Hình 3.1: Sơ đồ quy trình trích ly enzyme protease từ ruột cá tra 3.6 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Xác định tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi
Mục đích: Tìm ra tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi tối ƣu nhất cho quá trình trích ly enzyme
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên với 1 nhân tố
Nhân tố A: Tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi, thay đổi theo 4 mức độ
A1: 1:1 A3: 1:3
A2: 1:2 A4: 1:4
Cố định các yếu tố sau:
- Thời gian trích ly 10 phút, T = 30oC ± 2 (nhiệt độ phòng) - Dung môi là nƣớc cất
Sơ đồ bố trí thí nghiệm đƣợc trình bày ở hình 3.2
Nội tạng Ruột Cấp đông -21o C Xay nhuyễn Trích ly Lọc thô Ly tâm lạnh Dịch enzyme thô 10 000 vòng 10 phút 4 oC Thời gian: 1 phút T < 5 oC
Hình 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1
Số nghiệm thức: 4 nghiệm thức Số lần lặp lại: 3 lần
Số mẫu thí nghiệm: 4 x 3 = 12 mẫu
Khối lƣợng mẫu cho một lần khảo sát: 10 g.
Tiến hành thí nghiệm: Nội tạng sau khi mua về đƣợc xử lý sơ bộ, tách ruột và bảo quản ở - 21o
C. Ruột đƣợc sử dụng trong thí nghiệm có thời gian bảo quản 24 – 48h. Ruột đƣợc xay nhuyễn, tiến hành trích ly với nhiệt độ thủy phân cố định là nhiệt độ phòng (30°C) tƣơng ứng với từng tỷ lệ trích ly, tiến hành xác định hoạt tính enzyme protease trong dung dịch enzyme thô.
Chỉ tiêu theo dõi: Hoạt tính enzyme protease (UI/ ml dd enzyme thô trích từ 10g ruột cá)
Thí nghiệm 2:Xác định thời gian trích ly thích hợp
Mục đích: Tìm ra thời gian tối ƣu nhất cho quá trình trích ly enzyme để có hoạt tính enzyme cao nhất
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên với 1 nhân tố
Nhân tố B: Thời gian thay đổi theo 4 mức độ B1: 5 phút B3: 15 phút B2: 10 phút B4: 20 phút Cố định các yếu tố sau: - Nhiệt độ phòng T = 30o C ± 2 - Dung môi là nƣớc cất
- Sử dụng tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi ở thí nghiệm 1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đƣợc trình bày ở hình 3.3
Ruột đã xay nhuyễn
Tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi
Xác định hoạt tính enzyme protease
Chọn ra tỷ lệ trích ly tối ƣu
Hình 3.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2
Số nghiệm thức: 4 nghiệm thức Số lần lặp lại thí nghiệm: 3 lần
Số mẫu thí nghiệm: 4 nghiệm thức x 3 = 12 mẫu Khối lƣợng mẫu cho một lần khảo sát: 10g
Tiến hành thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ thí nghiệm 1. Tuy nhiên, yếu tố thời gian đƣợc thay đổi nhằm chọn ra thời gian tối ƣu nhất cho quá trình trích ly.
