LY ĐẾN HIỆU QUẢ THU NHẬN PROTEASE TỪ THỊT ĐẦU TÔM SÚ
Hai yếu tố thời gian và nhiệt độ trích ly được chọn để thực hiện qui hoạch thực nghiệm do các yếu tố trên ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính enzyme protease. Bản chất của enzyme là protein do đó nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến vận tốc phản
ứng. Nhiệt độ tăng tốc độ phản ứng tăng nhưng đến mức nào đó thì tốc độ phản ứng giảm xuống do enzyme bị biến tính. Do đó khảo sát nhịêt độ kết hợp với thời gian là điều kiện quan trọng ảnh hưởng đến quá trình trích ly. Như đa số các enzyme khác, protease cũng rất nhạy cảm với nhiệt độ. Phần lớn các enzyme này bị giảm hoạt tính từ 60 °C và bị vô hoạt ở nhiệt độ trên 70 °C (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Trong điều kiện khảo sát, hai yếu tố không thay đổi trong quá trình khảo sát là:
+ Tỷ lệ mẫu:dung môi: 1: 4 (w/v) – được lựa chọn từ thí nghiệm 1
+ Giá trị pH của dung môi trích ly glycine-NaOH dùng để trích ly là 9 từ kết quả của thí nghiệm 2
Nghiên cứu sử dụng phương án trực giao cấp 2 với 18 đơn vị thí nghiệm, bao gồm số thí nghiệm khảo sát N = 3 x 5 =15, trong đó có một thí nghiệm ở tâm phương án và thực hiện thêm ba thí nghiệm ở tâm nữa để kiểm tra ý nghĩa các hệ số của phương trình hồi qui.
Hai yếu tố cần khảo sát là:
+ X1: Là nhiệt độ trích ly với 5 mức khảo sát, mức thấp nhất (-2) tương ứng 30°C, mức -1 tương ứng nhiệt độ 40 °C, tâm (mức 0) 50 °C và hai mức nhiệt độ cao 60°C (+1) và 70 °C (+2).
+ X2: Là thời gian trích ly với 3 mức khảo sát, mức dưới (-1) tương ứng 20 phút; tâm: 40 phút và mức trên (+1) 60 phút.
Hàm mục tiêu Y: Tổng hoạt tính protease thu được trong dịch trích ly (U/g CKNL).
Ma trận qui hoạch thực nghiệm quá trình trích ly protease từ thịt đầu tôm sú được trình bày ở bảng 4.3.
Bảng 4.3 Ảnh hưởng của các nhân tố mã hóa đối với phương trình hồi quy
Nhân tố Tổng
bình phương
Bậc tự do Phương sai Tỷ số F Giá trị P
X1:Nhiệt độ+block 23,9419 1 23,9419 50,10 0,0000 X2:Thời gian+block 4,83025 1 4,83025 10,11 0,0260 X12+block 636,607 1 636,607 1332,22 0,0000 X1X2+block 104,835 1 104,835 219,39 0,0000 X22+block 26,0273 1 26,0273 54,47 0,0000 blocks 1,44018 2 0,720092 1,51 0,2323 Sai số 21,9813 46 0,477853
Standardized Pareto Chart for UI 10 20 30 40 Standardized effect B:Thoi gian+block A:Nhiet do+block BB+block AB+block AA+block + -
Hình 4.3 Ảnh hưởng của các thừa số khảo sát (tương tác đơn, tương tác đa) đến quá trình trích ly protease từ thịt đầu tôm sú
Từ bảng tổng hợp 4.3 cho thấy, giá trị P của các lần lập lại của thí nghiệm (block) có giá trị P = 0,2323 > 0,05, chứng tỏ độ tin cậy của kết quả đo đạc giá trị protease tương ứng với các mẫu trích ly ở các lần khảo sát khác nhau. Đồng thời, tất cả giá trị P của các thừa số khảo sát đều nhỏ hơn 0,05 và giá trị F lớn hơn 10 đã chứng tỏ các nhân tố khảo sát đều ảnh hưởng đến quá trình trích ly protease từ thịt đầu tôm sú. Hệ số hồi quy bậc một của X1, X2 cũng như hệ số tương tác của X1X2 đều khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy 95%, đồng thời hệ số hồi quy bậc hai của X12 và X22 cũng khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê. Đồ thị thể hiện sự tương tác của các thừa số khảo sát ở hình 4.3 cũng góp phần khẳng định mức độ ảnh hưởng của từng biến độc lập cũng như các tương tác có ý nghĩa đến quá trình trích ly protease được khảo sát.
-2.0 Thoi gian=-1.0
Thoi gian=1.0
Interaction Plot for UI
3 6 9 12 15 UI Nhiet do 2.0 Thoi gian=-1.0 Thoi gian=1.0
Hình 4.4 Đồ thị biểu diễn sự tương tác của nhiệt và thời gian đến hoạt tính của enzyme protease được chiết tách
Từ đồ thị tổng quát biểu diễn sự tương tác của cặp nhân tố nhiệt độ và pH đến hoạt tính protease thu nhận ở hình 4.4 cho thấy, hai nhân tố này thật sự có sự ảnh hưởng đồng thời đến quá trình trích ly enzyme protease. Với nhiệt độ trích ly thấp và thời gian ly trích ngắn cho hiệu quả ly trích kém, trong khi đó, nếu nâng nhiệt độ ly trích lên mức cao nhất và thời gian ly trích kéo dài, protease bị mất hoạt tính.
