3.1.1 Địa điểm, thời gian
Thí nghiệm được tiến hành bố trí, theo dõi và xử lý số liệu tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ.
Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 08/08/2014 đến tháng 30/11/2014.
3.1.2 Dụng cụ và thiết bị
- Micropipet 1.000 L, Đức - Pipet 10 mL, 20 mL, Đài Loan
- Máy khuấy từ Toshiba, model Magnestir MG-10, Nhật - Máy khuấy từ nhiệt, model AHYQ 78-1, Trung Quốc
- Máy đo pH 2 số lẻ, model HANA pH 212, độ chính xác 0,01, Ý - Cân điện tử Vibra, model DJ-1000TW, độ chính xác 0,01 g, Nhật - Máy xay thịt Gali, model KD-N19, công suất 1.000 W, Trung Quốc - Nhiệt kế Hanna, model M-7860, -10÷150oC, độ chính xác 0,1oC,
Mauritius
- Tủ đông Acson International, model Acson R134a (Nhật), nhiệt độ tối đa của tủ là -25oC.
- Tủ đông Toshiba, model GR-45G-XS (Nhật), nhiệt độ ngăn đông - 40÷-50C
Một số dụng cụ khác có liên quan.
3.1.3 Hóa chất dùng trong thí nghiệm
- Acetic acid (CH3COOH), độ tinh khiết ≥ 99,5%, Trung Quốc - Acetone (CH3COCH3), độ tinh khiết 99,7%, Việt Nam
- Citric acid monohydrate (C6H8O7.H2O), độ tinh khiết ≥99,5%, Trung Quốc
- Dầu olive, độ tinh khiết 100%, Ý
- Disodium hydrogren phosphate dodecahydrate (Na2HPO4.12H2O), độ tinh khiết 99,0%, Trung Quốc
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ
- HCl đậm đặc, độ hoà tan 37%, Việt Nam
- Potassium dihydrogren phosphate (KH2PO4), độ tinh khiết 99,0%, Trung Quốc
- Sodium acetate anhydrous (CH3COONa), độ tinh khiết ≥99,0%, Trung Quốc
- Sodium hydroxide (NaOH) chuẩn 0,05 N, Việt Nam
- Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride, độ tinh khiết
99,0%, Đức
- Trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7.2H2O), độ tinh khiết ≥99,0%, Trung Quốc.
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1Phương pháp thu mẫu và chuẩn bị mẫu
Nội tạng cá lóc được thu mẫu trực tiếp tại các điểm mua bán cá lóc ở các chợ trên địa bàn quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ (4 chợ: chợ Xuân Khánh, chợ Cái Khế, chợ Trần Việt Châu và chợ An Bình, thu mẫu ở 4÷6 điểm bán cá/chợ). Thời gian thu mẫu vào buổi sáng sớm (từ 6 giờ đến 7 giờ 30 phút). Khối lượng mẫu được trung bình thu được trong một ngày khoảng 0,9 đến 1,1 kg.
Toàn bộ phần nội tạng sau khi được lấy ra khỏi thân thịt cá sẽ được chuyển trực tiếp sang dụng cụ chứa – bao bì PE đặt trong thùng xốp hay thùng cách nhiệt có chứa nước đá, nhiệt độ 0÷5oC. Nguyên liệu sau đó được chuyển đến phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Cần Thơ.
A: Trước xử lý B: Sau xử lý
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ
Ở phòng thí nghiệm, nguyên liệu được qua các bước xử lý sơ bộ loại bỏ mang, mỡ, bụi bẩn,... (Hình 3.1). Nội tạng cá lóc thu được ở tất cả các nơi được trộn lẫn để đảm bảo tính đồng nhất. Cân, phân chia khối lượng mỗi mẫu là 200 g. Tiến hành lạnh đông nhanh nguyên liệu ở hệ thống tủ cấp đông có nhiệt độ -40C đến khi nhiệt độ tâm sản phẩm đạt -18oC (thời gian cấp đông trung bình là 50÷55 phút). Mẫu sau cấp đông được đưa vào tủ trữ đông có nhiệt độ -18oC. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trước khi tiến hành thí nghiệm, mẫu nội tạng lạnh đông được nghiền, xay để phá vỡ cấu trúc, cân định lượng khối lượng mỗi mẫu theo từng nghiệm thức khảo sát.
