Đặc biệt, số lƣợng enzyme đƣợc ứng dụng trong công nghệ thực phẩm là nhiều nhất. Thƣờng đƣợc sử dụng trong các lĩnh vực sản xuất nƣớc chấm: nƣớc mấm, tƣơng, chao…Đồng thời enzyme đƣợc bổ sung vào thực phẩm nhằm làm mềm thịt, tăng hƣơng vị thịt sau khi chế biến. Trong công nghệ sữa các protease nhƣ rennin, pepsine đƣợc dùng trong sản xuất formate, sữa đông tụ.
Enzyme hầu hết có nguồn gốc từ động vật, thực vật và vi sinh vật. Ở Việt Nam, việc sản xuất enzyme ở quy mô công nghiệp chƣa phát triển và vẫn còn phụ thuộc vào nguồn enzyme từ nƣớc ngoài.
Bảng 2.5: Thị trƣờng enzyme trong công nghệ thực phẩm (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004) Lĩnh vực công nghiệp và enzyme Giá trị (triệu USD) Lĩnh vực công nghiệp và enzyme Giá trị (triệu USD)
Chuyển hóa tinh bột Amylo glucosidase α-amylase Glucose isomerase Cellulose, hemicellulase Enzyme nấm sợi Pullunase β-amylase 140 55 40 20 5 3 1 1
Công nghiệp bánh kẹo Amylase nấm sợi α-amylase Protease Cellulase, hemicellulase 15 10 – 12 1 – 2 1 – 2 1 – 2
Công nghiệp sữa Rennet động vật Rennet vi sinh vật Lipase – esterase Lysozyme 110 75 20 8 6 Thực phẩm hỗn hợp Invertase Lipase Bromelin Glucoseoxidase 15 8 2 3 – 4 1 – 2 Rƣợu, bia, nƣớc giải khát
Pectinase Papain β-glucanase Cellulase, hemicellulase α-amylase Amyloglucosidase Glucose oxidase 46 10 8 4 3 – 4 2 – 3 1 – 2 0,5 Thức ăn gia súc β-glucanase Cellulase, hemicellulase α-amylase Glucoseoxidase Protease vi khuẩn Cồn 8 3 – 4 2 – 3 < 1 < 0,5 <0,5 32 2.2.4.2 Ứng dụng trong phân tích
Acetylcholinesterase là một ứng dụng quan trọng của enzyme để phát hiện các chất độc thần kinh. Phƣơng pháp hóa học chỉ phát hiện đƣợc các chất độc ở nồng độ lớn gấp 10000 lần so với liều chết. Phƣơng pháp enzyme có độ nhạy gấp 106 so với phƣơng pháp hóa học. Việc này mở ra triển vọng mới trong việc phòng ngừa và bảo vệ con ngƣời khỏi các độc tố nguy hiểm.
2.2.4.3 Ứng dụng trong y học, mỹ phẩm và nông nghiệp
Y học: Ngày nay, ngƣời ta có thể ứng dụng tính đặc hiệu của enzyme để sản xuất ra các loại dƣợc phẩm nhƣ glucosamine sulphat hay sản xuất ra các chất kháng sinh bán tổng hợp và các dẫn xuất của chất kháng sinh. Bên cạnh đó protease nhƣ trypsine, α- chymotrypsine dùng sản xuất thuốc chữa bệnh kém tiêu hóa, tiêu mủ các ổ viêm, làm thông đƣờng hô hấp rất thông dụng trên thị trƣờng dƣợc phẩm.
Trong mỹ phẩm: trộn một lƣợng nhỏ protease vào keo xoa, keo cạo râu, dầu gội, dầu bôi tóc, kem mặt,… để làm da mềm mại, tẩy bỏ dễ dàng lớp tế bào da.
lý sơ bộ thức ăn. Hiện nay, các chế phẩm vi sinh chứa hỗn hợp protease và các enzyme thủy phân khác cũng đƣợc cũng đƣợc sử dụng cho ngành nuôi trồng thủy sản làm tăng hệ số tiêu hóa, làm giảm thiểu sự ô nhiễm môi trƣờng nƣớc nuôi.
