Ứng dụng sóng siêu âm để trích ly enzyme bromelain từ chồi dứa

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA PHẠM THỊ HỒNG OANH ỨNG DỤNG SĨNG SIÊU ÂM ĐỂ TRÍCH LY ENZYME BROMELAIN TỪ CHỒI DỨA Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm đồ uống LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng năm CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM Cán hướng dẫn khoa học : PGS TS Lê Văn Việt Mẫn Cán chấm nhận xét : PGS TS Nguyễn Thúy Hương Cán chấm nhận xét : TS Hoàng Kim Anh Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 14 tháng 08 năm 2011 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: PGS TS Nguyễn Thúy Hương PGS TS Lê Văn Việt Mẫn TS Hoàng Kim Anh TS Phan Ngọc Hịa TS Ngơ Đại Nghiệp Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA………… ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: PHẠM THỊ HOÀNG OANH .MSHV: 09110167 Ngày, tháng, năm sinh: 05/05/1985 Nơi sinh: Đồng Nai Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm đồ uống Mã số: I TÊN ĐỀ TÀI: ”ỨNG DỤNG SĨNG SIÊU ÂM ĐỂ TRÍCH LY ENZYME BROMELAIN TỪ CHỒI DỨA“ II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: 1) Xác định thời gian xay để trích ly bromelain 2) khảo sát ảnh hưởng công suất, pH, nhiệt độ thời gian siêu âm để trích ly bromelain 3) tối ưu hóa hai thơng số cơng nghệ q trình xử lý siêu âm để trích ly bromelain III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 02/2011 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 07/2011 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS TS Lê Văn Việt Mẫn Tp HCM, ngày tháng năm 20 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Họ tên chữ ký) CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên chữ ký) TRƯỞNG KHOA….……… (Họ tên chữ ký) LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin cảm ơn đến Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Kỹ thuật hóa học, Trường Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh tạo mơi trường học tập nghiên cứu khoa học thời gian theo học trường Tôi xin gởi lời biết ơn chân thành đến q thầy Bộ mơn cơng nghệ thực phẩm truyền đạt kiến thức quí báu thời gian qua Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến thầy Lê Văn Việt Mẫn hướng dẫn tận tình, giúp tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp Tôi xin gởi lời cảm ơn đến ba mẹ anh chị giúp đỡ thời gian làm luận văn Phạm Thị Hoàng Oanh TĨM TẮT LUẬN VĂN Ứng dụng sóng siêu âm q trình trích ly nâng cao hiệu suất thu nhận enzyme bromelain từ chồi dứa Các thông số kỹ thuật trình xử lý siêu âm sau: công suất siêu âm: 5.6 W/g nguyên liệu, nhiệt độ: 300C, pH: 6.5, thời gian siêu âm: 56 giây Trong điều kiện trên, hiệu suất thu nhận bromelain từ chồi dứa tăng 10.5% so với mẫu đối chứng không qua xử lý siêu âm ABSTRACT Application of ultrasound to bromelain extraction from pineapple improved significantly the extraction yield The sonication conditions were as follows: ultrasonic power of 5.6 W/g material, temperature of 300C, pH of 