Nghiên cứu trích ly protease từ thịt đầu tôm sú

Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu và dung môi w/v trích ly, điều kiện pH của môi trường, đặc biệt là tác động tương tác của nhiệt độ và thời gian trích ly đến hiệu quả thu nhận protease từ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH

HỌC ỨNG DỤNG

PHAN THI BÍCH NGOC

NGHIÊN CỨU TRÍCH LY PROTEASE TỪ

THỊT ĐẦU TÔM SÚ

Luận văn tốt nghiệp đại học Ngành: CÔNG NGHỆ

THựC PHẲM

PGs.Ts Nguyễn Văn Mười

Sinh viên thưc hiên:

Phan Thị Bích Ngọc

MSSV: 2101943Lóp Công nghệ Thực phẩm K36

Cần Thơ, 2013

Người hướng dẫn

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ

Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

Phan Thị Bích Ngọc

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của sinh viên Phan Thị Bích Ngọc với

sự hướng dẫn của PGs Ts Nguyễn Văn Mười Các số liệu và kết quả trình bày trongluận văn là trung thực và do chính tác giả thực hiện Luận văn đính kèm theo đây, với

đề tài “Nghiên cứu trích ly protease từ thịt đầu tôm sú” đã được hội đồng chấm

luận văn thông qua

Cần Thơ, ngày 09 tháng 12 năm 2013 Người viết

Nguyễn Văn Mười

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

Thầy Nguyễn Văn Mười và cô Trần Thanh Trúc, những người đã trực tiếp hướngdẫn, giúp đỡ em tận tình Đồng thời cung cấp nhiều kiến thức và tạo điều kiện thuậnlợi cũng như giải đáp những thắc mắc của em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cô Nguyễn Thị Hoàng Minh, cán bộ phòng thí nghiệm D006 đã tạo điều kiện thuậnlợi cho em hoàn thành tốt đề tài của mình

Chân thành cám ơn sự giảng dạy và truyền đạt kiến thức của các Thầy Cô ở TrườngĐại học Cần Thơ, đặc biệt là Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp vàSinh học ứng dụng, Trường Đại học cần Thơ

Anh Trần Bạch Long - học viên Cao học ngành Công nghệ Sinh học khóa 19, anh đãtruyền đạt cho em nhiều kinh nghiệm, giúp đỡ em tận tình về kiến thức cũng nhưphương pháp học tập, nghiên cứu

Các bạn bè thân yêu và thầy cố vấn học tập kính mến của lớp Công nghệ thực phẩmkhóa 36 đã động viên, chia sẽ kinh nghiệm buồn vui trong suốt thời gian học tập bênnhau và cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu đề tài.Các anh chị và các bạn thực tập cùng phòng thí nghiệm D006 đã giúp đỡ rất nhiềutrong quá trình nghiên cứu đề tài

Con cảm ơn cha mẹ, những người thân đã trang bị tinh thần lẫn vật chất và là hànhtrang cho con bước vào đời

Cuối lời em xin gởi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể quý thầy cô trường Đại họcCần Thơ đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt bốn năm học tập tạitrường

Kính chúc quý thầy cô và các bạn luôn dồi dào sức khỏe và thành công

Em xin chân thành cảm ơn

Cần Thơ, ngày 09 tháng 12 năm 2013 Sinh viên thực hiện

Phan Thị Bích Ngọc

TÓM TẮT

Đe tài tiến hành khảo sát một số yếu tổ ảnh hưởng đến khả năng trích ly protease từ mẫu thịt đầu tôm sú - sản phẩm phụ của ngành chế biến tôm đông lạnh Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu và dung môi (w/v) trích ly, điều kiện pH của môi trường, đặc biệt là tác động tương tác của nhiệt độ và thời gian trích ly đến hiệu quả thu nhận protease từ thịt đầu tôm sú đã được khảo sát theo phương pháp bề mặt đáp ứng với cấu trúc có tâm Kết quả khảo sát cho thấy, dịch chiết protease thu được từ thịt đầu tôm sú có hoạt tỉnh tối ưu là 13,48 u/g CKNL (chất khô nguyên liệu) khi sử dụng dung dịch đệm glycine - NaOH với pH 9 làm dung môi trích ly với tỷ lệ nguyên liệu

và dung môi là 1: 4 (w/v) Việc áp dụng phương pháp bề mặt đáp ứng đã xác định

được điều kiện nhiệt độ và thời gian ủ tối ưu lần lượt là 46 °c và 44,6 phút.

Từ khóa: nhiệt độ, pH, protease, thịt đầu tôm sứ, thài gùrn, tỉ lệ dung môi.

MỤC LỤC soOca

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH HÌNH vi

DANH SÁCH BẢNG vii

DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT viii

Chương 1 TỔNG QUAN 1

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN cứu 2

Chương 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 THỊT ĐẦU TÔM sú - NGUỒN NGUYÊN LIỆU LY TRÍCH ENZYME PROTEASE 3

2.1.1 Tôm sú - nguồn thủy sản lạnh đông xuất khẩu 3

2.1.2 Thực trạng xử lý và tiêu thụ thịt đầu tôm sú ở nước ta 5

2.2 KHÁI QUÁT VỀ PROTEASE VÀ HỆ PROTEASE TRONG THUỶ SẢN 6

2.2.1 Tổng quan về protease 6

2.2.2 Hệ serine protease 8

2.2.3 Protease của tôm sú 10

2.2.4 Khả năng ứng dụng protease 11

2.3 Cơ SỞ LÝ THUYẾT CỦA VIỆC TRÍCH LY PROTEASE TỪ TẾ BÀO ĐỘNG

VẬT 13

2.3.1 Lý thuyết chung 13

2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá ừình trích ly của enzyme 14

2.4 QUY HOẠCH THựC NGHIỆM XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN TRÍCH LY THÍCH HỢP BẰNG PHƯƠNG PHÁP BỀ MẶT ĐÁP ỨNG (RSM) 16

2.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN cứu TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ TRÍCH LY VÀ ỨNG DỤNG CỦA PROTEASE NGUỒN GỐC ĐỘNG VẬT 17

2.5.1 Nghiên cứu trong nước 17

2.5.2 Nghiên cứu ngoài nước 17

Chương 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 19

3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM 19

3.1.1 Địa điểm, thời gian thí nghiệm 19

3.1.2 Dụng cụ thí nghiệm 19

3.1.3 Hóa chất sử dụng 19

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 20

3.2.1 Nguyên liệu 20

3.2.2 Phương pháp chuẩn bị mẫu 20

3.2.3 Phương pháp trích ly enzyme protease từ thịt đầu tôm sú 20

3.2.4 Phương pháp phân tích và đo đạc kết quả 20

3.2.5 Phương pháp thu thập và xử lý kết quả 21

3.3 NỘI DUNG NGHIÊN cứu 22

3.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 22

3.3.2 Xác định thành phần hóa lý và hoạt tính protease ban đầu có trong thịt đầu tôm 22

3.3.3 Thí nghiệm 1 : Xác định tỷ lệ mẫu và dung môi trích ly protease từ thịt đầu tôm sú phù hợp 23

3.3.4 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường đến hiệu quả trích ly protease 24

3.3.5 Thí nghiệm 3: Xác định tương tác của nhiệt độ và thời gian ủ đến hiệu quả trích ly protease 26

Chương 4 KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

4.1 THÀNH PHẦN HÓA LÝ cơ BẢN CỦA THỊT ĐẦU TÔM 29

4.2 ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ NGUYÊN LIỆU VÀ DUNG MÔI ĐẾN QUÁ TRÌNH TRÍCH LY ENZYME PROTEASE TỪ THỊT ĐẦU TÔM sú 30 4.3 ẢNH HƯỞNG CỦA VIỆC ĐIỀU CHỈNH pH MÔI TRƯỜNG ĐẾN HIỆU QUẢ