Chỉ tiêu theo dõi: Hoạt tính enzyme protease (UI/ ml dd enzyme thô trích từ 10g ruột cá)
Thí nghiệm 3:Xác định pH và nhiệt độ trích ly thích hợp
Mục tiêu: Xác định pH và nhiệt độ tối ƣu cho quá trình trích ly. Sự phụ thuộc của pH và nhiệt độ đến hoạt tính enzyme protease.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên với 2 nhân tố
Nhân tố C: pH, thay đổi theo 4 mức độ
C1: 7 C3: 9
C2: 8 C4: 10
Nhân tố D: Nhiệt độ, thay đổi theo 4 mức độ D1: 20oC D3: 40oC
D2: 30oC D4: 50oC Cố định các yếu tố sau:
- Sử dụng tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi ở thí nghiệm 1 - Thời gian trích ly tối ƣu tìm đƣợc ở thí nghiệm 2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đƣợc trình bày ở hình 3.4
Thời gian Ruột đã xay nhuyễn
Tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi (chọn đƣợc ở TN1)
Xác định hoạt tính enzyme protease
Chọn ra thời gian trích ly tối ƣu
Hình 3.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3
Số nghiệm thức: 16 nghiệm thức Số lần lặp lại thí nghiệm: 3 lần
Số mẫu thí nghiệm: 16 nghiệm thức x 3 = 48 mẫu Khối lƣợng mẫu cho một lần khảo sát: 10g
Tiến hành thí nghiệm: Sử dụng dung môi trích ly là các dung dịch đệm với giá trị pH lần lƣợt là: pH 7, pH 8 (0.2M – phosphate), pH 9, pH 10 (sử dụng 0,2M glycine – NaOH). Với mỗi giá trị pH của dung dịch đệm dùng trích ly enzyme ta thực hiện ở 4 mức nhiệt độ là: 20, 30, 40, 50 (o
C).
Chỉ tiêu theo dõi: Hoạt tính enzyme protease (UI/ ml dd enzyme thô trích từ 10g ruột cá)
D4 D2 D1 D1
Thời gian (chọn đƣợc ở TN2) Tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi (chọn đƣợc ở TN1)
C1 C2 C3 C4
D2 D3
D1 D1 D3 D4 D2 D3 D4 D2 D3 D4
Xác định hoạt tính enzyme protease
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1 Ảnh hƣởng của tỷ lệ dung môi trích ly đến hoạt tính enzyme protease
Ruột cá sau khi xay đƣợc đem trích ly bằng nƣớc cất ở nhiệt độ 30o
C trong thời gian 10 phút. Tỷ lệ ruột/ nƣớc cất đƣợc thay đổ lần lƣợt là: 1:1, 1:2, 1:3, 1:4. Kết quả đƣợc trình bày nhƣ sau:
Hình 4.1: Ảnh hƣởng của tỷ lệ ruột/ dung môi đến hoạt tính protease trích ly
Các giá trị có mẫu tự đi kèm giống nhau ở cùng một cột khác biệt không ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy 95% theo phép thử LSD
Từ kết quả thực nghiệm, dịch trích enzyme thu đƣợc có hoạt tính protease cao nhất là 1.028 UI/ ml dịch enzyme thô tƣơng ứng với tỷ lệ ruột/dung môi là 1:2.
Khi tăng từ tỷ lệ 1:1 lên 1:2 thì hoạt tính enzyme trích ly tăng lên khá nhiều là do khi tăng lƣợng dung môi thì sự khuếch tán của các phân tử vào dung môi sẽ dễ dàng hơn do đó quá trình trích ly dễ dàng. Tuy nhiên, hoạt tính của enzyme protease giảm mạnh khi ta tăng tỷ lệ từ 1:2 lên 1:3, khi trích ly ở tỷ lệ 1:3 và 1:4 không có sự khác nhau về mặt ý nghĩa đối với hoạt tính của enzyme protease tuy nhiên ta thấy có sự giảm nhẹ về mặt hoạt tính khi ta thay đổi tỷ lệ trích ly từ 1:3 lên 1:4. Là do khi sử dụng tỷ lệ dung môi quá lớn với cùng một khối lƣợng ruột cá thì giá trị pH của dịch trích bị thay đổi và điều đó có khả năng ảnh hƣởng đến độ hòa tan của enzyme protease vào dung môi. Đồng thời, khi tăng lƣợng dung môi sử dụng nhiều hơn so với tỷ lệ ruột/ dung môi = 1:2 thì dịch trích ly bị pha loãng làm giảm hàm lƣợng của protease có trong cùng một thể tích dịch trích nên hoạt tính protease của dịch trích ly sẽ giảm.