6.5, sonication time of 56 second Under these conditions, the extraction yield in bromelain activity increased 10.5% in comparison with that in the control sample PHẦN LÝ LỊCH TRÍCH NGANG Họ tên: PHẠM THỊ HOÀNG OANH Ngày, tháng, năm sinh: 05/05/1985 Nơi sinh: Đồng Nai Địa liên lạc: QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO 2003-2008: Sinh viên, Trường ĐH Tôn Đức Thắng Tp HCM, ngành Cơng nghệ hóa học 2009-2011: Học viên cao học, Trường ĐH Bách Khoa Tp HCM, ngành Công nghệ thực phẩm đồ uống Q TRÌNH CƠNG TÁC 2008-2011: Công tác Công ty TNHH TM-SX Việt Thọ, KCN Sông Mây, Trảng Bom, Đồng Nai i MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC BẢNG iii DANH MỤC CÁC HÌNH iv DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC vi MỤC LỤC Mở đầu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Enzyme bromelain 1.1.1 Một số tính chất enzyme bromelain 1.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình trích ly bromelain 1.1.3 Ứng dụng enzyme bromelain công nghiệp thực phẩm 1.2 Sóng siêu âm ứng dụng q trình trích ly 1.2.1 Khái niệm 1.2.2 Cơ chế tác dụng sóng siêu âm q trình trích ly 1.2.3 Ứng dụng sóng siêu âm q trình trích ly 1.2.4 Ảnh hưởng sóng siêu âm đến hoạt tính enzyme 1.2.4.1.Ảnh hưởng công suất siêu âm 10 1.2.4.2.Ảnh hưởng nhiệt độ siêu âm 10 1.2.4.3.Ảnh hưởng thời gian siêu âm 11 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 13 2.1 Nguyên liệu 13 2.2 Nội dung nghiên cứu 14 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 14 2.2.2 Cách thực thí nghiệm 14 2.2.2.1.Ảnh hưởng kích thước nguyên liệu 14 2.2.2.2.Ảnh hưởng công suất siêu âm 15 2.2.2.3.Ảnh hưởng pH 16 2.2.2.4.Ảnh hưởng nhiệt độ 16 ii 2.2.2.5.Ảnh hưởng thời gian xử lý 17 2.2.2.6 Tối ưu hóa hai thơng số cơng nghệ q trình xử lý siêu âm để trích ly bromelain 17 2.2.2.7 Xác định trọng lượng phân tử hoạt tính bromelain từ qui trình trích ly có xử lý siêu âm 18 2.3 Phương pháp phân tích 18 2.3.1 Phương pháp xác định hàm lượng protein hòa tan theo Lowry 18 2.3.2 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme bromelain 18 2.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính riêng 18 2.3.4 Phương pháp xác định trọng lượng phân tử protein 19 2.4 Phương pháp xử lý số liệu 19 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1 Khảo sát ảnh hưởng kích thước nguyên liệu 20 3.2 Khảo sát ảnh hưởng công suất siêu âm 21 3.3 Khảo sát ảnh hưởng pH 23 3.4 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ 26 3.5 Khảo sát ảnh hưởng thời gian siêu âm 28 3.6 Tối ưu hóa công suất thời gian siêu âm 31 3.7 Xác định trọng lượng phân tử hoạt tính bromelain từ qui trình trích ly có xử lý siêu âm 33 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 4.1 Kết luận 36 4.2 Kiến nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1 Đặc điểm cysteine protease dứa Bảng 1.2 Giới thiệu số ứng dụng enzyme bromelain công nghiệp thực phẩm Bảng 1.Các biến độc lập mức độ dao động chúng thiết kế bề mặt đáp ứng 31 Bảng Bảng thí nghiệm qui hoạch thực