Đồ thị bề mặt đáp ứng và đồ thị đường đồng điểm được thể hiện đồng thời ở hình 4.5 một lần nữa khẳng định cả hai yếu tố pH và nhiệt độ đều ảnh hưởng đến quá trình trích ly protease từ thịt đầu tôm sú. Giá trị cao nhất của hàm mục tiêu Y khi X1 có giá trị trong khoảng từ -1 đến 0 (40 C đến 50 C) và X2 có giá trị trong khoảng từ 0 đến +1 (40 đến 60 phút).
Phương trình thực nghiệm tối ưu hóa hai nhân tố thời gian và nhiệt độ đối với quá trình trích ly thông qua kết quả thí nghiệm có được là: Y=13,3812 - 0,515772*X1
Thoi gian Estimated Response Surface
UI ,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 12,0 13,0 14,0 -2 -1 1 2 Nhiet do -1 -,6 -,2,2 ,6 1 3 6 9 12 15 UI
Hình 4.5 Đồ thị biểu diễn sự tương tác của nhiệt độ và thời gian trích ly đến hoạt tính của enzyme protease được chiết tách
Giá trị pH và nhiệt độ tối ưu cho quá trình trích ly enzyme từ thịt đầu tôm sú khi giải phương trình hồi qui (1). Dựa theo kết quả thu được trên hình 4.5, điều kiện thích hợp để chiết enzyme từ thịt đầu tôm sú cho những thí nghiệm tiếp theo tương ứng với X1= -0,2 và X2= + 0,23.
Nhiệt độ và thời gian trích ly tối ưu được tính theo công thức 3.2 (mục 3.25)
0 0 max min ( ) 2( ) ( ) j j j j j j j j X X X X x X X X
Kết quả xác định thu được giá trị nhiệt độ trích ly tối ưu là 46 °C và thời gian tương ứng là 44,6 phút. Trong khảo sát thực tế, chọn lựa mức nhiệt độ 42 °C và thời gian ủ là 50 phút, hoạt tính protease đạt được ở điều kiện ly trích tối ưu là 13,48 U/g.
Hoạt tính protease thu được từ thực nghiệm và tính toán theo phương trình có độ tương thích cao ở giá trị R2 = 0,9752 (hình 4.6). Như vậy có thể kết luận rằng phương trình hồi quy đã mô tả đúng các kết quả thực nghiệm. Hệ số tương quan cho biết 97,5% sự biến đổi hoạt tính protease là do ảnh hưởng của các biến độc lập X1, X2và chỉ có 2,5 % sự thay đổi là do các yếu tố không xác định được gây ra.
Kết quả thí nghiệm của Nguyễn Lệ Hà (2011) cho thấy protease trong gan tụy và đầu tôm hoạt động tốt trong khoảng 52 ÷ 67 C với nhiệt độ tối ưu là 62 C và thời gian tối ưu để tách chiết là 40 phút (đối với đầu tôm) và 60 phút (đối với gan tụy). Kết quả Trần Quốc Hiền và Lê Văn Việt Mẫn (2006) khi tiến hành thí nghiệm hai nhân tố riêng biệt ở ruột cá ba sa là tăng nhiệt độ trích ly cao hơn 40 C thì tổng hoạt tính enzyme thu được bị giảm đi. Do khoảng nhiệt độ 50 ÷ 60 C là thích hợp cho các phân tử protease xúc tác thủy phân lẫn nhau. Hơn nữa, nhiệt độ cao có thể làm biến tính bất thuận nghịch enzyme. Còn ở thí nghiệm với thời gian thì tối ưu để trích ly là 10 phút, dịch trích ly enzyme từ ruột cho tổng hoạt tính protease cao nhất. Đồng thời con cho biết kéo dài thời gian trích ly vượt hơn 10 phút thì tổng hoạt tính protease thu được trong dịch chiết không tăng nữa mà còn bị giảm nhẹ. Do thời gian dài, các phân tử protease trong dịch trích ly xúc tác phản ứng thủy phân lẫn nhau. Nhưng khi tiến hành thí nghiệm kết hợp pH và nhiệt độ Trần Quốc Hiền và Lê Văn Việt Mẫn lại có được nhiệt độ tối ưu là 35 C.
Kết quả thực nghiệm cho thấy hoạt tính protease trong thịt đầu tôm sú tăng đều từ 20 đến 60 phút đối với điều kiện nhiệt độ 30 và 40 C, và giảm dần theo thời gian 20, 40, 60 phút ở các nhiệt độ cao hơn. Hoạt tính cao trong khoảng 40 ÷ 60 phút với thời gian tối ưu là 44,6 phút ở 46 °C. Nhiệt độ có ảnh hưởng đến quá trình trích ly khá rõ, khi nhiệt độ tăng từ 40 °C lên thành 50 °C thì hàm lượng tyrosine và tryptophane tạo thành tăng mạnh. Tuy nhiên khi nhiệt độ tiếp tục tăng từ 50 °C thành 60 °C thì hàm lượng tyrosine và tryptophane lại tăng không đáng kể và giảm hẳn khi thủy phân ở nhiệt độ 70 °C. Phân tích cảm quan mẫu trích ly ở 30 và 40°C cho thấy dịch trích ly có màu nâu nhạt, mùi nhẹ hơn so với các mẫu ủ ở 50, 60, 70°C vào cùng thời điểm lấy mẫu, bắt đầu xuất hiện mùi “tôm luộc” thường có - khi chế biến thực phẩm tại nhà. Đối với các mẫu trích ly ở nhiệt độ 50, 60, 70 °C dịch có màu đỏ hồng, loãng hơn, mùi tanh giảm nhiều. Như vậy, không nên áp dụng nhiệt độ trích ly dưới 30 °C, và việc tăng nhiệt độ lên trên 70 °C cũng là điều không cần thiết vì dễ gây biến tính protease mà hoạt tính protease thu được không cao, chưa kể đến việc tiêu tốn năng lượng khi nâng nhiệt.
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