Ngoài ra protease còn ứng dụng rộng rãi trong một số ngành khác nhƣ công nghiệp thuộc da để làm mềm da, tăng cƣờng khả năng tách lông ra khỏi da nhƣng không làm ảnh hƣởng đến chất lƣợng da. Trong công nghệ sản xuất xà phòng làm tăng khả năng tẩy vết bẩn có thành phần là protein.
2.2.4.4 Ứng dụng trong công nghiệp năng lượng
Hyrogenase đƣợc sử dụng để giải quyết vấn đề năng lƣợng.
2H+ + 2e- H2
Ngƣời ta đã chứng minh đƣợc sử dụng phƣơng pháp sinh học nhờ ánh sáng mặt trời và các quá trình sinh học để chuyển hóa một cách liên tục năng lƣợng mặt trời từ dạng bức xạ về dạng nhiên liệu hydro.
2.3 Các nghiên cứu đã đƣợc thực hiện
Ngày nay, việc tận dụng tối đa các phế phẩm đã trở thành một yêu cầu bức thiết. Nhiều nghiên cứu khoa học đã đƣợc tiến hành nhằm tìm ra hƣớng đi tối ƣu cho các phế liệu. Vì vậy, việc phát hiện và trích ly đƣợc enzyme từ nội tạng của các loài cá đã mở ra một hƣớng đi mới cho các nghiên cứu khoa học. Với các nghiên cứu tiêu biểu nhƣ:
Năm 1998, Manuel Dıaz-López và cộng sự đã nghiên cứu về đặc tính của protease acid trong bao tử cá sống ở vùng nƣớc lạnh. Nghiên cứu này đã đƣa ra đƣợc nhiều đặc tính quan trọng của enzyme protease acid nhƣ điểm đẳng điện, pH tối ƣu, nhiệt độ, từ đó tác giả có những so sánh về enzyme protease acid của cá với protease của các động vật có vú.
Năm 2006, nghiên cứu của Trần Quốc Hiền và Lê Văn Việt Mẩn (Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II, Trƣờng Đại học Bách khoa, ĐHQG-HCM) về vấn đề thu nhận chế phẩm protease từ ruột cá basa (Pangasius bocourti) đã đƣợc công bố trên tạp chí PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 9, SỐ11 -2006
Năm 2012, những nghiên cứu về việc trích ly enzyme protease từ các phế phẩm cá Trích đã đƣợc thực hiện bởi viện nghiên cứu thực phẩm, khai thác và nuôi trồng thủy sản Na Uy - Nofima Mát và thu đƣợc nhiều kết quả. Hơn nữa, họ đã tìm thấy và thu đƣợc khoảng 25 loại enzyme và đang tập trung nghiên cứu về đặc tính của 4 loại trong số chúng.
Ngày nay, việc nghiên cứu trích ly enzyme từ phế phẩm đã đƣợc mở rộng trên nhiều đối tƣợng: cá hồi, cá tuyết, cá lóc, cá trích…Lĩnh vực nghiên cứu này hứa hẹn sẽ góp phần nâng cao giá trị của con cá và giải quyết hiệu quả vấn đề môi trƣờng.
CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm
Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 1/8/2014 đến 1/12/2014 tại phòng Công nghệ sau thu hoạch (D109), bộ môn công nghệ thực phẩm khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, trƣờng ĐHCT.
3.2 Vật liệu
- Sử dụng nội tạng cá tra đƣợc mua từ chợ - Tách lấy ruột cá
- Bảo quản: đông lạnh nguyên liệu ở -21oC
- Xay nhuyễn bằng máy xay (national blender –model MX795N, 220 – 240V, 50 – 60Hz (nhiệt độ nguyên liệu sau khi xay không vƣợt quá 5oC).