TRÍCH LY PROTEASE 31

4.4 ẢNH HƯỞNG CỦA TƯƠNG TÁC NHIỆT ĐỘ VÀ THỜI GIAN TRÍCH LY ĐẾN HIỆU QUẢ THU NHẬN PROTEASE TỪ THỊT ĐẦU TÔM sú 32

Chương 5 KÉT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38

5.1 KẾT LUẬN 38

5.2 ĐỀ NGHỊ 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

PHỤ LỤC 1 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ix

PHỤ LỤC 2 KÉT QUẢ THỐNG KÊ xiii

PHỤ LỤC 3 SỐ LIỆU XÂY DựNG đường chuẩn tyrosine xix

DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1 Tôm sú Penaeus monodon 4

Hình 2.2 Phản ứng thủy phân liên kết peptide do tác động của protease 6

Hình 2.3 Cơ chế xúc tác của endopeptidase và exopeptidase 7

Bảng 2.2 Một số serine protease có nguồn gốc động vật thông dụng hiện nay 8

Hình 2.4 Sơ đồ các bước xúc tác cơ bản của nhóm serine protease 8

Hình 2.5 Hình dạng các gốc amino acid ở các túi khác nhau của serine protease 9

Bảng 3.1 Phương pháp phân tích và đo đạc kết quả được sử dụng 20

Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 22

Hình 3.2 Sơ đồ bố ừí thí nghiệm 1 24

Hình 3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 25

Hình 3.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3 28

Hình 4.3 Anh hưởng của các thừa số khảo sát (tương tác đem, tương tác đa) đến quá ừình trích ly protease từ thịt đầu tôm sú 34

Hình 4.4 Đồ thị biểu diễn sự tương tác của nhiệt và thời gian đến hoạt tính của enzyme protease được chiết tách 35

Hình 4.5 Đồ thị biểu diễn sự tương tác của nhiệt độ và thời gian trích ly đến hoạt tính của enzyme protease được chiết tách 36

Hình 4.6 Đồ thị tương quan giữa họat tính protease xác định bằng thực nghiệm và tính toán theo phương trình hồi quy 36 Hình PL1 Đường chuẩn Tyrosine XX

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần hóa lý cơ bản của thịt đầu tôm sú 5Bảng 2.2 Một số serine protease có nguồn gốc động vật thông dụng hiện nay 7Bảng 3.1 Ma trận quy hoạch thực nghiệm quá trình trích ly protease từ thịt đầu tôm 27

Hình 4.1 Anh hưởng của tỷ lệ mẫu và dung môi đến quá ừình trích ly protease từ thịt đầu tôm sú 30Bảng 4.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH ứng với dung môi đến hiệu quả trích ly protease 32

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của các nhân tố mã hóa đối với phương trình hồi quy 33

Bảng PL1 Xây dựng đường chuẩn nồng độ tyrosine ixBảng PL2 Phương pháp xác định lượng tyrosine trong mẫu XBảng PL3 Bố trí thí nghiệm xây dựng đường chuẩn tyrosine xixBảng PL4 Số liệu xây dựng đường chuẩn tyrosine xix

Ngành Công nghệ Thực phấm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

-Vỉ»-Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ

Ngành Công nghệ Thực phấm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

-Vỉ»-CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 ĐẶT VẤN ĐÈ

ứng dụng enzyme trong chế biến thực phẩm và nhiều lĩnh vực khác đã và đang là mộttrong những vấn đề mang tính cấp thiết và có ý nghĩa thực tiễn Hiện nay, các nướcphát triển đang áp dụng các chế phẩm enzyme trong sản xuất để tạo ra những sản phẩm

có năng suất và chất lượng cao với giá thành hạ (Saurel, 2003; Suutarinenn và Autio,2004; Ngô Tiến Hiển, 2001) Việt Nam là nước giàu tiềm năng về nông sản, nhu cầucác loại enzyme phục vụ trong chế biến thực phẩm là rất lớn Tuy nhiên, ở Việt Namhoàn toàn không có xưởng sản xuất chế phẩm enzyme, hàng năm nước ta vẫn phảinhập ngoại một khối lượng lớn những loại enzyme này (Đặng Thị Thu và Nguyễn ThịXuân Sâm, 2009b)

Protease là enzyme thủy phân có giá trị thương mại rất lớn, chiếm khoảng 60% tổnglượng enzyme công nghiệp được cung cấp trên thị trường thế giới (Joo và Chang,2006) với nhiều ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp, nông nghiệp,

mỹ phẩm và đặc biệt trong y học hiện hiện đại (Joo và Chang, 2006 ; Nedra et al.,

2011) Hơn thế nữa, các nghiên cứu ứng dụng protease gần đây đã chỉ ra vai trò tíchcực của việc sử dụng các protease trung tính và đặc biệt là protease ưa kiềm trong việctầm soát các bệnh liên quan đến sự nghẽn mạch do sự đông tụ của fibrin (Phan Thị

Bích Trâm et al., 2007) hay ứng dụng trong thủy phân protein, làm mềm thịt (Heu và

Kim, 2002), thủy phân tạo dịch trích protein từ phụ phẩm cá (Prasertsan vàPrachumratana, 2013), khử protein trong phụ phẩm tôm, giúp quá trình chiết tách

chitin, chitosan đạt hiệu quả tốt (Nedra et al., 2011) Chính điều này đã mở ra triển

vọng cho việc nghiên cứu trích ly enzyme protease từ thịt đầu tôm sú, giúp tận dụngtriệt để lượng phụ phẩm của tôm trong quá trình chế biến và tăng hiệu quả kinh tế chongành thủy sản nói chung, ngành xuất khẩu tôm nói riêng

Với tỷ lệ đầu tôm được loại bỏ trong quá trình ché biến khoảng 34% khối lượng ban

đầu (Tran et al., 2011), trung bình hàng năm Việt Nam có khoảng 35.000 -ỉ- 46.000 tấn

đầu tôm được thải ra tà các nhà máy Hiện nay, lượng đầu tôm chủ yếu dùng làm phân

Ngành Công nghệ Thực phấm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

-Vỉ»-Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ

bón, thức ăn gia súc, thủy sản Tuy nhiên giá trị thành phẩm của các sản phẩm nàychưa cao Việc nghiên cứu sản xuất chitosan từ vỏ đầu tôm trong thời gian gần đây làmột hướng mới nhằm sử dụng có hiệu quả nguồn đầu tôm phụ phẩm, đây được xemnhư là một loại bao bì có tính năng bảo vệ và có thể sử dụng như thực phẩm mà không

hề ảnh hưởng đến môi trường chung quanh (Trung et al., 2003) Tuy nhiên, việc sản

xuất chitosan đòi hỏi phải loại bỏ lượng thịt trong đầu tôm (chiếm đến 15,25% khốilượng đầu tôm và 5,5% so với nguyên liệu tôm SÚ tươi), tạo ảnh hưởng tiêu cực đếnmôi trường Chính YÌ thế, yêu cầu đặt ra là nghiên cứu biện pháp sử dụng nguồnnguyên liệu giàu protein và enzyme protease nhằm nâng cao giá trị thương phẩm củatôm sú, đồng thời làm giảm tác động ô nhiễm môi trường do quá trình xử lý đầu tômgây ra là vấn đề có tính cấp thiết