Trong nghiên cứu của Trần Quốc Hiển và cộng sự (2006) đã đề nghị tỷ lệ khối lƣợng nguyên liệu/ dung môi là 1:1 thì enzyme protease thể hiện hoạt tính cao nhất. Tuy nhiên, thí nghiệm này lại cho thấy tỷ lệ 1:2 là tối ƣu cho quá trình trích ly enzyme protease. Sự khác biệt của hoạt tính protease trong cả hai thí nghiệm này có thể là do khác biệt về khối lƣợng nội tạng đem đi trích ly và thời gian trữ đông nguyên liệu trƣớc khi trích ly.
4.2 Ảnh hƣởng của thời gian trích ly đến hoạt tính enzyme protease
Tiến hành trích ly protease từ ruột cá tra với dung môi là nƣớc, ở nhiệt độ 30oC với tỷ lệ ruột/ dung môi là 1:2. Thời gian trích ly thay đổi lần lƣợt là: 5, 10, 15, 20 phút. Kết quả thực nghiệm đƣợc trình bày ở hình 4.3
Hình 4.2: Ảnh hƣởng của thời gian trích ly đến hoạt tính protease
Các giá trị có mẫu tự đi kèm giống nhau ở cùng một cột khác biệt không ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy 95% theo phép thử LSD
Thời gian trích ly có ảnh hƣởng lớn đến hoạt tính enzyme protease. Khi thời gian trích ly là 5 phút thì lƣợng enzyme hòa tan vào dung môi thấp nhƣng khi tăng thời gian trích ly lên 10 phút thì hoạt tính enzyme đạt tới 1.028 UI/ ml dd enzyme thô, tăng gần 38% so với khi trích ly ở thời gian 5 phút. Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng thời gian trích ly lên 15, 20 phút thì hoạt tính enzyme lại giảm, sự giảm hoạt tính protease thể hiện mạnh nhất ở thời gian trích ly 20 phút. Hiện tƣợng này có thể là do sự tự phân giải của bản thân protease, do protease có bản chất là protein nên khi hòa tan vào dung môi, trong điều kiện nhiệt độ 30o
C thì tự phân cắt tạo ra các chuỗi peptide có khối lƣợng phân tử nhỏ hơn protease và không có hoạt tính enzyme. Vì vậy,
không nên trích ly enzyme trong thời gian quá lâu, thời gian trích ly 10 phút là tối ƣu nhất trong thí nghiệm này. Thời gian trích ly này cũng phù hợp với nghiên cứu của Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn (2006).
4.3 Ảnh hƣởng của pH và nhiệt độ đến hoạt tính enzyme protease trích ly
Thông thƣờng hệ enzyme đƣờng ruột là một loại protease kiềm nên giá trị pH trong thí nghiệm đƣợc cố định trong khoảng từ 7 – 9. Sử dụng các dung dịch đệm cho các giá trị pH nhƣ sau: 0.2M – phosphate cho pH 7 và pH 8, sử dụng đệm 0.2M glycine – NaOH cho pH 9 và pH 10. Với giá trị nhiệt độ là 20, 30, 40, 50oC. Chọn thời gian trích ly là 10 phút, 30oC và tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi 1:2.