nghiệm tối ưu hóa q trình xử lý siêu âm để trích ly enzyme bromelain kết thực nghiệm .32 Bảng 3 Kết kiểm tra hàm mục tiêu điều kiện tối ưu .34 iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1 Các vùng tần số sóng siêu âm lĩnh vực ứng dụng Hình Tác động sóng siêu âm lên bề mặt tế bào thực vật Hình Sự nổ vỡ bong bóng khí giải phóng hợp chất q trình trích ly tinh dầu từ húng quế Hình Ảnh chụp TEM cellulose từ thực vật sau xử lý siêu âm .8 Hình Trọng lượng phân tử trung bình cellulose từ bơng vải thay đổi theo thời gian xử lý siêu âm Hình Quy trình thu nhận enzyme bromelain thơ từ chồi dứa 13 Hình 2 Sơ đồ nghiên cứu 14 Hình Ảnh hưởng kích thước nguyên liệu (thời gian xay thay đổi) đến hoạt tính bromelain dịch trích từ chồi dứa 20 Hình Ảnh hưởng cơng suất siêu âm đến hoạt tính tổng bromelain dịch trích từ chồi dứa 21 Hình 3 Ảnh hưởng công suất siêu âm đến hàm lượng protein dịch trích 22 Hình Ảnh hưởng cơng suất siêu âm đến hoạt tính riêng bromelain 23 Hình Ảnh hưởng pH đến hoạt tính tổng bromelain dịch trích 24 Hình 6.Ảnh hưởng pH đến hàm lượng protein dịch trích 25 Hình Ảnh hưởng pH đến hoạt tính riêng bromelain 25 Hình Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính tổng bromelain dịch trích 26 Hình Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng protein dịch trích 27 Hình 10 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính riêng bromelain 28 Hình 11 Ảnh hưởng thời gian xử lý siêu âm đến hoạt tính tổng bromelain dịch trích 29 Hình 12 Ảnh hưởng thời gian xử lý siêu âm đến hàm lượng protein dịch trích 30 33 Ở điều kiện tối ưu này, hoạt tính tổng bromelain cao dự đốn theo phương trình hồi qui 62.9 đvht/g nguyên liệu Kết qui hoạch thực nghiệm cho thấy ảnh hưởng định lượng công suất thời gian xử lý siêu âm đến hoạt tính enzyme bromelain Hoạt tính bromelain đạt cao công suất 5.6 W/g nguyên liệu thời gian xử lý siêu âm 56 giây Hình 14 Đồ thị bề mặt đáp ứng trình tối ưu hóa cơng suất thời gian siêu âm sau xử lý siêu âm 3.7 Xác định trọng lượng phân tử hoạt tính bromelain từ qui trình trích ly có xử lý siêu âm Để kiểm chứng tính xác giá trị thu từ phương trình hồi qui, chúng tơi tiến hành thí nghiệm lặp lại độc lập dựa giá trị công suất thời gian siêu âm tối ưu nêu trên, giá trị pH nhiệt độ trình xử lý siêu âm 6.5 300C Chúng thực mẫu đối chứng không qua xử lý siêu âm Các giá trị trình bày bảng 3.3: 34 Bảng 3 Kết kiểm tra hàm mục tiêu điều kiện tối ưu Mẫu đối chứng Mẫu xử lý siêu âm điều kiện tối ưu Hoạt tính tổng Hàm lượng protein Hoạt tính riêng (đvht/g nguyên liệu) (mg/g nguyên liệu) (đvht/mg protein) 55.27 ± 0.12 1.93 ± 0.01 28.59 ± 0.08 61.76 ± 0.05 1.98 ± 0.10 31.14 ± 0.10 Như vậy, kết thực nghiệm trình xử lý siêu âm để thu nhận bromelain 61.76 đvht/g nguyên liệu khơng chênh lệch nhiều so với giá trị dự đốn phương trình hồi qui (62.9 đvht/g nguyên liệu) Nếu so với mẫu đối chứng, trình xử lý siêu âm điều kiện tối ưu làm tăng hoạt tính tổng dịch trích lên 10.5% so với mẫu đối chứng khơng có qua xử lý siêu âm Sau