3.3 Hóa chất
- Dung dịch đệm phosphate (Na2HPO4.12H2O và NaH2PO4.2H2O) - Dung dịch đệm glycine – NaOH
- Dung dịch tyrosin chuẩn 1 mM/l trong dung dịch HCl 0.2N - Casein 1%
- Dung dịch TCA 5% - Dung dịch NaOH 0.5N - Thuốc thử Folin.
3.4 Thiết bị và dụng cụ
- Máy đo quang phổ - Máy đo pH
- Cân phân tích - Tủ sấy
- Bể điều nhiệt (Water bath)
3.5 Phƣơng pháp trích ly enzyme từ nội tạng cá tra
Hình 3.1: Sơ đồ quy trình trích ly enzyme protease từ ruột cá tra 3.6 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Xác định tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi
Mục đích: Tìm ra tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi tối ƣu nhất cho quá trình trích ly enzyme
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên với 1 nhân tố
Nhân tố A: Tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi, thay đổi theo 4 mức độ
A1: 1:1 A3: 1:3
A2: 1:2 A4: 1:4
Cố định các yếu tố sau:
- Thời gian trích ly 10 phút, T = 30oC ± 2 (nhiệt độ phòng) - Dung môi là nƣớc cất
Sơ đồ bố trí thí nghiệm đƣợc trình bày ở hình 3.2
Nội tạng Ruột Cấp đông -21o C Xay nhuyễn Trích ly Lọc thô Ly tâm lạnh Dịch enzyme thô 10 000 vòng 10 phút 4 oC Thời gian: 1 phút T < 5 oC
Hình 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1
Số nghiệm thức: 4 nghiệm thức Số lần lặp lại: 3 lần
Số mẫu thí nghiệm: 4 x 3 = 12 mẫu
Khối lƣợng mẫu cho một lần khảo sát: 10 g.
Tiến hành thí nghiệm: Nội tạng sau khi mua về đƣợc xử lý sơ bộ, tách ruột và bảo quản ở - 21o
C. Ruột đƣợc sử dụng trong thí nghiệm có thời gian bảo quản 24 – 48h. Ruột đƣợc xay nhuyễn, tiến hành trích ly với nhiệt độ thủy phân cố định là nhiệt độ phòng (30°C) tƣơng ứng với từng tỷ lệ trích ly, tiến hành xác định hoạt tính enzyme protease trong dung dịch enzyme thô.
Chỉ tiêu theo dõi: Hoạt tính enzyme protease (UI/ ml dd enzyme thô trích từ 10g ruột cá)
Thí nghiệm 2:Xác định thời gian trích ly thích hợp
Mục đích: Tìm ra thời gian tối ƣu nhất cho quá trình trích ly enzyme để có hoạt tính enzyme cao nhất
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên với 1 nhân tố
Nhân tố B: Thời gian thay đổi theo 4 mức độ B1: 5 phút B3: 15 phút B2: 10 phút B4: 20 phút Cố định các yếu tố sau: - Nhiệt độ phòng T = 30o C ± 2 - Dung môi là nƣớc cất
- Sử dụng tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi ở thí nghiệm 1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đƣợc trình bày ở hình 3.3
Ruột đã xay nhuyễn
Tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi
Xác định hoạt tính enzyme protease
Chọn ra tỷ lệ trích ly tối ƣu
Hình 3.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2
Số nghiệm thức: 4 nghiệm thức Số lần lặp lại thí nghiệm: 3 lần
Số mẫu thí nghiệm: 4 nghiệm thức x 3 = 12 mẫu Khối lƣợng mẫu cho một lần khảo sát: 10g
Tiến hành thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ thí nghiệm 1. Tuy nhiên, yếu tố thời gian đƣợc thay đổi nhằm chọn ra thời gian tối ƣu nhất cho quá trình trích ly.