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Mục đích chung của đề tài là xác định một số yếu tố cơ bản có ảnh hưởng đến hiệu quảtrích ly protease từ thịt đầu tôm sú Để đạt được mục tiêu đã được đặt ra, đề tài tậptrung vào các nội dung cụ thể sau:

> Xác định tỷ lệ nguyên liệu và dung môi (w/v) trích ly protease thích hợp

> Xác định pH của dung môi thích hợp giúp gia tăng hiệu quả trích ly protease

> Tối ưu hóa nhiệt độ và thời gian trích ly protease tò thịt đầu tôm sú

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

PROTEASE

2.1.1 Tôm sú - nguồn thủy sản lạnh đông xuất khẩu

2.1.1.1 Tổng quan

Tôm sú (có tên khoa học là Penaeus monodon, Fabricius, 1798, trích dẫn bởi Holthuis,

1980) là loài sống ở nơi đáy bùn pha cát với độ sâu tò ven bờ đến 40 m nước Khi tômtrưởng thành thường di chuyển xa bờ vì chúng thích sống vùng nước sâu hơn

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ

Ngành Công nghệ Thực phấm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

-Vỉ»-Tôm sú được phân loại như sau:

(Nguồn: Holthuis, 1980)

Trong tự nhiên tôm sú nước mặn đến mùa sinh sản sẽ tiến vào gần bờ để đẻ trứng,trứng nở ra ấu trừng và trải qua năm thời kỳ biến thái: Naupilus, Zoea, Mysis,Postlarvae, Juvenile Từ đây ấu trùng theo sóng biển dạt vào cửa sông nơi nước biển vànước sông pha trộn lẫn nhau nên độ mặn thấp hơn Đây chính là điều kiện tốt cho ấutrùng phát triển Tôm sú có đặc điểm sinh trưởng nhanh, trong 3 ^ - 4 tháng có thể đạt

(Holthuis, 1980)

Ngành Công nghệ Thực phấm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

-Vỉ»-Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ

Tôm đông lạnh đã và đang là một mặt hàng xuất khẩu có kim ngạch cao ở Việt Nam vàđang cạnh tranh mạnh mẽ với thị trường xuất khẩu lớn trên thế giới đặc biệt Thái Lanđang gặp khó khăn do vấn đề tôm bệnh Hơn thế nữa, nguồn cung tôm thế giới bị hạnchế bởi sản lượng tôm từ Thái Lan giảm mạnh do ảnh hưởng của EMS khiến giá tômtăng trên toàn cầu Nhờ đó, giá trị xuất khẩu tôm Việt Nam sang các thị trường lớntăng lên

Trong đó, tôm sú là sản phẩm chính, chiếm hơn 50% tổng lượng tôm xuất khẩu trong

cả nước Theo số liệu của VASEP (2010), tổng khối lượng xuất khẩu của mặt hàng tôm

sú là 121.399 tấn, chiếm 10,44% tổng giá trị xuất khẩu thủy sản trong cả nước và56,7% tổng giá trị xuất khẩu ngành tôm Đến cuối tháng 6 năm 2013, tổng lượng xuấtkhẩu tôm sú có sụt giảm, nhưng vẫn là ngành hàng chủ lực nhất Trong đó, mặt hàngtôm sú bỏ đầu HLSO là sản phẩm được ưa chuộng trên nhiều thị trường, đặc biệt trênthị trường Nhật Bản Tôm sú HLSO Việt Nam cỡ 16/20 cuối tháng 6/2013 tăng thêm5,5 USD/kg so với tháng 1/2013, từ 10,72 USD/kg lên 16,23 USD/kg Tôm sú HLSO

cỡ 16/20 từ Ấn Độ cũng tăng thêm gần 5 USD/kg, từ

11,3 USD/kg lên 15,95 USD/kg

Hình 2.1 Tôm sú Penaeus monodon

(Nguồn: http://healthyrecipes.wikia.com/wikƯFiỉe:Bỉack_Tiger_Prawn_Jumbo_Size.jpg ) 2.1.1.2 Tình hình sản xuất tôm đông lạnh ở Việt Nam

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ

Ngành Công nghệ Thực phấm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

-Vỉ»-(Nguồn: http://www vasep com khau-tom- Viet-Nam htm)

vn/Tin-Tuc/378_30440/Hien-trang-va-tiem-nang-thi-truong-xuat-Tình hình hiện nay mở ra hướng khai thác nguồn thịt đầu tôm sú dồi dào này cho chếbiến các sản phẩm giá trị gia tăng, nâng cao giá trị của con tôm sú ở Việt Nam

2.1.2 Thực trạng xử lý và tiêu thụ thịt đầu tôm sú ở nước ta

Kết quả phân tích thành phần hóa học cơ bản của thịt đầu tôm sú (bảng 2.1) cho thấy,đây chính là nguồn giàu protein, đồng thời thịt đầu tôm có giá trị pH khá cao (7,3) khi

so sánh YỚi pH của thịt tôm tươi (pH = 6,8 6,9; Nguyễn Xuân Phương,2003) Điều này cho thấy, thịt đầu tôm rất dễ chịu sự tấn công của các vi sinh vật và

các biến đổi sinh hóa, hóa học gây hư hỏng (Tran et al., 2011).

Một trong những ứng dựng phổ biến nhất là sử dụng đầu tôm trong chế biến chitin,

chitosan Ngô Thị Hoài Dương et al., 2008 cũng đã nghiên cứu đưa ra giải pháp tiền

xử lý bằng acid formic trong quy trình sản xuất chitosan từ đầu tôm nhằm giảm thiểulượng hóa chất và chất thải gây ô nhiễm môi trường Nguyễn Văn Thiết và Đỗ Ngọc

Tú (2008) đã nghiên cứu tách chiết chitin từ đầu - vỏ tôm bằng các phương pháp sinhhọc (sử dụng Bromelanin trong dịch ép vỏ dứa) Nhiều nghiên cứu trong nước đã tậndụng nguồn đầu tôm chủ yếu cho chế biến thức ăn gia súc Phan Thị Bích Trâm vàPhạm Thu Cúc (2004) đã xác nhận thành công của việc xử lý vỏ đầu tôm với rỉ đường

và enzyme dùng làm thức ăn cho gia súc, gia cầm Trịnh Ngọc Vinh (2006) đã tiến

hành ủ chua đầu vỏ tôm có thêm vi khuẩn Lactobacillus spp giúp quá trình lên men

được nhanh hơn Sau đó, khảo sát nồng độ đường, nồng độ muối, nồng độ vi khuẩn

Lactobacillus spp thích hợp trong việc bảo quản đầu vỏ tôm bằng phương pháp lên

Bảng 2.1 Thành phần hóa lý CO’ bản của thịt đầu tôm sú

Ngành Công nghệ Thực phấm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

-Vỉ»-Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ

men ủ chua Qua đó, góp phần tạo ra sản phẩm thức ăn gia súc có chất lượng cao hơn,

có tính phổ biến rộng rãi, giá trị kinh tế cao và giảm thiểu việc gây ô nhiễm môitrường Phạm Thị Đan Phượng và các cộng sự (2008) cũng đã nghiên cứu xử lýcarotenoprotein thu hồi từ quá trình sản xuất chitin và bước đầu thử nghiệm phối ưộnthức ăn cá