tiến hành kiểm tra hoạt tính, chúng tơi kiểm tra mức độ tinh dịch trích cách chạy điện di SDS-page Kết hình 3.15 cho thấy, gel thu vạch bromelain riêng biệt tương đương với vạch chuẩn chế phẩm bromelain hãng Sigma Chemical Điều đáng lưu ý dịch trích thơ gần chứa protein enzyme bromelain, thành phần protein tạp dịch trích Việc xử lý siêu âm không làm xuất thêm thành phần protein tạp dịch trích Theo kết hình 3.15, chúng tơi kết luận phân tử lượng enzyme bromelain chồi dứa Queen sử dụng nghiên cứu 27.2 kDa 35 Hình 15 Kết chạy điện di SDS-page Trong đó: MT: Mẫu khơng qua xử lý siêu âm SA: Mẫu có qua xử lý siêu âm TC: Thang protein chuẩn BC: Bromelain chuẩn 36 CHƯƠNG 4.1 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Dựa kết thu được, rút số kết luận sau: ¾ Điều kiện xử lý siêu âm để trích ly bromelain từ chồi dứa là: + Công suất siêu âm: 5.6 W/g nguyên liệu, + Thời gian siêu âm: 56 giây, + pH: 6.5, + Nhiệt độ: 300C Với điều kiện trên, hoạt tính chế phẩm bromelain thô thu tăng 10.5% so với mẫu đối chứng khơng có xử lý siêu âm 4.2 Kiến nghị Thử nghiệm sản xuất bromelain qui mô pilot có sử dụng kỹ thuật siêu âm nhằm tăng hiệu trích ly enzyme Ứng dụng sóng siêu âm để trích ly loại enzyme khác có nguồn gốc từ thực vật, vi sinh vật 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Chemat, F., Zill-E-Huma, Khan M K., 2011 Applications of ultrasound in food technology: Processing, preservation and extraction Ultrasonics sonochemistry, 18, 813-835 Cheng, L H., Soh, C Y., Liew, S C., & Teh, F F., 2007 Effects of sonication and carbonation on guava juice quality Food Chemistry, 104, 1396-1401 Chobotova, K., Vernallis, A B., Adibah, F., and Majid, A., 2010 Bromelain’ activity and potential as anti-cancer agent: current avidence and perspective, Cancer letters, 290, 148-156 Corzo, C A., Waliszewski, K N., Welti, J., 2011 Pineaple fruit bromelain affinity to different protein subtrates Food chemistry Ercan, S S., Soysal, C., 2011 Effect of ultrasound and temperature on tomato peroxidase Ultrasonics sonochemistry, 18, 689-695 Feijoo-Siota, L., Villa, T.G., 2010 Native and biotechnologically engineered plant proteases with industrial applications Food Bioprocess Technol, 10, 431-434 Fileti, A M F., Fischer, G A., Santana, J C C., and Tambourgi, E B., 2009 Batch and continuous extraction of bromelain enzyme by resersed micelles Brazilian archives of Biology and Technology, 52, 1225-1234 Filgueiras, A V., Capelo, J L., Lavilla, I., & Bendicho, C., 2000 Comparison of ultrasound-assisted extraction and microwave-assisted digestion for determine of magnesium, manganse and zinc in plant samples by flame atomic absorption spectrometry Talanta, 53, 433-441 Gautam, S S., Mishra, S.K., Dash, V., Goyal, A K., and Rath, G., 2010 Comparative study of extraction, purification and estimation of bromelain from stem and fruit of pineaple plant Thai J Pharm Sci., 34, 67-76 10 Grzonka, Z., Kasprzykowski, F., and Wiczk, W., 2007 Cysteine protease, J Polaina and