sau lên men càng lớn sẽ thúc đẩy quá trình khuếch tán chất tan ra ngoài dung môi càng tăng

(McCabe et al., 1993) Khi tỷ lệ dung môi và cơ chất thấp, không đủ xâm nhập vào

toàn bộ mẫu sử dụng để trích ly (Lonsane và Krishnaiah, 1992), không đủ cho sự khuếch tán chất tan (enzyme) vào dung môi Hơn nữa, một lượng dung môi sẽ được giữ lại trong nguyên liệu cũng là nguyên nhân làm giảm hiệu quả thu nhận

chất tan (Rao, 2010), hiệu quả thu nhận enzyme thấp Tuy nhiên, tỷ lệ dung môi và nguyên liệu cao, không những hoạt tính enzyme bị pha loãng mà còn tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật hoạt động làm ảnh hưởng đến chất lượng của protein hay enzyme trích ly

2.3.2.2 Ảnh hưởng của pH môi trường

Sự thay đổi pH ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính enzyme do liên quan đến sự tương tác giữa enzyme và cơ chất Phản ứng xúc tác phụ thuộc vào diện tích phân bố trên

cả enzyme lẫn cơ chất, cụ thể là trung tâm hoạt động của phân tử enzyme Mỗi enzyme chỉ hoạt động mạnh nhất ở một pH xác định, gọi là pH tối ưu pH tối ưu cho hoạt động của các enzyme có nguồn gốc động vật, điển hình như protease từ nội tạng cá tra (Trần Quốc Hiền và Lê Văn Việt Mẫn, 2006) hay từ thịt đầu tôm sú (Nguyễn Lệ Hà, 2011) vào khoảng 7 Giá trị pH quá cao hay quá thấp có thể làm enzyme bị biến tính Giá trị pH tối ưu của mỗi enzyme có thể thay đổi trong một khoảng nhất định tùy theo tính chất và nồng độ cơ chất, nhiệt độ và bản chất của các loại dung dịch đệm (Phan Thị Bích Trâm, 2010)

2.3.2.3 Tác động của nhiệt độ và thời gian trích ly

Bản chất của enzyme là protein do đó nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến vận tốc phản ứng Nhiệt độ tăng kéo theo tốc độ phản ứng tăng nhưng đến mức nào đó thì tốc độ phản ứng giảm xuống do enzyme bị biến tính Đa số enzyme có nhiệt độ tối

ưu khoảng 40 ÷ 50 °C Ở nhiệt độ trên 70 °C, phần lớn enzyme đều mất hoạt tính Nhiệt độ tối ưu của các enzyme khác nhau thì không giống nhau, chúng tùy thuộc vào nguồn gốc sản sinh ra chúng Phần lớn nhiệt độ tối ưu của enzyme từ vi sinh vật, thực vật cao hơn động vật Nhiệt độ tối ưu của những enzyme không cố định

mà thay đổi theo thời gian thủy phân, nồng độ enzyme, cơ chất phản ứng và dạng tồn tại của enzyme (Rao, 2010)

Ngoài ra, thời gian trích ly cũng là một trong những yếu tố có ảnh hưởng đáng kể đến hoạt tính enzyme Việc gia tăng nhiệt độ ly trích có tác động tích cực trong việc gia tăng tính tan của dung môi, làm tăng vận tốc chuyển động và thúc đẩy quá trình thẩm thấu dung môi vào cơ chất và gia tăng khả năng khuếch tán, hay ly trích protease Tuy nhiên, nhiệt độ ly trích cao có thể là nguyên nhân dẫn đến sự kém ổn định và ức chế hoạt động của enzyme Điều này cũng xảy ra với trường hợp thời gian ly trích dài Thời gian thủy phân nhanh hay chậm còn phụ thuộc vào nhiều yếu

tố như kích thước nguyên liệu cấu trúc loại protein, tác động đến sự khuếch tán enzyme vào dung môi, khi enzyme phải xuyên qua khoảng trống bên trong với

đường đi quanh co, kết quả là khoảng cách khuếch tán dài (McCabe et al., 1993) Ở

cùng tỷ lệ dung môi sử dụng, thời gian ly trích ngắn sẽ không đủ cho quá trình

ngấm dung môi vào nguyên liệu để khuếch tán enzyme, giảm hiệu suất thu nhận enzyme (Rao, 2010)