Các nghiên cứu này đều cho thấy tầm quan trọng của việc ứng dụng một hệ enzymeprotease nhằm trợ giúp cho quá trình thủy phân dịch protein có sẵn trong nguồnnguyên liệu đầu tôm này là cần thiết Đặc biệt, việc trích ly enzyme protease có sẵntrong nội tại của đầu tôm là vấn đề có ý nghĩa quan trọng

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ

Ngành Công nghệ Thực phấm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

-Vỉ»-Peptide

2.2.1 Tổng quan về protease

2.2.1.1 Khái niệm enzyme protease

Protease là nhóm enzyme xúc tác phản ứng thủy phân liên kết peptide của protein:

Hình 2.2 Phản ứng thủy phân liên kết peptide do tác động của protease

(Barrett, 2001) 2.2.1.2 Phân loại enzymeprotease

Việc phân loại nhóm enzyme protease được thay đổi qua các thời kỳ (Barrett, 2001).Theo Grassmann và Dyckerhoff, 1928 (ứích dẫn bởi Barrett, 2001) protease phân chiathành proteinase và peptidase Theo Bergmann và Ross (1936, ữích dẫn bởi Barrett,2001) gọi chung việc thủy phân liên kết peptide nên sử dụng danh từ peptidase và đượcchia thành hai nhóm là endopeptidase và exopeptidase Dựa trên việc phân tích nghĩarộng và nghĩa hẹp của từ “peptidase” nên để tránh nhầm lẫn theo yêu cầu của IUBMBprotease được coi là peptidase nhưng chia làm hai loại là endopeptidase (proteinase) vàexopeptidase Năm 1960, Hartley (trích dẫn bởi Phan Thị Bích Trâm, 2010) đã phânloại enzyme thủy phân protein theo bốn nhỏm dựa theo tên hóa học các amino acidtham gia vào tâm vị trí xúc tác:

Aspartic peptidase là những protease chứa nhóm carboxyl (-COOH) trong trungtâm hoạt động, tác động lên liên kết peptide tạo phức hợp trung gian bằng liênkết không cộng hóa ừị giữa enzyme và cơ chất Các nhóm carboxyl này thuộc

o

Amino component

Ngành Công nghệ Thực phấm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

-Vỉ»-Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học cần Thơ

mạch bên R của aspartic, glutamic hoặc có thể là nhóm carboxyl đầu c củachuỗi polypeptide Aspartic peptidase thường hoạt động trong vùng pH acid và

bị ức chế đặc hiệu bởi pepstatin

- Cysteine peptidase: Các enzyme thuộc nhóm này có nhóm thiol (-SH) củacysteine trong trung tâm hoạt động, tác động lên nhóm -CO của liên kết peptidetạo phức họp trung gian thiolacyl-enzyme Các cysteine peptidase thường hoạtđộng mạnh ở vùng pH trung tính, chúng chỉ hoạt động khi nhóm thiol ở trạngthái không bị bao vây Do đó các chất như cysteine, acid ascorbic thường có tácdụng làm bền và hoạt hóa enzyme này Cystatin, leupeptin là các chất ức chếthuận nghịch và E64 chất ức chế không thuận nghịch cho nhóm cysteinepeptidase rất thông dụng hiện nay

- Kim loại peptidase là những protease trong trung tâm hoạt động có chứa cácion kim loại trực tiếp tham gia phản ứng, chúng tác động lên liên kết peptidasetạo phức họp trung gian bằng liên kết không cộng hóa trị giống như nhómaspartic peptidase Nhóm kim loại peptidase hoạt động mạnh nhất ở vùng pHtrung tính và bị giảm hoạt tính dưới tác dụng của EDTA

- Serine peptidase: Là những protease có nhóm hydroxyl (-OH) của serine trongtrung tâm hoạt động Các peptidase serine này thường là hoạt động ở vùng pHkhá rộng tò trung tính đến kiềm, nhóm -OH của serine tác động lên nhóm -COcủa liên kết peptide tạo họp chất trung gian acyl-enzyme Các enzyme thuộcnhóm này thông dụng nhất là trypsin và chymotrypsin Chúng bị ức chế bấtthuận nghịch dưới tác dụng diisopropyl-phosphofluoridate (DFP),phenylmethanesulfonyl flouride (PMSF), coumarin và một số chất ức chếthuận nghịch như antitrypsin ở đậu nành (SBTI), aprotinin, chymostatin.Trong các nhóm protease được phân loại, ứng dụng rộng rãi ở nhiều lãnh vựcnhất là nhóm serine protease do chứng có khả năng thích ứng trong khoảng

pH khá rộng từ trung tính đến kiềm mạnh đã làm tăng khả năng ứng dụngnhóm enzyme này so với các nhóm protease khác Đặc biệt được ứng dụngrộng rãi trong các ngành công nghiệp thuộc da và chất tẩy rửa Hiện nay nhómserine protease đã được phát hiện và nghiên cứu trên nhiều đối tượng khácnhau với các tên thông dụng ở bảng 2.2

Endopeptidase NHiCHCOr NHCH NHCHCO - NHCHCONHCHCO NHCHCOOH

R4 R5

Carboxylpeptidase

Exopeptidase

Hình 2.3 Cv chế xúc tác của endopeptidase và exopeptidase

(Nguồn: Đặng Thị Đăng Phương, 2005)

Serine protease có chung nhóm phân loại EC 3.4.21 là một trong số cácenzyme được nghiên cứu khá rộng rãi ngoài khả năng thủy phân proteintrong quá trình tiêu hóa của động vật phổ biến nhất là trypsine,chymotrypsine và elastase Serine protease còn tham gia vào nhiều hiệntượng sinh lý trong cơ thể như phá cục máu nghẽn và hoạt hóa các bổ thể

(Phan Thị Bích Trâm, 2011; Gupta et aỉ., 2002) Trung tâm hoạt động của

nhóm enzyme này chứa các amono acid aspartic, histidine và serine trong

đó serine giữ vai trò trực tiếp gắn với cơ chất theo cơ chế được trình bày ở

Hình 2.4

Hình 2.4 Sơ đồ các bước xúc tác Ctf bản của nhóm serine protease

(Nguồn: Phan Thị Bích Trâm, 2011)

-P ’

MlchfUs comp/a*

ị ( 2 ) Gly,„ S«r 1M

Açyt-vnzynw intermediate

H -c -

I

p,

■N- ç- - -Ç-

V a!

Va!

chymottypsin Trypsir

Cơ chế theo hình 2.4 gồm 3 phản ứng:

Phản ứng 1: Nhóm -0H của serine trong trung tâm hoạt động enzyme kết hựp vớinhóm c=0 của liên kết peptide trong chuẫỉ polypeptide tạo phức hợp chuyển tiếp tứdiện (tretáhedral complex)

Phản ứng 2: Ở trạng thái phức hợp chuyển tiếp tứ diện thường kém bền nên chuyểndiện tích lên o tạo nhóm c=0 mới làm đứt liên kết peptide giải phóng mạchpolypeptide đầu N và hình thành các hợp chất trung gian acyl-enzyme mới

Phản ứng 3: Với sự có mặt của nước sẽ giải phóng mạch polypeptide đầu c còn lại

và khôi phục trung tâm hoạt động củã serỉne protease

Như vậy, ngoài cơ chế chung các enzyme thuộc nhóm này có tính chất cắt riêng biệt

là do trong phân tử protein có một “túi” (pocket) luôn được định vị gần trung tâmhoạt động nhóm serine (Hình 2.5)

V a l 2 , e U H « " « °

Eỉastasũ

Hình 2.5 Hình dạng các gốc amlno acid ờ các túi khác nhau của serine protease

(Nguồn: Phan Thị Bích Trâm, 2011)

Hình dạng và sự tích điện của túi khác nhau sẽ cho các vị trí cắt chuyên biệt của từngserine proteỉn khác nhau

Chymotrypsine với túi chỉ chứa các nhánh amino acid kỵ nước vì vậy nhóm này chỉthích hợp vởi các mạch bên -R của phenylalanin, tryptophan, tyrosine của chuỗipolypeptide

Trypsine với các tủi chửa aspartỉc ở vị trí trong cùng nên chỉ thích hợp với các mạchbên R của các amỉno acỉd tích điện dương ãíiư argmỉne, lysỉne

Elastase với túi chứa hai phân tử valine nên chỉ chứa đủ các amino acid của mạchbên R như glycine, alanine và valine.

