1. Điều kiện ủ và phương pháp tách chiết giữ cố định (Hình 3.3)
TRÍCH LY ĐẾN HIỆU QUẢ THU NHẶN PROTEASE TỪ THỊT ĐẦU TÔM sú
protease cao nhất (3,823 u/g CKNL) khi sử dụng dung dịch đệm có giá trị pH=9,0. Khi tăng pH từ 7,0 đến 9,0, tổng hoạt tính protease của dịch trích ly enzyme thu được tăng từ 2,426 đến 3,823 u/g CKNL, tức tăng khoảng 1,6 lần. Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng giá trị pH từ 9,0 đến 11,0 thì tổng hoạt tính protease của dịch trích ly enzyme thu được sẽ giảm khoảng 1,18 lần. So với mẫu kiểm chứng sử dụng dung môi là nước cất, khi sử dụng dung dịch đệm pH 9,0 để trích ly enzyme từ thịt đầu tôm sú thì tổng hoạt tính protease thu được cao hơn khoảng 2 lần.
Bảng giá trị trên đươc sắp xếp theo hoạt tính tăng dần từ mẫu dung môi đối chứng đến pH 9 tương ứng dung môi Glycine - NaOH và giảm dần khi pH tăng. Từ đó cho thấy pH của dung môi tối ưu nhất là dung môi Glycine - NaOH pH 9 YỚi tổng giá trị hoạt tính là 3,753 (U/g). Đối chiếu với kết quả của Nguyễn Lệ Hà (2011) là dùng đệm Tris - HC1 0,05 M pH 7,5 là điều kiện ly trích tối ưu còn với khảo sát của Trần Quốc Hiền và Lê Văn Việt Mần (2006) là Glycine - NaOH pH 9,5. Kết quả khảo sát cho thấy, việc lựa chọn loại dung môi và pH phù hợp tùy thuộc vào từng loại nguyên liệu. Với giá trị pH thích hợp cho quá trình trích ly protease từ thịt đầu tôm sú là 9,0 đã góp phần khẳng định protease khảo sát thuộc nhóm protease kiềm (Trần Quốc Hiền và Lê Văn Việt Mần, 2006).
4.4 ẢNH HƯỞNG CỦA TƯƠNG TÁC NHIỆT ĐỘ VÀ THỜI GIAN
TRÍCH LY ĐẾN HIỆU QUẢ THU NHẶN PROTEASE TỪ THỊT ĐẦU TÔM sú TÔM sú
Hai yếu tố thời gian và nhiệt độ trích ly được chọn để thực hiện qui hoạch thực nghiệm do các yếu tố trên ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính enzyme protease. Bản chất của enzyme là protein do đó nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến vận tốc phản ứng. Nhiệt độ tăng tốc độ phản ứng tăng nhưng đến mức nào đó thì tốc độ phản
Bảng 4.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH ứng với dung môi đến hiệu quả trích ly protease
pH của dung môi Hoạt tính protease (U/g)
Nước cât (đôi chứng) l,921a± 0,062
7 2,426a ± 0,419
8 2,426a ± 0,355
9 3,753b ± 0,380
11 3,227bc± 0,210
10 2,446c ±0,176
Các giá trị có mẫu tự đi kèm giống nhau trong cùng một cột khác biệt không ý nghĩa về mặt thống kê theo
ứng giảm xuống do enzyme bị biến tính. Do đó khảo sát nhịêt độ kết hợp với thời gian là điều kiện quan trọng ảnh hưởng đến quá trình trích ly. Như đa số các enzyme khác, protease cũng rất nhạy cảm với nhiệt độ. Phần lớn các enzyme này bị giảm hoạt tính từ 60 °c và bị vô hoạt ở nhiệt độ trên 70 °c (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Trong điều kiện khảo sát, hai yếu tố không thay đổi trong quá trình khảo sát là:
+ Tỷ lệ mẫu:dung môi: 1: 4 (w/v) - được lựa chọn từ thí nghiệm 1 + Giá trị pH của dung môi trích ly glycine-NaOH dùng để trích ly là 9 từ kết quả của thí nghiệm 2
Nghiên cứu sử dụng phương án trực giao cấp 2 với 18 đơn vị thí nghiệm, bao gồm số thí nghiệm khảo sát N = 3 X 5 =15, trong đó có một thí nghiệm ở tâm phương án và thực hiện thêm ba thí nghiệm ở tâm nữa để kiểm tra ý nghĩa các hệ số của phương trình hồi qui.
Hai yếu tố cần khảo sát là:
+ Xi: Là nhiệt độ trích ly với 5 mức khảo sát, mức thấp nhất (-2) tương ứng 30°c,
mức -1 tương ứng nhiệt độ 40 °c, tâm (mức 0) 50 °c và hai mức nhiệt độ cao 60°c
(+1) và 70 °c (+2).
