CHƯƠNG 4 KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.4 ẢNH HƯỞNG CỦA TƯƠNG TÁC NHIỆT ĐỘ VÀ THỜI GIAN
TRÍCH LY ĐẾN HIỆU QUẢ THU NHẶN PROTEASE TỪ THỊT ĐẦU TÔM sú
Hai yếu tố thời gian và nhiệt độ trích ly được chọn để thực hiện qui hoạch thực nghiệm do các yếu tố trên ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính enzyme protease. Bản chất của enzyme là protein do đó nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến vận tốc phản ứng. Nhiệt độ tăng tốc độ phản ứng tăng nhưng đến mức nào đó thì tốc độ phản Bảng 4.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH ứng với dung môi đến hiệu quả trích ly protease
pH của dung môi Hoạt tính protease (U/g)
Nước cât (đôi chứng) l,921a± 0,062
7 2,426a ± 0,419
8 2,426a ± 0,355
9 3,753b ± 0,380
11 3,227bc± 0,210
10 2,446c ±0,176
Các giá trị có mẫu tự đi kèm giống nhau trong cùng một cột khác biệt không ý nghĩa về mặt thống kê theo
ứng giảm xuống do enzyme bị biến tính. Do đó khảo sát nhịêt độ kết hợp với thời gian là điều kiện quan trọng ảnh hưởng đến quá trình trích ly. Như đa số các enzyme khác, protease cũng rất nhạy cảm với nhiệt độ. Phần lớn các enzyme này bị giảm hoạt tính từ 60 °c và bị vô hoạt ở nhiệt độ trên 70 °c (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Trong điều kiện khảo sát, hai yếu tố không thay đổi trong quá trình khảo sát là:
+ Tỷ lệ mẫu:dung môi: 1: 4 (w/v) - được lựa chọn từ thí nghiệm 1 + Giá trị pH của dung môi trích ly glycine-NaOH dùng để trích ly là 9 từ kết quả của thí nghiệm 2
Nghiên cứu sử dụng phương án trực giao cấp 2 với 18 đơn vị thí nghiệm, bao gồm số thí nghiệm khảo sát N = 3 X 5 =15, trong đó có một thí nghiệm ở tâm phương án và thực hiện thêm ba thí nghiệm ở tâm nữa để kiểm tra ý nghĩa các hệ số của phương trình hồi qui.
Hai yếu tố cần khảo sát là:
+ Xi: Là nhiệt độ trích ly với 5 mức khảo sát, mức thấp nhất (-2) tương ứng 30°c, mức -1 tương ứng nhiệt độ 40 °c, tâm (mức 0) 50 °c và hai mức nhiệt độ cao 60°c (+1) và 70 °c (+2).
+ X2: Là thời gian trích ly với 3 mức khảo sát, mức dưới (-1) tương ứng 20 phút;
tâm: 40 phút và mức trên (+1) 60 phút.
Hàm mục tiêu Y: Tổng hoạt tính protease thu được trong dịch trích ly (U/g CKNL).
Ma trận qui hoạch thực nghiệm quá trình trích ly protease từ thịt đầu tôm sú được trình bày ở bảng 4.3.
Bảng 4.3 Ảnh hưởng của các nhân tố mã hóa đối vói phưong trình hồi quy
Nhân tô Tông bình
phương
Bậc tự do Phương sai Tỷ sô F Giá trị p
Xi:Nhiệt độ+block 23,9419 1 23,9419 50,10 0,0000
X2:Thời gian+block 4,83025 1 4,83025 10,11 0,0260
Xi2+block 636,607 1 636,607 1332,22 0,0000
XiX2+block 104,835 1 104,835 219,39 0,0000
X22+block 26,0273 1 26,0273 54,47 0,0000
blocks 1,44018 2 0,720092 1,51 0,2323
Sai số 21,9813 46 0,477853
Hình 4.3 Ảnh hưởng của các thừa sổ khảo sát (tương tác đơn, tương tác đa) đến quá trình trích ly protease từ thịt đầu tôm sú
Từ bảng tổng họp 4.3 cho thấy, giá trị p của các lần lập lại của thí nghiệm (block) có giá trị p = 0,2323 > 0,05, chứng tỏ độ tin cậy của kết quả đo đạc giá trị protease tương ứng với các mẫu trích ly ở các lần khảo sát khác nhau. Đồng thời, tất cả giá trị p của các thừa số khảo sát đều nhỏ hơn 0,05 và giá trị F lớn hơn 10 đã chứng tỏ các nhân tố khảo sát đều ảnh hưởng đến quá trình trích ly protease từ thịt đầu tôm sú. Hệ số hồi quy bậc một của Xi, X2 cũng như hệ số tương tác của X1X2 đều khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy 95%, đồng thời hệ số hồi quy bậc hai của X12 và X22 cũng khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê. Đồ thị thể hiện sự tương tác của các thừa số khảo sát ở hình 4.3 cũng góp phần khẳng định mức độ ảnh hưởng của từng biến độc lập cũng như các tương tác có ý nghĩa đến quá trình trích ly protease được khảo sát.