Plasmin thuộc nhóm serine protease (EC 3.4.21.7) là enzyme quan trọng có mặt trongmáu để thủy phân các cục máu nghẽn fibrin, hoạt động giống trypsine có khả năngthủy phân các liên kết peptide có mạch bên R của asginine và lysine trong chuỗipolypeptide

(Gupta et al., 2002)

2.2.3 Protease của tôm sú

Sự tiêu hoá và trao đổi chất protein và các hçfp chất nitơ khác giữa các loài giáp xáckhác nhau rất nhiều Hầu hết, các cơ chế tiêu hoá và hấp thụ khác YỚi động vật cóxương sống Các enzyme tiêu hoá, đặc biệt các enzyme tiêu hoá protein ở giáp xácnói chung và của tôm nói riêng khá giống với enzyme có ừong dạ dày của cá Cácprotease tìm thấy trong tôm bao gồm carboxypeptidases A và B, trypsine,

chymotrypsine, cathepsine, và collagenase (Hernandez - Cortes et al., 1997; Honjo et

al., 1990; Kim et al., 1992; Liu and Cheung 1989; Nip et al., 1985; Roy et al., 1996;

Tsai et al., 1986; Van Wormhoudt et al., 1992).

Protease của tôm cũng như của các loài động vật thuỷ sinh khác là các protease nộibào, nó tập trung nhiều nhất ở cơ quan tiêu hoá, sau đó đến nội tạng và cơ thịt Đặcbiệt ở tôm do đặc điểm hệ tiêu hoá nội tạng nằm ở phần đầu nên hệ enzyme sẽ tậptrung nhiều nhất ở phần đầu sau đó đến các cơ quan khác

Phần lớn các nhỏm enzyme thuộc protease của tôm thường có tính chất chung củamột enzyme:

- Hòa tan được ữong nước, dung dịch nước muối sinh lý đệm phosphate trungtính, đệm Tris-HCl và một số dung môi hữu cơ nên dựa vào những đặc tínhnày để tách chiết chúng

- Bị kết tủa thuận nghịch bởi một số muối trung hòa (sulfate amonium), ethanol,acetone để thu nhận chế phẩm enzyme

- Hoạt tính của enzyme có thể tăng hoặc giảm dưới tác dụng của các chất hoạthóa hay ức chế

- Độ hoạt động của enzyme chịu ảnh hưởng rất lớn bởi các yếu tố: Nhiệt độ, pHmôi trường

Theo kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Trân Châu (1993) về protease đầu tôm biển

và Nguyễn Thị Mỹ Trang (2004) về protease đầu tôm bạc nghệ cho thấy các enzymetiêu hoá protein là các enzyme hoạt động mạnh trong môi trường kiềm

Theo Nguyễn Việt Dũng (1999) thì protease của tôm sú lại thể hiện hoạt tính cao ởmôi trường gần trung tính

Để ly trích protease từ đầu tôm sú, môi trường được sử dụng tương tự nhau Theomột số nghiên cứu cho thấy, hoạt tính protease trên một đơn vị khối lượng nội tạngcao hơn nhiều so với đầu tôm ở cùng chế độ tách chiết (gấp từ 3,41 - ^ 4 , 3 3 lần).Điều này dễ hiểu vì nội tạng tôm là cơ quan tiêu hóa nên tập trung nhiều enzyme, cònđầu tôm thì lại có thêm cả phần yỏ và thịt tôm có ít hoạt tính sinh học Hoạt tínhprotease cao của nội tạng tôm cũng giúp giải thích, sự hư hỏng xảy ra thường thấynhất ở tôm là hiện tượng long đầu, và thời gian bảo quản tôm đã bỏ đầu, tách chỉ baogiờ cũng dài hơn tôm nguyên con ở cùng điều kiện chế biến và bảo quản (Nguyễn Lệ

Hà, 2011)

Protease đầu tôm đều thể hiện hoạt tính rất yếu ở vùng acid, đạt cực đại ở vùng trungtính pH = 7 và giảm dần khi pH tăng ứong vùng điều kiện, điều này phù hợp với đặcđiểm của hệ enzyme tôm là không có pepsin hoạt động ứong môi trường acid

(Baranowski et al., 1984) Protease từ nội tạng tôm nhạy cảm với pH hơn và protease

từ đầu tôm còn nhạy cảm hơn nữa, việc tăng nhẹ pH trong vùng điều kiện cũng làmhoạt tính của chúng giảm đáng kể

2.2.4 Khả năng ứng dụng protease

2.2.4.1Các ứng dụng cơ bản

Protease là nhóm enzyme được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhaunhư công nghiệp chế biến thực phẩm, y học, nông nghiệp, công nghiệp thuộc da,công nghiệp sản xuất xà phòng

- Trong chế biến thực phẩm: Sử dụng nhiều nhất để cải tiến công nghệ sản xuấtnước mắm hoặc nước tương từ các chế phẩm cá, bánh dầu đậu nành bằng việc

bổ sung protease từ giai đoạn thô sơ dùng dịch chiết mủ đu đủ xanh, vỏ dứa,một cá, ruột lợn đến giai đoạn cao hơn dùng ché phẩm enzyme thêm vào quátrình thủy phân như chế phẩm bromelain, papain, ficin, chế phẩm protease từ

nấm mốc A oryzae, vi khuẩn Bacillus subtỉlỉs hoặc nấm sợi và cả các chế

phẩm từ đầu tôm Những kết quả nghiên cứu cho thấy khi bổ sung proteasevào cá thì hàm lượng đạm amin tăng cao, quá trình thủy phân nhanh hơn nênrút ngắn được thời gian chế biến nước mắm

- Một lĩnh vực khác nghiên cứu sản xuất bột đạm cao cấp cho trẻ em và ngườilớn tuổi từ bột đậu nành sử dụng chế phẩm prozima có chứa bromelain để cảibiến kích thước phân tử protein và xử lý các protein ức ché tiêu hóa có sẵntrong nguyên liệu, hoặc sử dụng các protease thương mại Alcalase,Novozyme, Flavourzyme thủy phân bột đậu nành tách béo nhằm làm tăng hàmlượng amino acid tự do đạt hiệu suất thủy phân cao và rút ngắn thời gian thủyphân làm giảm thiểu sự hoạt động của vi sinh vật Ngoài ra, enzyme proteasecòn được sử dụng trong các lĩnh vực chế biến thực phẩm khác như làmphomat, làm mềm thịt

- Trong y học: Một số protease như trypsine, a-chymotrypsine dùng sản xuấtthuốc chữa bệnh kém tiêu hóa, tiêu mủ các ổ viêm, làm thông đường hô hấprất thông dụng trên thị trường dược phẩm Nghiên cứu chế phẩm protease cótên gọi “prozimabo” trong điều trị bỏng giúp giả mạc rụng nhanh, vết bỏngnhanh khỏi Đặc biệt hiện nay protease được ứng dụng trong điều trị bệnh timmạch, chúng rất đa dạng và có nguồn gốc khác nhau: Từ động vật, thực vật,đến vi sinh vật, chúng thuộc nhóm serine protease có khả năng thủy phânfibrin, fibrinogen.