Bản chất của enzyme là protein do đó nhiệt độ có ảnh hƣởng rất lớn đến vận tốc phản ứng. Nhiệt độ tăng tốc độ phản ứng tăng nhƣng đến mức nào đó thì tốc độ phản ứng giảm xuống do enzyme bị biến tính. Sự thay đổi hoạt tính protease do tác động tƣơng tác của nhiệt độ và pH đƣợc thể hiện ở hình 4.3
7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 X 20 30 40 50 Y 0.47 0.67 0.87 1.07 1.27 F u n c ti o n
Hình 4.3: Đồ thị biểu diễn sự tƣơng tác của nhiệt độ và pH đến hoạt tính enzyme protease
Quan sát biểu đồ ta nhận thấy hoạt tính enzyme protease trích ly phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ. Khi ta tăng nhiệt độ, tốc độ khuếch tán của các phân tử tăng lên, hoạt tính enzyme cao nhất ở nhiệt độ 30 – 40oC. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng nhiệt độ lên 50oC thì enzyme bị biến tính do nhiệt độ nên hoạt tính enzyme giảm đi. Vì enzyme có bản chất là protein nên phần lớn các enzyme bị giảm hoạt tính từ 50 – 60°C và bị vô hoạt ở nhiệt độ trên 70°C (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004). Đối với giá trị pH, hoạt tính enzyme protease đạt cao nhất ở pH 8.5 – 9. Khi thay đổi giá trị pH sẽ làm ảnh hƣởng đến mức độ ion hóa của trung tâm hoạt động enzyme từ đó làm giảm khả năng liên kết với cơ chất của enzyme.
Nhiệt độ Hoạt tính enzyme
Dựa trên các khảo sát đã đƣợc nghiên cứu cho thấy sự ảnh hƣởng tƣơng tác của nhân tố pH và nhiệt độ đến hoạt tính protease. Nghiên cứu của Nguyễn Văn Lệ (1996) đã tách đƣợc protease từ đầu tôm có nhiệt độ thích hợp là 50 – 60°C và pH tƣơng ứng là 7.5 – 8.5, hay Nguyễn Thị Mỹ Trang (2004) đã công bố công trình nghiên cứu protease của đầu tôm bạc nghệ có nhiệt độ thích hợp là 50°C và pH tối thích trong khoảng từ 8.5 – 9.5. Đồng thời, Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn (2006) đã thu nhận thành công chế phẩm enzyme protease từ ruột cá basa có pH tối ƣu là 9.5 và nhiệt độ tối ƣu là 35°C. Từ kết quả của những nghiên cứu đã công bố và kết quả thí nghiệm cho thấy enzyme protease trích ly có hoạt tính cao nhất ở nhiệt độ 30 – 40o
C và pH 8.5 – 9 là phù hợp với tính chất của loại enzyme protease này.
Nghiên cứu của xác định hồi quy tƣơng quan của 2 nhân tố, bao gồm pH X1 từ 7 – 10 và nhiệt độ X2 từ 20 – 50°C đến hoạt tính protease (Y, UI/ml dịch enzyme thô) đã đƣợc thực hiện. Kết quả phân tích ảnh hƣởng của các nhân tố mã hóa đối với phƣơng trình hồi quy đƣợc trình bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của các nhân tố đến phƣơng trình hồi quy
Nhân tố Tổng bình phƣơng Bậc tự do Phƣơng sai Giá trị P
pH (X1) 0.0644848 1 0.0644848 0.0054
Thoi gian (X2) 0.059472 1 0.059472 0.0073
pH*pH (X1*X1) 0.294533 1 0.294533 0.0000
Thoi gian*Thoi gian (X2*X2)
1.5776 1 1.5776 0.0000
Thoi gian*pH (X1*X2) 0.0307851 1 0.0307851 0.0488 Ta thấy, tất cả các nhân tố đều có giá trị P nhỏ hơn 0.05 đã chứng tỏ tất cả các nhân tố đều có ảnh hƣởng đến hoạt tính của enzyme protease trích ly. Đồng thời, trong kết quả thống kê cho thấy hệ số hồi quy bậc một của X1, X2 , hệ số tƣơng tác của X1*X2 và hệ số hồi quy bậc hai của X12, X22 đều có ý nghĩa về mặt thống kê, ở độ tin cậy 95%. Điều này đã góp phần khẳng định khả năng ảnh hƣởng của biến độc lập và ảnh hƣởng sự tƣơng tác của chúng đến hoạt tính của enzyme protease trong quá trình trích ly.