2.4 QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN TRÍCH LY THÍCH HỢP BẰNG PHƯƠNG PHÁP BỀ MẶT ĐÁP ỨNG (RSM)

Phương pháp bề mặt đáp ứng với mô hình phức hợp tại tâm (CCD) thường được sử dụng để mô phỏng điều kiện hoạt động tối ưu của một quá trình thông qua các phương pháp thực nghiệm Cấp độ khác nhau hoặc các giá trị của điều kiện hoạt động bao gồm các yếu tố trong mỗi thí nghiệm Các yếu tố này có thể là yếu tố phân loại (ví dụ nguồn nguyên liệu sử dụng) hay định lượng (tỷ lệ thành phần khảo sát, nhiệt độ,…) Tuy nhiên, trong thực tế, các biến phân loại phải được xử lý một cách riêng biệt bằng cách so sánh các điều kiện hoạt động tốt nhất đối với các biến định lượng qua sự kết hợp khác nhau (Lenth, 2011)

Sử dụng phương pháp bình phương nhỏ nhất và các nội dung phân tích hồi quy, phân tích phương sai để xác định giá trị của các hệ số trong phương trình hồi quy đa thức Tùy theo loại thực nghiệm mà phương trình hồi quy là tuyến tính hay phi tuyến (Giovanni, 1983) Các dạng phương trình hồi quy thường áp dụng đối với lĩnh vực công nghệ hóa học và công nghệ sinh học gồm:

Phương trình bậc hai tuyến tính:

xj: Là nhân tố được mã hóa ảnh hưởng đến y

bj: Là hệ số tuyến tính hay hệ số hồi quy bậc 1 mô tả ảnh hưởng của nhân tố xj

Mô hình thống kê thực nghiệm chỉ có thể sử dụng sau khi đã thỏa mãn các tiêu

chuẩn thống kê (Student và Fisher) (Cheynier et al., 1983)

2.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ TRÍCH

LY VÀ ỨNG DỤNG CỦA PROTEASE NGUỒN GỐC ĐỘNG VẬT 2.5.1 Nghiên cứu trong nước

Nghiên cứu trích ly proease từ các nguồn động vật đã bắt đầu được quan tâm trong thời gian gần đây Nguyễn Lệ Hà (2011) đã tiến hành nghiên cứu tách chiết và ứng

dụng enzyme protease từ tôm sú Penaeus monodon vào chế biến thủy sản Kết quả

thu nhận enzyme protease tinh sạch Chế phẩm enzyme (CPE) protease từ đầu (hoặc gan tụy) tôm sú có thể thu nhận được qua các bước cơ bản: Chiết rút enzyme từ nguyên liệu đã nghiền nhỏ bằng Tris-HCl 0,05 M pH 7,5 với tỉ lệ 1: 3 (w/v), thời gian chiết 40 phút (đối với đầu tôm) và 60 phút (đối với gan tụy) Dịch chiết (DC) thu được bằng cách cho qua rây có lỗ với kích thước 1 mm2 để loại lượng lớn vỏ tôm, sau đó ly tâm 6000 vòng/phút (rpm), 15 phút, loại cặn đem làm thức ăn gia súc Kết tủa DC bằng ethanol với nồng độ 80%, 50 phút để điều chế CPE từ đầu tôm hoặc bằng (NH4)2SO4 70%, 70 phút để thu CPE từ gan tụy tôm Công đoạn ly tâm thu CPE cũng được thực hiện ở 6000 rpm trong 15 phút

Trước đó, Trần Quốc Hiền và Lê Văn Việt Mẫn (2006) cũng đã đề xuất thu nhận

chế phẩm enzyme protease từ ruột cá basa (Pangasius bocourti) Dịch chiết

protease kiềm thu được từ ruột có tổng hoạt tính cao nhất là 15,79 UI/gCKNT (chất khô nội tạng) trong điều kiện tỷ lệ mẫu và dung môi sử dụng là 1: 1 (w/v); pH 9,5; nhiệt độ 35 °C và thời gian chiết 10 phút Dung môi isopropanol là tác nhân thích hợp nhất để kết tủa protease trong dịch chiết từ ruột cá basa Với tỷ lệ thể tích dịch chiết enzyme và thể tích isopropanol là 15/85, mức tinh sạch chế phẩm protease kiềm là 1,65 lần và hiệu suất thu hồi enzyme đạt được là 90,42%

Bên cạnh đó việc trích ly protease trực tiếp từ nguồn nguyên liệu động thực vật và ứng dụng trong thủy phân protein cũng được tiến hành từ rất sớm Phan Thị Hồng