3.2.2Phương pháp phân tích và đo đạc kết quả
Bảng 3.1: Phương pháp phân tích và đo đạc kết quả
Chỉ tiêu Phương pháp xác định
Độ ẩm (%) Sấy khô ở nhiệt độ 105C đến khối lượng không đổi, phương pháp NMKL số 23–1991 (phụ lục 1)
pH Sử dụng pH kế, theo ISO 2917:1999 (phụ lục 1)
Hoạt tính lipase (U/g) Theo phương pháp pH–stat (Tembhurkar et al., 2012 và Tambekar et al., 2013; phụ lục 1)
Đạm tổng số, % Xác định bằng phương pháp Kjedahl, Tiêu chuẩn Việt Nam 4328-1:2007 (phụ lục 1)
Lipid tổng số, % Xác định bằng phương pháp Soxhlet, Tiêu chuẩn Việt Nam 4331:2001 (phụ lục 1)
3.2.3Phương pháp xử lý số liệu
Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Kết quả các thí nghiệm trước được sử dụng làm thông số cố định cho các thí nghiệm kế tiếp.
Số liệu được thu thập và xử lý bằng phần mềm thống kê Statgraphics Centrution 15.2, Copyright (C) PP, USA và phần mềm Excel. Phân tích phương sai (ANOVA) và kiểm định LSD để kết luận về sự sai khác giữa trung bình các nghiệm thức.
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ
3.3 Nội dung nghiên cứu
3.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Thí nghiệm được tiến hành dựa trên kết quả nghiên cứu trước của Tran et
al. (2014), sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát được trình bày ở Hình 3.2.
Hình 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
3.3.2 Phân tích thành phần cơ bản của nguyên liệu
Mục đích: Tiến hành phân tích một số chỉ tiêu về thành phần cơ bản
của nguyên liệu làm cơ sở cho các thí nghiệm tiếp theo.
Tiến hành thí nghiệm: Nội tạng cá lóc sau khi thu mua được xử lý và
tiến hành phân tích các thành phần cơ bản có trong nguyên liệu ban đầu như độ ẩm, pH, hàm lượng đạm tổng số, hàm lượng lipid tổng số. Quá trình xử lý và phân tích phải tiến hành thật nhanh để tránh xảy ra những biến đổi không
Nội tạng cá lóc (bỏ mang, mỡ)
Rửa sạch, để ráo, cân Cấp đông
(Nhiệt độ thiết bị -40C, Tsp = -18C)
Trữ đông ở -18±2C
Xay, nghiền
Trích ly enzyme
(Tỷ lệ nguyên liệu : dung môi = 1: 4, w/w) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
TN 2: Loại dung môi (pH 6) TN 1: Ảnh hưởng của thời gian
trữ đông đến hoạt tính lipase
TN 3: Ảnh hưởng tương tác của nhiệt độ và thời gian trích ly
Phân tích thành phần nguyên liệu Tự phân (Tốc độ khuấy đảo 200 rpm) Lọc Dịch trích enzyme thô Xác định hoạt tính lipase Ly tâm (6000 rpm, 20 phút, 4C)
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ
mong muốn, ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Thí nghiệm tiến hành phân tích 3 lần lặp lại ở mỗi chỉ tiêu khảo sát cho mỗi đợt lấy mẫu.
Chỉ tiêu đánh giá: Độ ẩm (%), giá trị pH, hàm lượng đạm tổng số (%),
hàm lượng lipid tổng số (%).