A.P Maccable (eds.), Industrial enzymes, 181-195 38 11 Hebbar, H U., Sumana, B., Raghavarao, K S M S., 2008 Use of reverse micellar systems for the extraction and purification of bromelain from pineapple wastes Bioresource Technology, 99, 4896-4902 12 Huang, H., Kwok, K C., & Liang, H H., 2007 Inhibitory activity and conformation changes of soybean trypsin inhibitors induced by ultrasound Ultrasonics Sonochemistry, 15,724–730 13 Jutamongkon, R., Charoenrein, S., 2010 Effect of temperature on the stability of fruit bromelain from smooth cayenne pineaple Kasetsart J (Nat Sci.), 44, 934-948 14 Ketnawa, S., Sai-Ut, S., Theppakorn, T., Chaiwut, P., and Rawdkuen, S., 2009 Partitioning of bromelain from pineapple peel (Nang Lae cultv.) by aqueous two phase system Asian journal of food and agro-industry, 2(04), 457-468 15 Ketnawa, S., Rawdkuen, S., Chawut, P., 2010 Two phase partitioning and collagen hydrolysis of bromelain from pineaple peel Nang Lae cultivar Biochemical Engineering Journal, 52, 205-211 16 Kuldiloke Jarupan, 2002 Effect of ultrasound, temperature and pressure treatment on enzyme activity and quality indicators of fruit and vegetable juices University of Berlin 17 Kuldiloke J., Eshtiaghi M N., Zenker M., Knorr D., 2007, Inactivation of lemon pectinesterase by thermosonication International Journal Of Food Engineering, 03 18 Li, D., Mu, C., Cai, S., Lin, W., 2009 Ultrasonic irradiation in the enzymatic extraction of collagen Ultrasonic sonochemistry, 16, 605-609 19 Ma, H., Huang, L., Jia, J., He, R., Luo, L., Zhu, W., 2011 Effect of energygathered ultrasound on alcalase, Ultrasonics sonochemistry, 18, 419-424 20 Mason, T J., Paniwnyk, L., Lorimer, J.P , 1996 The uses of ultrasound in food technology Ultrasonics sonochemistry, 03, 253 – 260 39 21 Maurer, H R , 2001 Bromelain: Biochemistry, pharmacology and medical use CMLS, cell Mol Life Sci., 58, 1234-1245 22 Mehrlich, F P., Eds-peterson, M S., and johnson, A H., 1978 “Bromelain” in encyclopedia of food science The Avi publishing company Inc, Westport connecticut, 94-97 23 Nabarlatz, D., vondrysova, J., Jenicek, P., Stiiber, F., Font, J., Fortuny, A., Fabregat, A., Bengoa, C., 2010 Hydrolytic enzymes in activated sludge: Extraction of protease and lipase by stirring and ultrasonication Ultrasonics sonochemistry, 17, 923-931 24 O’Donnell, C P., Tiwari, B K., Bourke, P and Cullen, P J., 2010 Effect of ultrasonic processing on food enzyme of industrial importance, Trends in food science & technology, 21, 358-367 25 Özbek, B., Ülgen, Ö K., 2000 The stability of enzyme after sonication Process biochemistry, 35, 1037-1043 26 Polaina, J., Maccabe, A P., 2007 Industrial Enzymes: Structure, Function and Applications Springer-Verlag 27 Riera, E., Golás, Y., Blanco, A., Gallego, A., Blasco, M., & Mulet, A., 2004 Mass transfer enhancement in supercritical fluids extraction by means of power ultrasound Ultrasonics Sonochemistry, 11, 241−244 28 Shah, S., Sharma, A., & Gupta, M N., 2008 Extraction of oil from Jatropha curcas L seed kernels by combination of ultrasound and aqueous enzymatic oil extraction Bioresource Technology, 96, 121-123 29 Shi, W., Wei, M., Jin, L., Li, C., 2007 Calcined layered double hydroxides as a “biomolecular vessel” for bromelain: Immobilization, storage and release, Journal of molecular catalysis B: enzymatic, 47, 58-65 30 Sun, X.