Hải và ctv (2001) đã nghiên cứu tinh chế protease từ sán lá gan (Fasciolagigatica)

Vũ Văn Bội (2004) đã nghiên cứu quá trình thủy phân protein cá bằng protease từ

Bacillus subtilis S5 Trong năm này, Đỗ Văn Ninh (2004) cũng đã công bố tối ưu

hóa quá trình phân giải protein của protease trong thịt cá và thử nghiệm sản xuất sản phẩm mới từ protein được thủy phân

2.5.2 Nghiên cứu ngoài nước

Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng quan tâm đến việc trích ly protease từ phụ phẩm thủy sản đã được thực hiện từ rất sớm Corvisat (1857) đã chứng tỏ khả năng chiết tách trypsine từ dịch tụy, đây là protease đầu tiên được thu nhận nhưng chưa

hấp phụ Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong chiết tách và nghiên cứu các tính chất của enzyme cũng như protein Tiếp theo đó là Hommarsten (1872) chiết tách được Chymosine (trích dẫn từ Nguyễn Lệ Hà, 2011).

Gần đây, Min-Soo Heu et al (2002) đã nghiên cứu trích ly, kết tủa phân đoạn hoạt

tính protease từ phụ phẩm tôm Quá trình trích ly protease được nghiên cứu riêng lẻ cho từng thành phần các phụ phẩm (đầu, thân, đuôi) được loại bỏ trong quá trình chế biến Phụ phẩm sau khi xử lý và được trích ly bằng nước cất, ly tâm thu được dịch trích thô, dịch trích thô kết tủa phân đoạn bởi ammonium sulfate Kết tủa ở 2 nồng độ 30 ÷ 50% (chất chỉ thị NPS-I và SS-I), và 50 ÷ 70% (chất chỉ thị NPS-II và SS-II), sau đó ly tâm thu được kết quả tương ứng Hoạt động Endoprotease của dịch trích thô là 0,2 U/mg đối với Hemoglobin (Hb, pH 3,0), 0,16 U/mg đối với azocasein (Ac, pH 6,0) và 0,12 U/mg đối với benzoyl-Arg-β-Naphthylamide (BANA, pH 7,0) Hoạt động của exoprotease là 0,11 ÷ 0,17 U/mg đối với Arg-β- Naphthylamide (ArgNA, pH 7,0), 0,06-0,11 U/mg đối với Lys-β- Naphthylamide (LysNA, pH 7,0) và 0,08 ÷ 0,09 U/mg đối với Leu-β- Naphthylamide (LeuNa, pH 7,0) Hoạt động của endoprotase tăng từ 5 ÷ 7,4 lần đối với NPS-I và SS-I, và 1,9 ÷ 2,7 lần đối với NPS-II và SS-II Trong khi đó, exoprotease tăng từ 3,6 ÷ 4,8 lần đối với NPS-I và SS-I, và 5,6 ÷ 7,2 lần đối với NPS-II và SS-II

Từ các nghiên cứu thực tế trong và ngoài nước ở lĩnh vực trích ly và ứng dụng protease từ nguồn động vật, một số vấn đề cơ bản cần quan tâm là:

- Sự ổn định của nguồn nguyên liệu cung cấp protease

- Các điều kiện trích ly enzyme phụ thuộc rất lớn vào đặc điểm từng loại enzyme và nguồn nguyên liệu, trong đó tỷ lệ dung môi sử dụng để hòa tan enzyme, tác động của pH, nhiệt độ và thời gian trích là các yếu tố có tầm quan trọng cao nhất

- Việc xác định các tính chất cơ bản của enzyme là cơ sở bước đầu trong việc

dự đoán đặc điểm, phương thức hoạt hóa và lĩnh vực ứng dụng của protease khảo sát

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM

3.1.1 Địa điểm, thời gian thí nghiệm

Địa điểm: Thực hiện bố trí thí nghiệm, đo đạc kết quả, xử lý số liệu tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ

Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 05/8/2013 đến 15/11/2013

3.1.2 Dụng cụ thí nghiệm

- Cân điện tử Vibra, model DJ-1000TW, độ chính xác 0,01g, Nhật

- Cân điện tử Ohaus, model AR-240, độ chính xác 0,0001 g, Nhật

- Máy ly tâm, model 800 Electronic Centrifuge, Trung Quốc

- Nhiệt kế HANNA, model S42866, độ chính xác 0,1, Ý

- pH kế HANNA, model TOA pH meter HM-12P, độ chính xác 0,01, Ý

- Tủ đông Acson International, model Acson R134a, nhiệt độ cấp đông -25 °C, Nhật

- Máy khuấy từ Toshiba (Magnestir MG-10, Nhật)