Kết quả thu nhận: Xác định được một số thành phần cơ bản trong
nguyên liệu nội tạng cá lóc làm cơ sở cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.3.3Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian trữ đông đến hoạt tính enzyme lipase trích ly từ nội tạng cá lóc hoạt tính enzyme lipase trích ly từ nội tạng cá lóc
Mục đích: Đánh giá sự ổn định của hoạt tính enzyme lipase có trong
nội tạng cá lóc theo thời gian trữ đông ở nhiệt độ -18oC (± 2oC).
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí với một nhân tố và 3 lần lặp
lại.
Nhân tố A: Thời gian trữ đông (tuần).
A0: 0 tuần A1: 1 tuần A2:2 tuần
A3: 3 tuần A4: 4 tuần A5: 5 tuần
A6: 6 tuần A7: 7 tuần A8: 8 tuần
Tổng số nghiệm thức: 9
Số mẫu thí nghiệm: 9 x 3 = 27 mẫu
Khối lượng mẫu thí nghiệm: 0,05 kg/mẫu x 27 = 1,35 kg
Tiến hành thí nghiệm: Nội tạng cá lóc đã được xử lý, cấp đông và trữ
đông theo phương pháp thu và chuẩn bị mẫu được trình bày ở mục 2.3.1. Ứng với từng thời gian trữ đông theo khảo sát, mẫu được xay mịn và tiến hành trích ly theo sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát ở Hình 3.2 và Hình 3.3. Quá trình trích ly sử dụng dung môi là nước cất được điều chỉnh đến pH 6,0 bằng HCl 0,1 M, tỉ lệ giữa nguyên liệu và dung môi là 1:4, ở nhiệt độ 45oC, thời gian trích ly là 180 phút (Tran et al., 2014). Lọc dịch trích bằng vải lọc nhiều lớp
thu dịch lọc, ly tâm ở nhiệt độ 4oC , tốc độ 6000 rpm trong thời gian 20 phút. Phần dịch trong được xem như dịch trích enzyme thô, sử dụng để xác định hoạt tính enzyme lipase.
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hình 3.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1
Chỉ tiêu theo dõi: Hoạt tính enzyme lipase (U/g nội tạng cá lóc,
CKNL). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả thu nhận: Thời gian trữ đông thích hợp (tuần) để thu được
enzyme lipase có hoạt tính ổn định.
3.3.4Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của dung dịch đệm đến hoạt tính enzyme lipase trích ly từ nội tạng cá lóc tính enzyme lipase trích ly từ nội tạng cá lóc
Mục đích: Xác định dung dịch đệm có pH 6,0 thích hợp trong quá trình
trích ly để thu được enzyme lipase từ nội tạng cá lóc có hoạt tính cao nhất.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí với một nhân tố và 3 lần lặp
lại.
Nhân tố B: Các loại dung dịch đệm có pH 6,0
B0 : Nước cất B1: Đệm phosphate
B2 : Đệm acetate B3: Đệm citrate
Tổng số nghiệm thức: 4
Số mẫu thí nghiệm: 4 x 3 = 12 mẫu
Khối lượng mẫu thí nghiệm: 0,05 kg/mẫu x 12 = 0,6 kg
Nguyên liệu Trữ đông
Trích ly
Xác định hoạt tính enzyme lipase Lọc, ly tâm
A3 A4 A5
A1 A7
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hình 3.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2
Tiến hành thí nghiệm: Nội tạng cá lóc sau xử lý được trích ly bằng
những loại dung dịch đệm khác nhau có khoảng pH 6, tỉ lệ trích ly nguyên liệu và dung môi là 1:4, w/w. Tiến hành trích ly ở nhiệt độ và thời gian cố định được bố trí như thí nghiệm 1. Dịch lọc sau khi lọc bằng vải lọc nhiều lớp được ly tâm ở nhiệt độ 4oC, tốc độ 6000 rpm trong thời gian 20 phút. Dịch trích enzyme thô sau ly tâm được xác định thể tích và xác định hoạt tính enzyme lipase.
