Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, lặp lại ít nhất 3 lần. Thông số tương ứng với kết quả khảo sát đã lựa chọn từ thí nghiệm trước được sử dụng làm nhân tố cố định cho thí nghiệm kế tiếp.
Số liệu được thu thập và xử lý bằng phần mềm thống kê Statgraphics Centrution 16.1, phân tích phương sai (ANOVA) và kiểm định LSD hay Duncan để kết luận về sự sai khác giữa trung bình các nghiệm thức.
Việc xác định phương trình tối ưu hóa điều kiện trích ly protease dựa trên phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methods), sử dụng phần mềm Statgraphics Centurion.
Phương trình tương quan được chọn lựa dựa trên tác động của các yếu tố khảo sát đến kết quả thu nhận bằng các thử nghiệm mô hình hồi qui đa thức theo phương pháp bình phương nhỏ nhất.
Các bước tiến hành thiết lập phương trình hồi quy:
Xác định miền biến thiên Xjmin < Xj < Xjmax và tâm quy hoạch:
max min 0 ( ) 2 j j j X X X (3.1)
(dựa vào các thí nghiệm thăm dò).
Quy đổi chuẩn hóa từ các mức giá trị thực của yếu tố thành giá trị mã hóa xj
0 0 max min ( ) 2( ) ( ) j j j j j j j j X X X X x X X X (3.2) với j = 1, 2, 3,...k Với:
X j: Là giá trị thực của yếu tố (gọi là biến thực). j:Là giá trị mã hóa của yếu tố (gọi là biến mã).
: Là giá trị thực ở điểm trung tâm (tương ứng với giá trị mã hóa xj0 = 0).
Xj: Là khoảng giá trị giữa 2 mức khảo sát.
- Chọn dạng phương trình hồi quy: Phương trình 1 hay 2 (viết 2 phương trình của phần lý thuyết vào đây).
- Tính toán xác định các hệ số hồi quy bj bằng phương pháp bình phương cực tiểu.
- Kiểm định sự có ý nghĩa của các hệ số hồi quy bj với chuẩn Student (t-test). - Thực hiện các thí nghiệm tại tâm quy hoạch. Loại bỏ các bj không có nghĩa,
tính toán lại các bj và kiểm định lại cho đến khi chỉ còn các bj có nghĩa. - Kiểm định sự có nghĩa của phương trình hồi quy với chuẩn Fisher.
Đồ thị mô phỏng countour được thiết lập dựa trên ảnh hưởng tương tác của hai tham số khảo sát đến hoạt tính enzyme thu được trong điều kiện cố định hai thông số còn lại ở giá trị tối ưu. Trên cơ sở đó, tương tác của một tham số với các tham số khác được nghiên cứu.
Giá trị tối ưu của mỗi thông số được xác định dựa trên điểm uốn cong trên đồ thị không gian 3 chiều.