- Bộ điều nhiệt (Memmert, Đức, điều chỉnh đến cận 100 °C, độ chính xác 0,1

°C)

- Máy xay sinh tố Big Sar Model PP179, 3 tốc độ, từ 2000 vòng/phút (rpm) đến 4000 rpm

- Máy quang phổ so màu (Model 722, Trung Quốc)

- Một số dụng cụ thủy tinh phòng thí nghiệm và một số dụng cụ khác có liên quan

3.1.3 Hóa chất sử dụng

- Kali dihydrogen phosphate dehydrate (KH2PO4), (Trung Quốc, độ tinh khiết 99%)

- Disodium hydrogen photphate dodecahydrate (Na2HPO4.12H2O), (Merck)

- Glycine, (Trung Quốc, độ tinh khiết 99,5%)

- Hóa chất sử dụng để trích ly enzyme (các dung dịch đệm): Phosphate, NaOH, Na2HPO4, NaH2PO4 (Merck)

- Hóa chất để xác định hoạt tính enzyme: Tyrosine; HCl 0,2 N; NaOH 0,5 N; Trichloacetate acid (TCA); Folin; casein dạng bột (Merck, Đức)

- Các hóa chất có liên quan khác

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2.1 Nguyên liệu

Thịt đầu tôm sú được cung cấp từ ấp Bưng Cốc, xã Phú Mỹ, huyện Thạnh Trị, tỉnh Sóc Trăng Mẫu được giữ lạnh trong thùng xốp bằng nước đá, nhiệt độ bảo đảm dưới 4 °C, thời gian vận chuyển về phòng thí nghiệm tối đa 2 giờ

3.2.2 Phương pháp chuẩn bị mẫu

Thịt đầu tôm sú sau khi đưa về phòng thí nghiệm được rửa sơ bộ, để ráo nước, phân chia thành các mẫu có khối lượng xác định (khối lượng mẫu sử dụng cho một đơn

vị thí nghiệm là 200 g/mẫu), bao gói trong bao bì PA và trữ đông ở -18 ± 2 C

3.2.3 Phương pháp trích ly enzyme protease từ thịt đầu tôm sú

Thịt đầu tôm sú đông lạnh được phối trộn với dung môi theo tỷ lệ phù hợp Nhiệt

độ dung môi trước khi phối trộn là 2 ÷ 4 C Tiếp theo, hỗn hợp được nghiền bằng máy quay sinh tố (tốc độ quay của motor ở mức 2, 3000 rpm) trong thời gian 3 phút trước khi quá trình trích ly enzyme bắt đầu Trong quá trình nghiền, nhiệt độ không vượt quá 5 C (Trần Quốc Hiền và Lê Văn Việt Mẫn, 2006)

Sau khi nghiền, mẫu được đổ vào cốc thủy tinh, ủ ở điều kiện nhiệt độ và thời gian khác nhau để chiết rút enzyme Chú ý khuấy đảo mẫu 5 phút/lần Dịch chiết thu được bằng cách cho vải lọc có lỗ với kích thước 1mm*1mm để loại lượng lớn phần chất khô không hòa tan (bã tôm), sau đó làm lạnh (bằng cách cho dịch sau lọc vào tủ đông) trong 15 phút trước khi chuyển sang ly tâm 3000 rpm trong thời gian

20 phút để loại bỏ phần cặn, thu dịch chiết, gọi là dịch chiết protease thô (Yaneza et al., 2004)

Tiến hành xác định hoạt tính protease trong dịch chiết enzyme thô nhằm chọn được điều kiện trích ly protease tốt nhất

3.2.4 Phương pháp phân tích và đo đạc kết quả

Bảng 3.1 Phương pháp phân tích và đo đạc kết quả được sử dụng

NMKL số 23-1991

3.2.5 Phương pháp thu thập và xử lý kết quả

Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, lặp lại ít nhất 3 lần Thông số tương ứng với kết quả khảo sát đã lựa chọn từ thí nghiệm trước được sử dụng làm nhân tố cố định cho thí nghiệm kế tiếp