- Trong nông nghiệp: Protease được bổ sung vào thức ăn động vật nuôi nhằmtăng khả năng tiêu hóa, chúng được xử lý trực tiếp vào thức ăn trước khi sửdụng hoặc xử lý sơ bộ thức ăn Hiện nay, các chế phẩm vi sinh chứa hỗn họpprotease và các enzyme thủy phân khác cũng được sử dụng cho ngành nuôitrồng thủy sản làm tăng hệ số tiêu hóa, làm giảm thiểu sự ô nhiễm môi trườngnước nuôi

Ngoài ra protease còn ứng dụng rộng rãi ứong một số ngành khác như công nghiệpthuộc da để làm mềm da, tăng cường khả năng tách lông ra khỏi da nhưng không làmảnh hưởng đến chất lượng da Trong công nghệ sản xuất xà phòng làm tăng khả năngtẩy vết bẩn có thành phần là protein

(Phan Thị Bích Trâm, 2011)

2.2.4.2 ửng dụng của protease Mần nguồn gốc động vật

Protease ưa kiềm là nguồn cung cấp enzyme chủ yếu trên thị trường enzyme thế giới(Godfrey và West, 1996) Bên cạnh nguồn protease ưa kiềm nguồn gốc vi khuẩnđược ứng dụng rộng rãi ừong nhiều lĩnh vực công nghiệp, điển hình như Alkazym(Novodan, Conpenhagen, Đan Mạch), Tergazyme (Alconox, NewYork, USA),Ultrasil (Henkel, Dusseldorf, Đức), còn có nhiều enzyme nguồn gốc động vật, điểnhình như Pronod 153 L được ly trích từ máu, keratin protease (trích ly từ da, lôngheo) cũng được biết đến với nhiều ứng dụng trong lĩnh vực sản xuất xà phòng, xử lýchất thải, ứng dụng trong chế biến thức ăn gia súc nhờ vào việc thủy phân dịchprotein các phụ phẩm của thủy sản

Trong việc nghiên cứu enzyme người ta thường hay sử dụng dịch nghiền đồng thể.

Để thu nhận loại dịch này khối yật liệu sinh học được rửa sạch và nghiền trong cốihoặc trong một thiết bị chuyên dựng Trong khi nghiền người ta thêm nước hoặcdung dịch đệm và kính nghiền nát để giúp phá vỡ tế bào Sản phẩm thu được sau khinghiền được gọi chung là dịch đồng thể Trong khối dịch này chứa các mãnh tế bào,nhân, lục lạp của lá, ty thể và các bộ phận khác của tế bào như sắc tố, protein hòatan

Dịch nghiền sau đó được ly tâm phân đoạn ở các tốc độ tăng dần khác nhau Để thunhận các enzyme ứong dịch chiết hoặc từ các phân đoạn dưới tế bào có thể dùngnước, dung dịch đệm, dung dịch muối, hỗn họp glycerine với nước hoặc dung môihữu cơ Cho đến nay không có phương pháp ly trích và tinh sạch chung cho cácenzyme Để tách và tinh chế một enzyme nào đó cần biết lựa chọn và phối hợp mộtcách có hiệu quả nhất các biện pháp khác nhau

(Mai Xuân Lương, 2004)

Quá trình ly trích enzyme từ cơ chất rắn, dựa trên sự phân tách cấu tò (enzyme) từchất rắn (nguyên liệu) do tác động của dung môi, tuân theo định luật Fick (McCable

J*A Z : Thông lượng chất khuếch tán A theo phương z, kgmolA/ m2.giây

DAB: Hệ số khuếch tán của chất A vào B (dung môi), m2/giây

Xa: Phân mol chất A trong hệ thống

z: Khoảng cách khuếch tán (m)

Dấu (-) về mặt vật lý nghĩa là quá trinh khuếch tán xảy ra theo chiều giảm nồng độcủa chất khuếch tán

Nói cách khác, vận tốc truyền của một quá trình truyền tỷ lệ thuận YỚi động lực của

quá trình và tỷ lệ nghịch với trở lực của quá trình (McCabe et al., 1993) Động lực

của quá trình ly trích enzyme phụ thuộc vào sự chênh lệch nồng độ chất tan giữadung môi và cơ chất rắn (Lonsane và Krishnaiah, 1992); chịu sự chi phối của mức độxuyên thấu của dung môi vào cơ chất (mô tế bào động vật, nguyên liệu sử dụng trích

ly enzyme) hay khoảng cách khuếch tán - trở lực của quá trình ly trích (Harris,1995)

Dựa ừên phương trình (2.1), hiệu quả của quá trình ly trích phụ thuộc vào một số yếu

tố cơ bản:

- Sự chênh lệch nồng độ.

- Diện tích tiếp xúc

- Khả năng hòa tan của chất tan (hay enzyme) vào dung môi

- Độ nhớt của dung môi

- Khả năng khuếch tán của dung môi vào bên trong cơ chất rắn

Nói cách khác, đặc điểm của nguồn nguyên liệu - một trong những động lực thúc đẩy

sự chênh lệch nồng độ của enzyme trong cơ chất và dung môi, các điều kiện ly tríchnhư loại dung dịch đệm, pH của dung dịch sử dụng ly trích, thời gian cũng như nhiệt

độ ly trích là những yếu tố có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả thu hồi enzyme

2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly của enzyme

2.3.2.1Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi và nguyên liệu

Sự chênh lệch nồng độ chất tan giữa dung môi và canh trường bề mặt sau lên mencàng lớn sẽ thúc đẩy quá trình khuếch tán chất tan ra ngoài dung môi càng tăng

(McCabe et al., 1993) Khi tỷ lệ dung môi và cơ chất thấp, không đủ xâm nhập vào

toàn bộ mẫu sử dụng để trích ly (Lonsane và Krishnaiah, 1992), không đủ cho sựkhuếch tán chất tan (enzyme) vào dung môi Hơn nữa, một lượng dung môi sẽ đượcgiữ lại trong nguyên liệu cũng là nguyên nhân làm giảm hiệu quả thu nhận chất tan(Rao, 2010), hiệu quả thu nhận enzyme thấp Tuy nhiên, tỷ lệ dung môi và nguyênliệu cao, không những hoạt tính enzyme bị pha loãng mà còn tạo điều kiện thuận lợicho vi sinh vật hoạt động làm ảnh hưởng đến chất lượng của protein hay enzymetrích ly

2.3.2.2 Ảnh hưởng củapHmôi trường

Sự thay đổi pH ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính enzyme do liên quan đến sự tươngtác giữa enzyme và cơ chất Phản ứng xúc tác phụ thuộc vào diện tích phân bố trên cảenzyme lẫn cơ chất, cụ thể là trung tâm hoạt động của phân tò enzyme Mỗi enzymechỉ hoạt động mạnh nhất ở một pH xác định, gọi là pH tối ưu pH tối ưu cho hoạtđộng của các enzyme có nguồn gốc động yật, điển hình như protease từ nội tạng cátra (Trần Quốc Hiền và Lê Văn Việt Mần, 2006) hay từ thịt đầu tôm sú (Nguyễn Lệ

Hà, 2011) vào khoảng 7 Giá tri pH quá cao hay quá thấp có thể làm enzyme bị biếntính Giá trị pH tối ưu của mỗi enzyme có thể thay đổi trong một khoảng nhất địnhtùy theo tính chất và nồng độ cơ chất, nhiệt độ và bản chất của các loại dung dịchđệm (Phan Thị Bích Trâm, 2010).