Chỉ tiêu theo dõi: Hoạt tính enzyme lipase (U/g nội tạng cá lóc,
CKNL).
Kết quả thu nhận: Loại dung dịch đệm thích hợp để thu được enzyme
lipase có hoạt tính cao nhất.
3.3.5Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng tương tác của nhiệt độ và thời gian trích ly đến hoạt tính của enzyme lipase thu nhận từ nội tạng cá thời gian trích ly đến hoạt tính của enzyme lipase thu nhận từ nội tạng cá lóc
Mục đích: Xác định được điều kiện nhiệt độ và thời gian tối ưu cho quá
trình trích ly lipase từ nội tạng cá lóc có hoạt tính cao nhất. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bố trí thí nghiệm:
Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian trích ly đến hoạt tính lipase thu nhận được tiến hành theo phương pháp quy hoạch hóa thực nghiệm sử dụng trực giao đối xứng, mỗi yếu tố tiến hành tại 3 mức (-1, 0, +1) và các bước nhảy -1,4 và +1,4 theo Bảng 3.2. Quy hoạch thực nghiệm đưa ra bảng
Nguyên liệu Trích ly
B0 B1 B2 B3
Lọc, ly tâm
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ
ma trận thực nghiệm gồm 33 thí nghiệm với 11 thí nghiệm cho 1 lần khảo sát (lặp lại 3 lần), trong đó có 4 thí nghiệm tại tâm (quy hoạch toàn phần 22), 4 thí nghiệm tại điểm sao (2 thí nghiệm cho mỗi biến) và 3 thí nghiệm lặp tại tâm để kiểm tra ý nghĩa các hệ số của phương trình hồi quy (Bảng 3.3).
Hàm mục tiêu (Y) là hoạt tính lipase (U/g, CKNL)
Bảng 3.2: Giá trị mã hóa và giá trị thực nghiệm của các yếu tố thực nghiệm Biến số Ký hiệu Đơn vị Ký hiệu giá trị mã hóa
-α (-1,4) -1 0 +1 -α (+1,4)
Nhiệt độ X1 C 26 30 40 50 54
Thời gian X2 phút 10 60 180 300 350
Khối lượng mẫu sử dụng: 11 x 3 x 0,05 kg/mẫu = 1,65 kg.
Tiến hành thí nghiệm: Thí nghiệm được thực hiện dựa trên quy trình trích
ly ở mục 3.3.1, sử dụng dung dịch đệm thích hợp được lựa chọn từ thí nghiệm 2. Mẫu sau khi nghiền được ủ theo 11 đvtn, lặp lại 3 lần (Bảng 3.3). Tương ứng với từng điều kiện khảo sát, lọc và ly tâm, thu dịch chiết enzyme.
Bảng 3.3: Ma trận quy hoạch thực nghiệm quá trình trích ly lipase từ nội tạng cá lóc TT
mẫu
Giá trị mã hóa Giá trị thực nghiệm
X1 X2 Nhiệt độ trích ly, C Thời gian trích ly, phút
1 -1,4 0 26 180 2 -1 -1 30 60 3 -1 +1 30 300 4 0 -1,4 40 10 5 0 0 40 180 6 0 0 40 180 7 0 +1,4 40 350 8 +1 -1 50 60 9 +1 +1 50 300 10 +1,4 0 54 180 11 0 0 40 180
Dựa trên hoạt tính trung bình của lipase thu được tương ứng với 33 đơn vị thí nghiệm, sử dụng chương trình Statgraphics Centrution 15.2 để giải bài toán quy hoạch thực nghiệm và tính các hệ số phương trình hồi quy, trong đó hàm mục tiêu Y: Tổng hoạt tính lipase có trong dịch chiết enzyme (U/g chất khô nội tạng); X1: Nhiệt độ trích ly (C) và X2: thời gian trích ly (phút).