Dựa trên kết quả phân tích ANOVA, phƣơng trình hồi quy mô phỏng hoạt tính enzyme protease (Y) đƣợc thiết lập nhằm mục đích dự đoán hoạt tính của enzyme protease gần với giá trị thực nhất.
Y= - 6.89178 + 1.37021* X1+ 0.140972* X2 - 0.0783542* X12 - 0.00181271* X22
- 0.002027* X1*X2 với giá trị R2
= 86.6% (1)
Giải phƣơng trình hồi quy (1) và dựa trên kết quả thu đƣợc ở hình 4.3, điều kiện thích hợp để trích ly enzyme từ ruột cá tra là: pH = 8.5 và nhiệt độ 35°C.
CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 Kết luận
Việc nghiên cứu trích ly enzyme protease từ ruột cá tra bƣớc đầu đã thu đƣợc những kết quả khả quan.
Quá trình trích ly enzyme protease từ ruột cá tra với tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi là 1:2, thời gian trích ly 10 phút đã thu đƣợc dung dịch enzyme thô có hoạt tính cao nhất là 1.028 UI/ ml dd enzyme thô trích từ 10g ruột cá.
Ảnh hƣởng tƣơng tác của pH và nhiệt độ đến hoạt tính protease đƣợc thể hiện rõ qua phƣơng trình hồi quy Y= - 6.89178 + 1.37021* X1 + 0.140972* X2 - 0.0783542* X12 - 0.00181271* X22 - 0.002027* X1*X2 (R2 = 86.6%).
Đồng thời, dịch trích enzyme protease có hoạt tính cao nhất là 1.2043 UI/ ml dd enzyme thô trích từ 10g ruột cá khi tiến hành trích ly với tỷ lệ nguyên liệu /dung môi là 1:2, thời gian trích ly 10 phút, pH tối ƣu là 8.5 và ở nhiệt độ 35oC
5.2 Đề nghị
Do thời gian nghiên cứu có giới hạn nên còn có một số vấn đề nghiên cứu còn hạn chế và cần đƣợc nghiên cứu sâu hơn nhằm tăng hoạt tính enzyme protease trích ly
- Khảo sát thêm các giá trị pH và nhiệt độ để tăng độ chính xác của phƣơng trình hồi quy
- Tinh sạch enzyme nhằm làm tăng hoạt tính và thời gian bảo quản enzyme - Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian trữ đông và nhiệt độ của quá trình trữ
đông đến hoạt tính enzyme protease thu đƣợc trong dịch trích
- Thời gian bảo quản dịch trích enzyme thô ảnh hƣởng đến hoạt tính enzyme protease
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. M.D. Menon và Cheko – Bộ ngƣ nghiệp Madraas Ấn Độ - FAO, 1995
2. Nguyễn Đức Lƣợng (chủ biên). Công nghiệp enzyme, 2004. ĐH Quốc Gia TP Hồ Chí Minh
3. Nguyễn Công Hà, Lê Nguyễn Đoan Duy. Giáo trình kỹ thuật thực phẩm 3, 2011. Đại học Cần Thơ
4. Nguyễn Minh Thủy. Giáo trình dinh dƣỡng ngƣời, 2005. Đại học Cần Thơ 5. Lê Ngọc Tú (Chủ biên). Hóa sinh công nghiệp, 2004. Khoa học và Kỹ thuật
Hà Nội
6. Nguyễn Đức Lƣợng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết. Thí nghiệm công nghệ sinh học (Tập 2)- Thí nghiệm Vi sinh vật học, 2003. ĐH Quốc Gia TP Hồ Chí Minh
7. Ts Phạm Quang Chinh, PGS.Ts Biền Văn Minh. Cách xác định hoạt tính protease, 2013.
8. Trần Đình Toại, Nguyễn Thị Vân Hải. Động học các quá trình xúc tác sinh học, 2005. Khoa học và Kỹ thuật – Hà Nội
9. Gs.Ts Nguyễn Hữu Chấn (chủ biên). Những vấn đề hóa sinh học hiện đại –