2.3.2.3 Tác động của nhiệt độ và thời gian trích ly

Bản chất của enzyme là protein do đó nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến vận tốc phảnứng Nhiệt độ tăng kéo theo tốc độ phản ứng tăng nhưng đến mức nào đó thì tốc độphản ứng giảm xuống do enzyme bị biến tính Đa số enzyme có nhiệt độ tối ưukhoảng 40 50 °c Ở nhiệt độ trên 70 °c, phần lớn enzyme đều mất hoạt tính.Nhiệt độ tối ưu của các enzyme khác nhau thì không giống nhau, chúng tùy thuộcvào nguồn gốc sản sinh ra chúng Phần lớn nhiệt độ tối ưu của enzyme từ vi sinh vật,thực vật cao hơn động vật Nhiệt độ tối ưu của những enzyme không cố định mà thayđổi theo thời gian thủy phân, nồng độ enzyme, cơ chất phản ứng và dạng tồn tại củaenzyme (Rao, 2010)

Ngoài ra, thời gian trích ly cũng là một trong những yếu tố có ảnh hưởng đáng kể đếnhoạt tính enzyme Việc gia tăng nhiệt độ ly trích có tác động tích cực trong việc giatăng tính tan của dung môi, làm tăng vận tốc chuyển động và thúc đẩy quá trình thẩmthấu dung môi vào cơ chất và gia tăng khả năng khuếch tán, hay ly trích protease.Tuy nhiên, nhiệt độ ly trích cao có thể là nguyên nhân dẫn đến sự kém ổn định và ứcchế hoạt động của enzyme Điều này cũng xảy ra với trường hợp thời gian ly tríchdài Thời gian thủy phân nhanh hay chậm còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như kíchthước nguyên liệu cấu trúc loại protein, tác động đến sự khuếch tán enzyme vào dungmôi, khi enzyme phải xuyên qua khoảng trống bên trong với đường đi quanh co, kết

quả là khoảng cách khuếch tán dài (McCabe et al., 1993) Ở cùng tỷ lệ dung môi sử

dụng, thời gian ly trích ngắn sẽ không đủ cho quá trình ngấm dung môi vào nguyênliệu để khuếch tán enzyme, giảm hiệu suất thu nhận enzyme (Rao, 2010)

2.4 QUY HOẠCH THựC NGHIỆM XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN TRÍCH LY THÍCH HỢP BẰNG PHƯƠNG PHÁP BỀ MẶT ĐÁP ỨNG (RSM)

Phương pháp bề mặt đáp ứng YỚi mô hình phức hợp tại tâm (CCD) thường được sửdụng để mô phỏng điều kiện hoạt động tối ưu của một quá trình thông qua cácphương pháp thực nghiệm, cấp độ khác nhau hoặc các giá trị của điều kiện hoạt độngbao gồm các yếu tố trong mỗi thí nghiệm Các yếu tố này có thể là yếu tố phân loại(ví dụ nguồn nguyên liệu sử dụng) hay định lượng (tỷ lệ thành phần khảo sát, nhiệtđộ, )• Tuy nhiên, trong thực tế, các biến phân loại phải được xử lý một cách riêngbiệt bằng cách so sánh các điều kiện hoạt động tốt nhất đối với các biến đinh lượngqua sự kết hợp khác nhau (Lenth, 2011)

Sử dụng phương pháp bình phương nhỏ nhất và các nội dung phân tích hồi quy, phântích phương sai để xác định giá trị của các hệ số ừong phương trình hồi quy đa thức

Tùy theo loại thực nghiệm mà phương trình hồi quy là tuyến tính hay phi tuyến(Giovanni, 1983) Các dạng phương trình hồi quy thường áp dụng đối với lĩnh vựccông nghệ hóa học và công nghệ sinh học gồm:

Phương trình bậc hai tuyến tính: y = <p(x l ,x 2 , ,x k ) = b a

Xj: Là nhân tố được mã hóa ảnh hưởng đến y

bj: Là hệ số tuyến tính hay hệ số hồi quy bậc 1 mô tả ảnh hưởng của nhân tố Xj

MÔ hình thống kê thực nghiệm chỉ có thể sử dụng sau khi đã thỏa mãn các tiêu

chuẩn thống kê (Student và Fisher) (Cheynier et al., 1983).

2.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN cứu TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ TRÍCH LY

VÀ ỨNG DỤNG CỦA PROTEASE NGUỒN GỐC ĐỘNG VẬT

2.5.1 Nghiên cứu trong nước

Nghiên cứu trích ly proease từ các nguồn động yật đã bắt đầu được quan tâm trongthời gian gần đây Nguyễn Lệ Hà (2011) đã tiến hành nghiên cứu tách chiết và ứng

dụng enzyme protease từ tôm sú Penaeus monodon vào chế biến thủy sản Kết quả

thu nhận enzyme protease tinh sạch Chế phẩm enzyme (CPE) protease từ đầu (hoặcgan tụy) tôm sú có thể thu nhận được qua các bước cơ bản: Chiết rút enzyme từnguyên liệu đã nghiền nhỏ bằng Tris-HCl 0,05 M pH 7,5 YỚi tỉ lệ 1: 3 (w/v), thờigian chiết 40 phút (đối với đầu tôm) và 60 phút (đối với gan tụy) Dịch chiết (DC)thu được bằng cách cho qua rây có lỗ với kích thước 1 mm2 để loại lượng lớn vỏ tôm,sau đó ly tâm 6000 vòng/phút (rpm), 15 phút, loại cặn đem làm thức ăn gia súc Kếttủa DC bằng ethanol với nồng độ 80%, 50 phút để điều chế CPE từ đầu tôm hoặc

bằng (NH4)2SC>4 70%, 70 phút để thu CPE từ gan tụy tôm Công đoạn ly tâm thuCPE cũng được thực hiện ở 6000 rpm trong 15 phút.

Trước đó, Trần Quốc Hiền và Lê Văn Việt Man (2006) cũng đã đề xuất thu nhận chếphẩm enzyme protease từ ruột cá basa (Pangasius bocourti) Dịch chiết protease kiềm

thu được từ ruột có tổng hoạt tính cao nhất là 15,79 UI/gCKNT (chất khô nội tạng)trong điều kiện tỷ lệ mẫu và dung môi sử dụng là 1: 1 (w/v); pH 9,5; nhiệt độ 35 °c

và thời gian chiết 10 phút Dung môi isopropanol là tác nhân thích họp nhất để kếttủa protease trong dịch chiết từ ruột cá basa Với tỷ lệ thể tích dịch chiết enzyme vàthể tích isopropanol là 15/85, mức tinh sạch chế phẩm protease kiềm là 1,65 lần vàhiệu suất thu hồi enzyme đạt được là 90,42%

Bên cạnh đó việc trích ly protease trực tiếp từ nguồn nguyên liệu động thực vật vàứng dụng trong thủy phân protein cũng được tiến hành tà rất sớm Phan Thị Hồng

Hải và ctv (2001) đã nghiên cứu tinh chế protease từ sán lá gan (Fasciolagigatica).