Chỉ tiêu theo dõi: Hoạt tính enzyme protease (UI/ ml dd enzyme thô trích từ 10g ruột cá)
Thí nghiệm 3:Xác định pH và nhiệt độ trích ly thích hợp
Mục tiêu: Xác định pH và nhiệt độ tối ƣu cho quá trình trích ly. Sự phụ thuộc của pH và nhiệt độ đến hoạt tính enzyme protease.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên với 2 nhân tố
Nhân tố C: pH, thay đổi theo 4 mức độ
C1: 7 C3: 9
C2: 8 C4: 10
Nhân tố D: Nhiệt độ, thay đổi theo 4 mức độ D1: 20oC D3: 40oC
D2: 30oC D4: 50oC Cố định các yếu tố sau:
- Sử dụng tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi ở thí nghiệm 1 - Thời gian trích ly tối ƣu tìm đƣợc ở thí nghiệm 2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đƣợc trình bày ở hình 3.4
Thời gian Ruột đã xay nhuyễn
Tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi (chọn đƣợc ở TN1)
Xác định hoạt tính enzyme protease
Chọn ra thời gian trích ly tối ƣu
Hình 3.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3
Số nghiệm thức: 16 nghiệm thức Số lần lặp lại thí nghiệm: 3 lần
Số mẫu thí nghiệm: 16 nghiệm thức x 3 = 48 mẫu Khối lƣợng mẫu cho một lần khảo sát: 10g
Tiến hành thí nghiệm: Sử dụng dung môi trích ly là các dung dịch đệm với giá trị pH lần lƣợt là: pH 7, pH 8 (0.2M – phosphate), pH 9, pH 10 (sử dụng 0,2M glycine – NaOH). Với mỗi giá trị pH của dung dịch đệm dùng trích ly enzyme ta thực hiện ở 4 mức nhiệt độ là: 20, 30, 40, 50 (o
C).
Chỉ tiêu theo dõi: Hoạt tính enzyme protease (UI/ ml dd enzyme thô trích từ 10g ruột cá)
D4 D2 D1 D1
Thời gian (chọn đƣợc ở TN2) Tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi (chọn đƣợc ở TN1)
C1 C2 C3 C4
D2 D3
D1 D1 D3 D4 D2 D3 D4 D2 D3 D4
Xác định hoạt tính enzyme protease
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1 Ảnh hƣởng của tỷ lệ dung môi trích ly đến hoạt tính enzyme protease
Ruột cá sau khi xay đƣợc đem trích ly bằng nƣớc cất ở nhiệt độ 30o
C trong thời gian 10 phút. Tỷ lệ ruột/ nƣớc cất đƣợc thay đổ lần lƣợt là: 1:1, 1:2, 1:3, 1:4. Kết quả đƣợc trình bày nhƣ sau:
Hình 4.1: Ảnh hƣởng của tỷ lệ ruột/ dung môi đến hoạt tính protease trích ly
Các giá trị có mẫu tự đi kèm giống nhau ở cùng một cột khác biệt không ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy 95% theo phép thử LSD
Từ kết quả thực nghiệm, dịch trích enzyme thu đƣợc có hoạt tính protease cao nhất là 1.028 UI/ ml dịch enzyme thô tƣơng ứng với tỷ lệ ruột/dung môi là 1:2.
Khi tăng từ tỷ lệ 1:1 lên 1:2 thì hoạt tính enzyme trích ly tăng lên khá nhiều là do khi tăng lƣợng dung môi thì sự khuếch tán của các phân tử vào dung môi sẽ dễ dàng hơn do đó quá trình trích ly dễ dàng. Tuy nhiên, hoạt tính của enzyme protease giảm mạnh khi ta tăng tỷ lệ từ 1:2 lên 1:3, khi trích ly ở tỷ lệ 1:3 và 1:4 không có sự khác nhau về mặt ý nghĩa đối với hoạt tính của enzyme protease tuy nhiên ta thấy có sự giảm nhẹ về mặt hoạt tính khi ta thay đổi tỷ lệ trích ly từ 1:3 lên 1:4. Là do khi sử dụng tỷ lệ dung môi quá lớn với cùng một khối lƣợng ruột cá thì giá trị pH của dịch trích bị thay đổi và điều đó có khả năng ảnh hƣởng đến độ hòa tan của enzyme protease vào dung môi. Đồng thời, khi tăng lƣợng dung môi sử dụng nhiều hơn so với tỷ lệ ruột/ dung môi = 1:2 thì dịch trích ly bị pha loãng làm giảm hàm lƣợng của protease có trong cùng một thể tích dịch trích nên hoạt tính protease của dịch trích ly sẽ giảm.