Sự tương tác của thời gian và nhiệt độ được thấy rõ qua biểu đồ ở hình 4.4.
15 12
9
6
3
Hình 4.4 ĐỒ thị biểu diễn sự tương tác của nhiệt và thòi gian đến hoạt tính của enzyme protease được chiết tách
Từ đồ thị tổng quát biểu diễn sự tương tác của cặp nhân tố nhiệt độ và pH đến hoạt tính protease thu nhận ở hình 4.4 cho thấy, hai nhân tố này thật sự có sự ảnh hưởng đồng thời đến quá trình trích ly enzyme protease. Với nhiệt độ ứích ly thấp và thời gian ly trích ngắn cho hiệu quả ly trích kém, trong khi đó, nếu nâng nhiệt độ ly trích lên mức cao nhất và thòi gian ly ứích kéo dài, protease bị mất hoạt tính.
Đồ thị bề mặt đáp ứng và đồ thị đường đồng điểm được thể hiện đồng thời ở hình 4.5 một lần nữa khẳng định cả hai yếu tố pH và nhiệt độ đều ảnh hưởng đến quá trình trích ly protease từ thịt đầu tôm sú. Giá trị cao nhất của hàm mục tiêu Y khi Xi có giá tri trong khoảng tà -1 đến 0 (40 °c đến 50 °C) và X2 có giá trị trong khoảng từ 0 đến +1 (40 đến 60 phút).
Phương trình thực nghiệm tối ưu hóa hai nhân tố thời gian và nhiệt độ đối với quá trình trích ly thông qua kết quả thí nghiệm có được là: Y=13,3812 - 0,515772*Xi + 0,401258*x2 - 2,07049*Xi2 - 1,32184*Xi*X2 - l,432*x22 với R2 = 0,975(7).
Interaction Plot for UI
UI,0 1,0 2,0
3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.1 11,0 - 12,0 - 13,0
14,0
Hình 4.5 ĐỒ thị biểu diễn sự tương tác
của nhiệt độ và thòi gian trích ly đến
hoạt tính của
enzyme protease được chiết tách
Giá trị pH và nhiệt độ tối ưu cho quá trình trích ly enzyme từ thịt đầu tôm sú khi giải phương trình hồi qui (1). Dựa theo kết quả thu được trên hình 4.5, điều kiện thích hợp để chiết enzyme từ thịt đầu tôm sú cho những thí nghiệm tiếp theo tương ứng với Xi=
-0,2 và X2= + 0,23.
Nhiệt độ và thời gian trích ly tối ưu được tính theo công thức 3.2 (mục 3.25) _{X j -X ũ j ) _ 2{XrX])
( X — X ì
V j max ỹmin '
AX,
Kết quả xác định thu được giá trị nhiệt độ trích ly tối ưu là 46 °c và thời gian tương ứng là 44,6 phút. Trong khảo sát thực tế, chọn lựa mức nhiệt độ 42 °c và thời gian ủ là 50 phút, hoạt tính protease đạt được ở điều kiện ly trích tối ưu là 13,48 u/g.