-F., Fowler, P., Rajaratnam, M and Zhang, G., 2010 Extraction and characterisation of hemicelluloses from maize stem Phytochemical Analysis, 21, 406–415 40 31 Villamiel, M., & de Jong, P., 2000 Influence of high-intensity ultrasound and heat treatment in continous flow on fat, proteins and native enzymes of milk Journal of Agriculture and Food Chemistry, 48, 472-478 32 Wang, L J., and Weller, C L, 2006 chapter 2: Advances in Extraction of Plant Products in Nutraceutical Processing, Handbook of Nutraceuticals Volume II, CRC Press , 15–52 33 Wang, J., Cao, Y., Sun, B., Wang, C., Mo, Y., 2011 Effect of ultrasound on the activity of alliinase from fresh garlic Ultrasonic sonochemistry, 18, 534540 34 Wong S-S., Kasapis, S., Tan, Y M., 2009 Bacterial and plant cellulose modification using ultrasound irradiation Carbohudrate polymers, 77, 280287 35 Yaldagard, M., Mortazavi, S A., Tabatabaie, F., 2007 The effects of ultrasound on the activity of alpha- amylase during barley germination Asean food conference, 07, 21-23 36 Zhao, Y., Bao, C., and Mason, T J., 1991 Ultrasonics Int ’91 conf Proc 41 PHỤ LỤC PL Cách pha đệm phosphate (theo dược điển Mỹ_ USP30-NF25) Cho 50ml dung dịch monobasic potassium phosphate (0,2M) vào bình định mức 200ml, thêm vào thể tích dung dịch sodium hydroxide (0,2M), sau thêm nước vào đến vạch định mức Điều chỉnh pH NaOH 0,2M pH 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 0,2M NaOH, ml 3.4 5,6 17.4 29,1 37.6 46,1 PL Các bước tiến hành phương pháp xác định hàm lượng protein hòa tan theo Lowry (Tài liệu hướng dẫn thực tập công nghệ enzyme protein, dùng cho học viên cao học- Viện khoa học công nghệ việt nam- Viện sinh học nhiệt đới, 2010) − Dựng đường chuẩn Albumin Pha dung dịch Albumin để đạt nồng độ: 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 µg/ml theo bảng sau: ống nghiệm số Hàm lượng protein 100 200 300 400 500 600 700 (µg/ml) Dung dịch Albumin Nước cất 10 Hút 0,5 ml dung dịch albumin 0,1% có nồng độ theo thứ tự 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 µg/ml cho vào ống nghiệm sấy khô (có đánh số) Thêm vào ml dung dịch C Lắc để yên nhiệt độ phòng 10 phút, sau thêm vào 0.2 ml thuốc thử folin, lắc 5-10 phút, thêm nước cất cho đủ ml Đem đo độ hấp thụ bước sóng 550 nm 42 PL Các bước tiến hành phương pháp xác định hoạt tính enzyme bromelain (Tài liệu hướng dẫn thực tập công nghệ enzyme protein, dùng cho học viên cao học- Viện khoa học công nghệ việt nam- Viện sinh học nhiệt đới, 2010) Dựng đường chuẩn tyrosin − Pha dung dịch tyrosin nồng độ khác 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 µg/ 1ml HCl 0.1M