Trong nghiên cứu của Trần Quốc Hiển và cộng sự (2006) đã đề nghị tỷ lệ khối lƣợng nguyên liệu/ dung môi là 1:1 thì enzyme protease thể hiện hoạt tính cao nhất. Tuy nhiên, thí nghiệm này lại cho thấy tỷ lệ 1:2 là tối ƣu cho quá trình trích ly enzyme protease. Sự khác biệt của hoạt tính protease trong cả hai thí nghiệm này có thể là do khác biệt về khối lƣợng nội tạng đem đi trích ly và thời gian trữ đông nguyên liệu trƣớc khi trích ly.
4.2 Ảnh hƣởng của thời gian trích ly đến hoạt tính enzyme protease
Tiến hành trích ly protease từ ruột cá tra với dung môi là nƣớc, ở nhiệt độ 30oC với tỷ lệ ruột/ dung môi là 1:2. Thời gian trích ly thay đổi lần lƣợt là: 5, 10, 15, 20 phút. Kết quả thực nghiệm đƣợc trình bày ở hình 4.3
Hình 4.2: Ảnh hƣởng của thời gian trích ly đến hoạt tính protease
Các giá trị có mẫu tự đi kèm giống nhau ở cùng một cột khác biệt không ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy 95% theo phép thử LSD
Thời gian trích ly có ảnh hƣởng lớn đến hoạt tính enzyme protease. Khi thời gian trích ly là 5 phút thì lƣợng enzyme hòa tan vào dung môi thấp nhƣng khi tăng thời gian trích ly lên 10 phút thì hoạt tính enzyme đạt tới 1.028 UI/ ml dd enzyme thô, tăng gần 38% so với khi trích ly ở thời gian 5 phút. Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng thời gian trích ly lên 15, 20 phút thì hoạt tính enzyme lại giảm, sự giảm hoạt tính protease thể hiện mạnh nhất ở thời gian trích ly 20 phút. Hiện tƣợng này có thể là do sự tự phân giải của bản thân protease, do protease có bản chất là protein nên khi hòa tan vào dung môi, trong điều kiện nhiệt độ 30o
C thì tự phân cắt tạo ra các chuỗi peptide có khối lƣợng phân tử nhỏ hơn protease và không có hoạt tính enzyme. Vì vậy,
không nên trích ly enzyme trong thời gian quá lâu, thời gian trích ly 10 phút là tối ƣu nhất trong thí nghiệm này. Thời gian trích ly này cũng phù hợp với nghiên cứu của Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn (2006).
4.3 Ảnh hƣởng của pH và nhiệt độ đến hoạt tính enzyme protease trích ly
Thông thƣờng hệ enzyme đƣờng ruột là một loại protease kiềm nên giá trị pH trong thí nghiệm đƣợc cố định trong khoảng từ 7 – 9. Sử dụng các dung dịch đệm cho các giá trị pH nhƣ sau: 0.2M – phosphate cho pH 7 và pH 8, sử dụng đệm 0.2M glycine – NaOH cho pH 9 và pH 10. Với giá trị nhiệt độ là 20, 30, 40, 50oC. Chọn thời gian trích ly là 10 phút, 30oC và tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi 1:2.
Bản chất của enzyme là protein do đó nhiệt độ có ảnh hƣởng rất lớn đến vận tốc phản