y = 1,0149x- 0,0032 R2 = 0,9752
4 6 8 10 12
Hoạt tính protease lý thuyết (u/g)
Hình 4.6 Đồ thị tưvng quan giữa họat tính protease xác định bằng thực nghiệm và tính toán theo phương trình hồi quy
Thoi Nhiet
Estimated Response Surface
X j
1 6 1 4 1
2
1 0
8 6
Hoạt tính protease thu được từ thực nghiệm và tính toán theo phương trình có độ tương thích cao ở giá trị R2 = 0,9752 (hình 4.6). Như vậy có thể kết luận rằng phương trình hồi quy đã mô tả đúng các kết quả thực nghiệm. Hệ số tương quan cho biết 97,5% sự biến đổi hoạt tính protease là do ảnh hưởng của các biến độc lập Xi, X2 và chỉ có 2,5
% sự thay đổi là do các yếu tố không xác định được gây ra.
Kết quả thí nghiệm của Nguyễn Lệ Hà (2011) cho thấy protease trong gan tụy và đầu tôm hoạt động tốt trong khoảng 52 -ỉ- 67 °c với nhiệt độ tối ưu là 62 °c và thời gian tối ưu để tách chiết là 40 phút (đối với đầu tôm) và 60 phút (đối với gan tụy). Kết quả Trần Quốc Hiền và Lê Văn Việt Mần (2006) khi tiến hành thí nghiệm hai nhân tố riêng biệt ở ruột cá ba sa là tăng nhiệt độ trích ly cao hơn 40 °c thì tổng hoạt tính enzyme thu được bị giảm đi. Do khoảng nhiệt độ 50 -í- 60 °c là thích hợp cho các phân tử protease xúc tác thủy phân lẫn nhau. Hơn nữa, nhiệt độ cao có thể làm biến tính bất thuận nghịch enzyme. Còn ở thí nghiệm với thời gian thì tối ưu để trích ly là 10 phút, dịch trích ly enzyme từ ruột cho tổng hoạt tính protease cao nhất. Đồng thời con cho biết kéo dài thời gian trích ly vượt hơn 10 phút thì tổng hoạt tính protease thu được trong dịch chiết không tăng nữa mà còn bị giảm nhẹ. Do thời gian dài, các phân tử protease trong dịch trích ly xúc tác phản ứng thủy phân lẫn nhau. Nhưng khi tiến hành thí nghiệm kết hợp pH và nhiệt độ Trần Quốc Hiền và Lê Văn Việt Mần lại có được nhiệt độ tối ưu là 35 °c.
Kết quả thực nghiệm cho thấy hoạt tính protease trong thịt đầu tôm sú tăng đều từ 20 đến 60 phút đối với điều kiện nhiệt độ 30 và 40 °c, và giảm dần theo thời gian 20, 40, 60 phút ở các nhiệt độ cao hơn. Hoạt tính cao trong khoảng 40 -ỉ- 60 phút với thời gian tối ưu là 44,6 phút ở 46 °c. Nhiệt độ có ảnh hưởng đến quá trình trích ly khá rõ, khi nhiệt độ tăng từ 40 °c lên thành 50 °c thì hàm lượng tyrosine và tryptophane tạo thành tăng mạnh. Tuy nhiên khi nhiệt độ tiếp tục tăng từ 50 °c thành 60 °c thì hàm lượng tyrosine và tryptophane lại tăng không đáng kể và giảm hẳn khi thủy phân ở nhiệt độ 70 °c. Phân tích cảm quan mẫu trích ly ở 30 và 40°c cho thấy dịch trích ly có màu nâu nhạt, mùi nhẹ hơn so với các mẫu ủ ở 50, 60, 70°c vào cùng thời điểm lấy mẫu, bắt đầu xuất hiện mùi “tôm luộc” thường có - khi chế biến thực phẩm tại nhà. Đối với các mẫu trích ly ở nhiệt độ 50, 60, 70 °c dịch có màu đỏ hồng, loãng hơn, mùi tanh giảm nhiều.
Như vậy, không nên áp dụng nhiệt độ trích ly dưới 30 °c, và việc tăng nhiệt độ lên trên 70 °c cũng là điều không cần thiết vì dễ gây biến tính protease mà hoạt tính protease thu được không cao, chưa kể đến việc tiêu tốn năng lượng khi nâng nhiệt.