Thêm ml dung dịch Na2CO3 0.4M vào ml dung dịch tyrosin thêm ml thuốc thử Folin pha loãng lần vào dung dịch hỗn hợp Sau trộn đều, để ổn định dung dịch 37 ± 0.50C 20 phút Đo độ hấp thụ dung dịch bước sóng 660 nm − Với mẫu đối chứng, dùng ml HCl 0,1M thay cho tyrosin, đo độ hấp thụ dung dịch bước sóng 660 nm − Dựng đường chuẩn theo hàm lượng tyrosin độ hấp thụ đo Xác định hoạt tính protease bromelain − Cho 1ml dung dịch chất casein 1,5% vào ống nghiệm, ủ nhiệt độ 37 ± 0.50C 5-10 phút Sau thời gian ủ, cho ml dung dịch enzyme vào lắc Đem ủ hỗn hợp 37 ± 0.50C 60 phút Sau đó, cho vào hỗn hợp ml dung dịch trichloracetic 0,4M Để ổn định dung dịch 25 phút, sau lọc dung dịch qua giấy lọc loại kết tủa Cho ml dung dịch Na2CO3 0.4M vào 1ml dịch lọc, thêm ml thuốc thử Folin pha loãng lần vào dung dịch hỗn hợp Trộn đều, để yên 37 ± 0.50C 20 phút Khi dung dịch xuất màu xanh, đem đo độ hấp thụ bước sóng 660 nm − Mẫu đối chứng lấy 1ml nước cất thay cho ml dung dịch enzyme tiến hành bước tương tự mẫu thí nghiệm với điều kiện Ghi nhận kết đo độ hấp thụ PL Các bước tiến hành phương pháp xác định trọng lượng phân tử protein điện di gel polyacrylamide (SDS-page) ¾ Chuẩn bị gel phân tách (Resloving gel) cực dương (15%) Pha hỗn hợp theo bảng sau: 43 Hóa chất Thể tích (µl) Đệm Tris-HCl pH 8,8 745 Nước cất lần 1375 Dung dịch acrylamide 30% 2145 Dung dịch SDS 10% 28,5 APS 25% 50 - Khử khí 10 phút - Cho 6µl TEMED vào - Lắc nhẹ thành dung dịch đồng - Dùng micropippette bơm dung dịch vào khuôn cho khơng tạo bọt khí đến cao khoảng 5-8cm - Nhẹ nhàng cho lớp nước cất lên gel chờ cho gel cứng (5- 10phút) ¾ Chuẩn bị gel gom (Stacking gel) cực âm (5%) Pha hỗn hợp theo bảng sau: Hóa chất Thể tích (µl) Đệm Tris-HCl pH 6,8 250 Nước cất lần 1400 Dung dịch acrylamide 30% 330 Dung dịch SDS 10% 20 APS 25% 20 - Khử khí 10 phút - Cho 6µl TEMED vào - Lắc nhẹ cho tan hết thành dung dịch đồng - Sau gel phân tách đơng cứng hồn tồn, hút lớp nước bên - Dùng micropipette bơm dung dịch lên lớp gel phân tách cho không tạo bọt khí - Đưa lược vào gel để tạo giếng 44 - Khi gel đơng cứng hồn tồn lấy lược ¾ Chạy điện di - Nhẹ nhàng lắp khuôn gel vào điện di - Cho đệm điện di vào buồng điện di - Cho 15-20 µl dung dịch mẫu vào giếng theo thứ tự - Đậy hộp điện di đóng mạch điện 100V - Chạy khoảng nhiệt độ phòng với dòng điện khơng đổi 30mA ¾ Nhuộm màu sau điện di SDS-PAGE - Sau chạy điện di xong, lấy gel khỏi - Ngâm dung dịch nhuộm màu protein, lay động nhẹ thời gian 1-4 - Chuyển gel sang ngâm dung dịch rửa mẫu, thay dung dịch vài lần gel có màu suốt, lúc xuất băng có màu xanh lơ băng protein PL Bảng khảo sát ảnh hưởng kích thước nguyên liệu (thời gian xay thay đổi) đến hoạt tính bromelain dịch trích từ chồi dứa Thời Hoạt tính tổng enzyme bromelain gian xay (đvht/g nguyên liệu) (phút) Mẫu không qua xử lý siêu âm Mẫu có qua xử lý siêu âm 60,03a ± 0,02 61,08d ± 0,49 65,02b ± 0,10 67,33e ± 0,19 65,24c ± 0,11 66,71e ± 0,32 Trong cột, giá trị có ký tự chữ khác khơng có ý nghĩa (p < 0.05) 45 PL Giá