+ X2: Là thời gian trích ly với 3 mức khảo sát, mức dưới (-1) tương ứng 20 phút; tâm: 40 phút và mức trên (+1) 60 phút.
Hàm mục tiêu Y: Tổng hoạt tính protease thu được trong dịch trích ly (U/g CKNL).
Ma trận qui hoạch thực nghiệm quá trình trích ly protease từ thịt đầu tôm sú được trình bày ở bảng 4.3.
Bảng 4.3 Ảnh hưởng của các nhân tố mã hóa đối vói phưong trình hồi quy
Nhân tô Tông bình
phương
Bậc tự do Phương sai Tỷ sô F Giá trị p
Xi:Nhiệt độ+block 23,9419 1 23,9419 50,10 0,0000 X2:Thời gian+block 4,83025 1 4,83025 10,11 0,0260 Xi2+block 636,607 1 636,607 1332,22 0,0000 XiX2+block 104,835 1 104,835 219,39 0,0000 X22+block 26,0273 1 26,0273 54,47 0,0000 blocks 1,44018 2 0,720092 1,51 0,2323 Sai số 21,9813 46 0,477853
Hình 4.3 Ảnh hưởng của các thừa sổ khảo sát (tương tác đơn, tương tác đa) đến quá trình trích ly protease từ thịt đầu tôm sú
Từ bảng tổng họp 4.3 cho thấy, giá trị p của các lần lập lại của thí nghiệm (block) có giá trị p = 0,2323 > 0,05, chứng tỏ độ tin cậy của kết quả đo đạc giá trị protease tương ứng với các mẫu trích ly ở các lần khảo sát khác nhau. Đồng thời, tất cả giá trị p của các thừa số khảo sát đều nhỏ hơn 0,05 và giá trị F lớn hơn 10 đã chứng tỏ các nhân tố khảo sát đều ảnh hưởng đến quá trình trích ly protease từ thịt đầu tôm sú. Hệ số hồi quy bậc một của Xi, X2 cũng như hệ số tương tác của X1X2 đều khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy 95%, đồng thời hệ số hồi quy bậc hai của X12 và X22 cũng khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê. Đồ thị thể hiện sự tương tác của các thừa số khảo sát ở hình 4.3 cũng góp phần khẳng định mức độ ảnh hưởng của từng biến độc lập cũng như các tương tác có ý nghĩa đến quá trình trích ly protease được khảo sát.
15
12
9
6
3
Hình 4.4 ĐỒ thị biểu diễn sự tương tác của nhiệt và thòi gian đến hoạt tính của enzyme protease được chiết tách
Từ đồ thị tổng quát biểu diễn sự tương tác của cặp nhân tố nhiệt độ và pH đến hoạt tính protease thu nhận ở hình 4.4 cho thấy, hai nhân tố này thật sự có sự ảnh hưởng đồng thời đến quá trình trích ly enzyme protease. Với nhiệt độ ứích ly thấp và thời gian ly trích ngắn cho hiệu quả ly trích kém, trong khi đó, nếu nâng nhiệt độ ly trích lên mức cao nhất và thòi gian ly ứích kéo dài, protease bị mất hoạt tính.
Đồ thị bề mặt đáp ứng và đồ thị đường đồng điểm được thể hiện đồng thời ở hình 4.5 một lần nữa khẳng định cả hai yếu tố pH và nhiệt độ đều ảnh hưởng đến quá trình trích ly protease từ thịt đầu tôm sú. Giá trị cao nhất của hàm mục tiêu Y khi Xi có giá tri trong khoảng tà -1 đến 0 (40 °c đến 50 °C) và X2 có giá trị trong khoảng từ 0 đến +1 (40 đến 60 phút).
Phương trình thực nghiệm tối ưu hóa hai nhân tố thời gian và nhiệt độ đối với quá trình trích ly thông qua kết quả thí nghiệm có được là: Y=13,3812 - 0,515772*Xi + 0,401258*x2 - 2,07049*Xi2 - 1,32184*Xi*X2 - l,432*x22với R2 = 0,975(7).
UI,0 1,0 2,0 ,0 1,0 2,0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.1 11,0 - 12,0 - 13,0 14,0
Hình 4.5 ĐỒ thị biểu diễn sự tương tác của nhiệt độ và thòi gian trích ly đến hoạt tính của
enzyme protease được chiết tách
Giá trị pH và nhiệt độ tối ưu cho quá trình trích ly enzyme từ thịt đầu tôm sú khi giải phương trình hồi qui (1). Dựa theo kết quả thu được trên hình 4.5, điều kiện thích hợp để chiết enzyme từ thịt đầu tôm sú cho những thí nghiệm tiếp theo tương ứng với Xi= -0,2 và X2= + 0,23.
Nhiệt độ và thời gian trích ly tối ưu được tính theo công thức 3.2 (mục 3.25)
_{X j -X ũ j ) _ 2{XrX])
( X — X ì