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ
Ý nghĩa của các hệ số được kiểm tra theo tiêu chuẩn Student với p = 0,05, số bậc tự do f = 3-1= 2. Kiểm tra sự tương thích phương trình hồi qui với thực nghiệm theo tiêu chuẩn Fisher, đảm bảo F < F0,95 (9-2, 3-1).
Vẽ đồ thị bề mặt đáp ứng và xác định điều kiện nhiệt độ và thời gian trích ly tối ưu.
Chỉ tiêu theo dõi: Hoạt tính enzyme lipase trong dịch chiết tương ứng
với 11 đvtn (U/g nội tạng cá lóc, CKNL).
Kết quả thu nhận: Nhiệt độ và thời gian trích ly tối ưu để thu được
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1Thành phần hóa lý cơ bản của nội tạng cá lóc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hoạt tính lipase trong nguyên liệu thu nhận phụ thuộc rất lớn vào thành phần cơ chất, đặc biệt là thành phần chất béo và acid béo hiện diện, đồng thời cũng chịu sự chi phối bởi độ ẩm nguyên liệu (Kutrovic, 2011). Chính vì vậy, các thành phần hóa lý cơ bản của nội tạng cá lóc như độ ẩm, hàm lượng lipid tổng số và cả hàm lượng protein tổng số cũng như pH ban đầu của nguyên liệu đều được xác định, làm cơ sở cho việc nghiên cứu thu nhận lipase từ nội tạng cá lóc. Kết quả phân tích được trình bày ở Bảng 4.1.
Bảng 4.1: Thành phần hóa lý cơ bản của nội tạng cá lóc
Chỉ tiêu khảo sát Giá trị*
pH 6,580,22
Độ ẩm (%) 68,270,91
Đạm tổng số (%) – căn bản ướt 9,650,24
– căn bản khô 30,410,75 Lipid tổng số (%) – căn bản ướt 20,820,69
– căn bản khô 65,621,18
*Giá trị trung bình của 4 đợt lấy mẫu
Từ kết quả phân tích cho thấy, mức dao động về các tính chất hóa lý khảo sát của nội tạng cá lóc ở 4 đợt lấy mẫu không nhiều. Điều này cho thấy, nguồn nguyên liệu cá lóc nuôi với chế độ cho ăn hầu như giống nhau đã góp phần làm cho chất lượng cá, kéo theo chất lượng nội tạng cá ổn định. Hơn thế nữa, các điểm bán cá ở khu vực quận Ninh Kiều hầu hết đều được cung cấp cá ở cùng một đầu mối hay cùng vùng nguyên liệu.
Giá trị pH của nội tạng cá lóc là 6,580,22 chứng tỏ nguyên liệu thu hoạch vẫn còn độ tươi (Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phương, 1989). Tuy nhiên, với giá trị pH vào khoảng trung tính, là điều kiện thích hợp cho vi sinh vật hoạt động, gây hư hỏng nguyên liệu. Hơn thế nữa, nguyên liệu còn có độ ẩm tương đối cao (68,270,91%) cùng với hàm lượng protein trong nguyên liệu cũng ở mức 30,410,75% (CKNL). Hàm lượng ẩm cùng với protein cao tạo điều kiện cho vi sinh vật gây hư hỏng phát triển, đồng thời là môi trường thuận lợi cho enzyme hoạt động. Kết quả phân tích hàm lượng lipid tổng số trong nội tạng cá lóc cho giá trị đến 65,621,18% (CKNL) - là cơ chất thích hợp cho các phản ứng thủy phân chất béo và là nguyên nhân của nhiều phản ứng oxy hóa chất béo khi có sự hiện diện của oxy, tạo các gốc tự do làm giảm hoạt tính enzyme lipase có trong nguyên liệu (Lê Ngọc Tú và ctv, 2004). Do đó, nguyên liệu nội tạng cá lóc sau khi thu mua và xử lý cần phải được trữ đông để đảm bảo hoạt tính được ổn định trong quá trình trích ly.