Vũ Văn Bội (2004) đã nghiên cứu quá trình thủy phân protein cá bằng protease từ

Bacillus subtỉlis S5 Trong năm này, Đỗ Văn Ninh (2004) cũng đã công bố tối ưu hóa

quá trình phân giải protein của protease trong thịt cá và thử nghiệm sản xuất sảnphẩm mới từ protein được thủy phân

2.5.2 Nghiên cứu ngoài nước

Nhiều nghiên cứu ừên thế giới cũng quan tâm đến việc trích ly protease từ phụ phẩmthủy sản đã được thực hiện từ rất sớm Corvisat (1857) đã chứng tỏ khả năng chiếttách trypsine từ dịch tụy, đây là protease đầu tiên được thu nhận nhưng chưa tinhsạch Danivevski (1862) chiết tách trypsin, amylase tụy tạng bằng phương pháp hấpphụ Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong chiết tách và nghiên cứu các tínhchất của enzyme cũng như protein Tiếp theo đó là Hommarsten (1872) chiết táchđược Chymosine (trích dẫn tà Nguyễn Lệ Hà, 2011)

Gần đây, Min-Soo Heu et al (2002) đã nghiên cứu ừích ly, kết tủa phân đoạn hoạt

tính protease từ phụ phẩm tôm Quá trình trích ly protease được nghiên cứu riêng lẻcho từng thành phần các phụ phẩm (đầu, thân, đuôi) được loại bỏ trong quá trình chếbiến Phụ phẩm sau khi xử lý và được trích ly bằng nước cất, ly tâm thu được dịchtrích thô, dịch trích thô kết tủa phân đoạn bởi ammonium sulfate Kết tủa ở 2 nồng độ

30 50% (chất chỉ thị NPS-I và SS-I), và 50 70% (chất chỉ thị NPS-IIvà

SS-II), sau đó ly tâm thu được kết quả tương ứng Hoạt động Endoprotease của dịchtrích thô là 0,2 u/mg đối với Hemoglobin (Hb, pH 3,0), 0,16 u/mg đối với azocasein(Ac, pH 6,0) và 0,12 u/mg đối với benzoyl-Arg-P-Naphthylamide (BANA, pH 7,0)

Naphthylamide (ArgNA, pH 7,0), 0,06-0,11 u/mg đối với Lys-0- Naphthylamide(LysNA, pH 7,0) và 0,08 -ỉ- 0,09 u/mg đối với Leu-(3- Naphthylamide (LeuNa, pH7,0) Hoạt động của endoprotase tăng từ 5 7,4 lần đối với NPS-I và SS-I, và 1,9 +

2,7 lần đối với NPS-II và SS-II Trong khi đó, exoprotease tăng từ 3,6 -ỉ- 4,8 lần đốivới NPS-I và SS-I, và 5,6 7,2 lần đối với NPS-II và SS-II

Từ các nghiên cứu thực tế trong và ngoài nước ở lĩnh vực trích ly và ứng dụngprotease từ nguồn động vật, một số vấn đề cơ bản cần quan tâm là:

- Sự ổn định của nguồn nguyên liệu cung cấp protease

- Các điều kiện trích ly enzyme phụ thuộc rất lớn vào đặc điểm từng loạienzyme và nguồn nguyên liệu, trong đó tỷ lệ dung môi sử dụng để hòa tanenzyme, tác động của pH, nhiệt độ và thời gian trích là các yếu tố có tầm quantrọng cao nhất

- Việc xác định các tính chất cơ bản của enzyme là cơ sở bước đầu trong việc

dự đoán đặc điểm, phương thức hoạt hóa và lĩnh vực ứng dụng của proteasekhảo sát

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

■

Địa điểm: Thực hiện bố trí thí nghiệm, đo đạc kết quả, xử lý số liệu tại phòng thínghiệm Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng,Trường Đại học cần Thơ

Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 05/8/2013 đến 15/11/2013

- Cân điện tử Vibra, model DJ-1000TW, độ chính xác 0,0 lg, Nhật

- Cân điện tử Ohaus, model AR-240, độ chính xác 0,0001 g, Nhật

- Máy ly tâm, model 800 Electronic Centrifuge, Trung Quốc

- Nhiệt kế HANNA, model S42866, độ chính xác 0,1, Ý

- pH kế HANNA, model TOA pH meter HM-12P, độ chính xác 0,01, Ý

- Tủ đông Acson International, model Acson R134a, nhiệt độ cấp đông -25 °c, Nhật

- Máy khuấy từ Toshiba (Magnestir MG-10, Nhật)

- Bộ điều nhiệt (Memmert, Đức, điều chinh đến cận 100 °c, độ chính xác 0,1

°C)

- Máy xay sinh tố Big Sar Model PP179, 3 tốc độ, từ 2000 vòng/phút (rpm) đến 4000 rpm.

- Máy quang phổ so màu (Model 722, Trung Quốc)

- Một số dụng cụ thủy tinh phòng thí nghiệm và một số dụng cụ khác có liên quan

3.1.3 Hóa chất sử dụng

- Kali dihydrogen phosphate dehydrate (KH2PO4), (Trung Quốc, độ tinh khiết99%)

- Disodium hydrogen photphate dodecahydrate (Na2HP04.12H20), (Merck)

- Glycine, (Trung Quốc, độ tinh khiết 99,5%)

- Hóa chất sử dụng để trích ly enzyme (các dung dịch đệm): Phosphate, NaOH,

Na2HP04, NaH2P04 (Merck)

- Hóa chất để xác định hoạt tính enzyme: Tyrosine; HC1 0,2 N; NaOH 0,5 N;Trichloacetate acid (TCA); Folin; casein dạng bột (Merck, Đức)

- Các hóa chất có liên quan khác

Thịt đầu tôm sú được cung cấp từ ấp Bưng Cốc, xã Phú Mỹ, huyện Thạnh Trị, tỉnhSóc Trăng Mầu được giữ lạnh trong thùng xốp bằng nước đá, nhiệt độ bảo đảmdưới 4 °c, thời gian vận chuyển về phòng thí nghiệm tối đa 2 giờ

3.2.2 Phương pháp chuẩn bị mẫu

Thịt đầu tôm sú sau khi đưa về phòng thí nghiệm được rửa sơ bộ, để ráo nước,phân chia thành các mẫu có khối lượng xác định (khối lượng mẫu sử dụng cho mộtđơn vị thí nghiệm là 200 g/mẫu), bao gói trong bao bì PA và trữ đông ở -18 ± 2 °c

3.2.3 Phương pháp trích ly enzyme protease từ thịt đầu tôm sú

Thịt đầu tôm sú đông lạnh được phối trộn với dung môi theo tỷ lệ phù hợp Nhiệt

độ dung môi trước khi phối trộn là 2 4 °c Tiếp theo, hỗn hợp được nghiềnbằng

máy quay sinh tố (tốc độ quay của motor ở mức 2, 3000 rpm) trong thời gian 3phút trước khi quá trình trích ly enzyme bắt đầu Trong quá trình nghiền, nhiệt độkhông vượt quá 5 °c (Trần Quốc Hiền và Lê Văn Việt Man, 2006)

Sau khi nghiền, mẫu được đổ vào cốc thủy tinh, ủ ở điều kiện nhiệt độ và thời giankhác nhau để chiết rủt enzyme Chú ý khuấy đảo mẫu 5 phút/lần Dịch chiết thuđược bằng cách cho vải lọc có lỗ với kích thước l m m * l m m để loại lượng lớnphần chất khô không hòa tan (bã tôm), sau đó làm lạnh (bằng cách cho dịch sau lọcvào tủ đông) trong 15 phút trước khi chuyển sang ly tâm 3000 rpm ữong thời gian