trị hàm mục tiêu theo công suất siêu âm Công suất siêu âm Hoạt tính chung Hàm lượng protein Hoạt tính riêng (W/g nguyên liệu) (đvht/g nguyên liệu) (mg/g nguyên liệu) (đvht/mh protein) 68.73a ± 0.41 1.36a± 0.001 50.63a± 0.41 3.8 69.59b± 0.03 1.37b± 0.001 50.77a± 0.08 4.7 71.89c± 0.08 1.38c± 0.004 52.24b± 0.03 5.6 72.73d± 0.15 1.39d± 0.001 52.42b± 0.04 6.6 70.34e± 0.57 1.40e± 0.002 50.22a± 0.47 7.5 67.66f± 0.21 1.42f± 0.004 47.89c± 0.04 Trong cột, giá trị có ký tự chữ khác khơng có ý nghĩa (p < 0.05) PL Giá trị hàm mục tiêu theo pH dung dịch enzyme bromelain không xử lý siêu âm Hoạt tính chung Hàm lượng protein Hoạt tính riêng (đvht/g nguyên liệu) (mg/g nguyên liệu) (đvht/mh protein) 6.0 67.79a± 0.04 1.34a± 0.00 50.61a± 0.23 6.5 68.73b± 0.42 1.36ab± 0.00 50.63a± 0.41 7.0 66.57c± 0.21 1.37b± 0.01 48.42b± 0.25 7.5 66.53c± 0.03 1.42c± 0.02 47.01c± 0.65 8.0 62.26d± 0.03 1.38b± 0.00 45.20d± 0.07 pH Trong cột, giá trị có ký tự chữ khác khơng có ý nghĩa (p < 0.05) 46 PL Giá trị hàm mục tiêu theo pH dung dịch enzyme bromelain sau xử lý siêu âm Hoạt tính chung Hàm lượng protein Hoạt tính riêng (đvht/g nguyên liệu) (mg/g nguyên liệu) (đvht/mh protein) 6.0 64.71a± 0.54 1.32a± 0.01 48.97a± 0.26 6.5 72.72b± 0.15 1.39bc± 0.00 52.41b± 0.04 7.0 67.37c± 0.21 1.41c± 0.01 47.73c± 0.40 7.5 66.24d± 0.15 1.45d± 0.01 45.77d± 0.64 8.0 62.60e± 0.33 1.38b± 0.01 45.49d± 0.08 pH Trong cột, giá trị có ký tự chữ khác khơng có ý nghĩa (p < 0.05) PL Giá trị hàm mục tiêu theo nhiệt độ dung dịch xử lý Nhiệt độ dung dịch Hoạt tính chung Hàm lượng protein Hoạt tính riêng (0C) (đvht/g nguyên liệu) (mg/g nguyên liệu) (đvht/mh protein) 10 67.12a± 0.27 1.38a± 0.00 48.77a± 0.16 20 70.15b± 0.36 1.38a± 00 50.81b± 0.19 30 72.73c± 0.15 1.39b± 00 52.42c± 0.04 40 67.97a± 0.71 1.39b± 00 48.87a± 0.54 50 65.36d± 0.08 1.40c± 00 46.77d± 0.03 Trong cột, giá trị có ký tự chữ khác khơng có ý nghĩa (p < 0.05) 47 PL 10 Giá trị hàm mục tiêu theo thời gian xử lý siêu âm Thời gian siêu âm Hoạt tính chung Hàm lượng protein Hoạt tính riêng (giây) (đvht/g nguyên liệu) (mg/g nguyên liệu) (đvht/mh protein) 68.73b± 0.42 1.36a± 0.00 50.63c± 0.41 30 69.98c± 0.06 1.37b± 00 51.15d± 0.06 60 72.72f± 0.15 1.39c± 00 52.41e± 0.03 90 71.72d± 0.08 1.39d± 01 51.86f± 0.10 120 70.82e± 0.11 1.41e± 00 50.20c± 0.12 150 69.54c± 0.27 1.44f± 01 48.13b± 0.12 180 67.62a± 0.50 1.48g± 00 45.66a± 0.28 Trong cột, giá trị có ký tự chữ khác khơng có ý nghĩa (p < 0.05) ... sóng siêu âm để trích ly enzyme từ tế bào vi sinh vật Chúng tơi khơng tìm thấy tài liệu tham khảo q trình trích ly bromelain từ dứa có sử dụng sóng siêu âm Trích ly với hỗ trợ sóng siêu âm kỹ... phẩm 1.2 Sóng siêu âm ứng dụng q trình trích ly 1.2.1 Khái niệm 1.2.2 Cơ chế tác dụng sóng siêu âm q trình trích ly 1.2.3 Ứng dụng sóng siêu âm q trình trích ly 1.2.4... trình trích ly bromelain từ chồi dứa triệt để không làm vô hoạt enzyme 2 Mục tiêu nghiên cứu Nâng cao hiệu suất trích ly thu enzyme bromelain từ chồi dứa cách sử dụng q trình trích ly có hỗ trợ sóng