Số liệu được thu thập và xử lý bằng phần mềm thống kê Statgraphics Centrution 16.1, phân tích phương sai (ANOVA) và kiểm định LSD hay Duncan để kết luận

về sự sai khác giữa trung bình các nghiệm thức

Việc xác định phương trình tối ưu hóa điều kiện trích ly protease dựa trên phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methods), sử dụng phần mềm Statgraphics Centurion

Phương trình tương quan được chọn lựa dựa trên tác động của các yếu tố khảo sát đến kết quả thu nhận bằng các thử nghiệm mô hình hồi qui đa thức theo phương pháp bình phương nhỏ nhất

Các bước tiến hành thiết lập phương trình hồi quy:

Xác định miền biến thiên Xjmin < Xj < Xjmax và tâm quy hoạch:

(dựa vào các thí nghiệm thăm dò)

Quy đổi chuẩn hóa từ các mức giá trị thực của yếu tố thành giá trị mã hóa xj

X j: Là giá trị thực của yếu tố (gọi là biến thực)

j:Là giá trị mã hóa của yếu tố (gọi là biến mã)

: Là giá trị thực ở điểm trung tâm (tương ứng với giá trị mã hóa xj0 = 0)

Xj: Là khoảng giá trị giữa 2 mức khảo sát

- Chọn dạng phương trình hồi quy: Phương trình 1 hay 2 (viết 2 phương trình của phần lý thuyết vào đây)

- Tính toán xác định các hệ số hồi quy bj bằng phương pháp bình phương cực

- Kiểm định sự có ý nghĩa của các hệ số hồi quy bj với chuẩn Student (t-test)

- Thực hiện các thí nghiệm tại tâm quy hoạch Loại bỏ các bj không có nghĩa, tính toán lại các bj và kiểm định lại cho đến khi chỉ còn các bj có nghĩa

- Kiểm định sự có nghĩa của phương trình hồi quy với chuẩn Fisher

Đồ thị mô phỏng countour được thiết lập dựa trên ảnh hưởng tương tác của hai tham số khảo sát đến hoạt tính enzyme thu được trong điều kiện cố định hai thông số còn lại ở giá trị tối ưu Trên cơ sở đó, tương tác của một tham số với các tham số khác được nghiên cứu

Giá trị tối ưu của mỗi thông số được xác định dựa trên điểm uốn cong trên đồ thị không gian 3 chiều

3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

3.3.2 Xác định thành phần hóa lý và hoạt tính protease ban đầu có trong thịt

đầu tôm

Mục đích: Xác định thành phần hóa lý cơ bản (độ ẩm, protein, pH) và hoạt tính

protease của nguyên liệu thịt đầu tôm sú được thu nhận ở các thời điểm khác nhau, làm cơ sở cho việc chuẩn bị nguồn nguyên liệu đồng đều đối với các khảo sát trích

ly protease tiếp theo

Nguyên liệu – thịt đầu tôm sú

Xác định tỷ lệ mẫu: dung môi tối ưu cho quá trình trích ly enzyme protease

Xác định pH của dung môi tối ưu cho quá trình trích ly enzyme

protease

Tối ưu hóa điều kiện trích ly enzyme protease từ đầu tôm (nhiệt độ, thời gian) bằng

phương pháp bề mặt đáp ứng

Cách tiến hành:

- Tiến hành lấy mẫu ở nhiều đợt khác nhau (5 đợt mẫu, 5 kg/đợt)

- Mẫu sau khi được xử lý sơ bộ, để ráo nước được sử dụng để phân tích thành phần hóa lý ban đầu

- Lấy mẫu ở ít nhất 5 vị trí khác nhau trên khối nguyên liệu cho một lần khảo sát

- Kiểm tra độ ẩm, protein, pH có trong mẫu theo phương pháp được trình bày ở bảng 3.1

Mục đích: Tìm ra tỷ lệ nước cất bổ sung thích hợp vào mẫu thịt đầu tôm sú giúp

quá trình trích ly protease đạt hiệu quả cao nhất

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm tiến hành với 1 nhân tố

Nhân tố A: Tỷ lệ mẫu và nước cất (w/v), thay đổi ở 6 mức độ

Số nghiệm thức: 6

Số mẫu thí nghiệm: 3 x 6 = 18 mẫu

Khối lượng mẫu sử dụng: 18 x 0,2 kg/mẫu = 3,6 kg

Sơ đồ bố trí thí nghiệm được trình bày ở Hình 3.2