Thông thƣờng hệ enzyme đƣờng ruột là một loại protease kiềm nên giá trị pH trong thí nghiệm đƣợc cố định trong khoảng từ 7 – 9. Sử dụng các dung dịch đệm cho các giá trị pH nhƣ sau: 0.2M – phosphate cho pH 7 và pH 8, sử dụng đệm 0.2M glycine – NaOH cho pH 9 và pH 10. Với giá trị nhiệt độ là 20, 30, 40, 50oC. Chọn thời gian trích ly là 10 phút, 30oC và tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi 1:2.
Bản chất của enzyme là protein do đó nhiệt độ có ảnh hƣởng rất lớn đến vận tốc phản ứng. Nhiệt độ tăng tốc độ phản ứng tăng nhƣng đến mức nào đó thì tốc độ phản ứng giảm xuống do enzyme bị biến tính. Sự thay đổi hoạt tính protease do tác động tƣơng tác của nhiệt độ và pH đƣợc thể hiện ở hình 4.3
7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 X 20 30 40 50 Y 0.47 0.67 0.87 1.07 1.27 F u n c ti o n
Hình 4.3: Đồ thị biểu diễn sự tƣơng tác của nhiệt độ và pH đến hoạt tính enzyme protease
Quan sát biểu đồ ta nhận thấy hoạt tính enzyme protease trích ly phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ. Khi ta tăng nhiệt độ, tốc độ khuếch tán của các phân tử tăng lên, hoạt tính enzyme cao nhất ở nhiệt độ 30 – 40oC. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng nhiệt độ lên 50oC thì enzyme bị biến tính do nhiệt độ nên hoạt tính enzyme giảm đi. Vì enzyme có bản chất là protein nên phần lớn các enzyme bị giảm hoạt tính từ 50 – 60°C và bị vô hoạt ở nhiệt độ trên 70°C (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004). Đối với giá trị pH, hoạt tính enzyme protease đạt cao nhất ở pH 8.5 – 9. Khi thay đổi giá trị pH sẽ làm ảnh hƣởng đến mức độ ion hóa của trung tâm hoạt động enzyme từ đó làm giảm khả năng liên kết với cơ chất của enzyme.
Nhiệt độ Hoạt tính enzyme
Dựa trên các khảo sát đã đƣợc nghiên cứu cho thấy sự ảnh hƣởng tƣơng tác của nhân tố pH và nhiệt độ đến hoạt tính protease. Nghiên cứu của Nguyễn Văn Lệ (1996) đã tách đƣợc protease từ đầu tôm có nhiệt độ thích hợp là 50 – 60°C và pH tƣơng ứng là 7.5 – 8.5, hay Nguyễn Thị Mỹ Trang (2004) đã công bố công trình nghiên cứu protease của đầu tôm bạc nghệ có nhiệt độ thích hợp là 50°C và pH tối thích trong khoảng từ 8.5 – 9.5. Đồng thời, Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn (2006) đã thu nhận thành công chế phẩm enzyme protease từ ruột cá basa có pH tối ƣu là 9.5 và nhiệt độ tối ƣu là 35°C. Từ kết quả của những nghiên cứu đã công bố và kết quả thí nghiệm cho thấy enzyme protease trích ly có hoạt tính cao nhất ở nhiệt độ 30 – 40o
C và pH 8.5 – 9 là phù hợp với tính chất của loại enzyme protease này.
Nghiên cứu của xác định hồi quy tƣơng quan của 2 nhân tố, bao gồm pH X1 từ 7 – 10 và nhiệt độ X2 từ 20 – 50°C đến hoạt tính protease (Y, UI/ml dịch enzyme thô) đã đƣợc thực hiện. Kết quả phân tích ảnh hƣởng của các nhân tố mã hóa đối với phƣơng trình hồi quy đƣợc trình bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của các nhân tố đến phƣơng trình hồi quy
Nhân tố Tổng bình phƣơng Bậc tự do Phƣơng sai Giá trị P
pH (X1) 0.0644848 1 0.0644848 0.0054
Thoi gian (X2) 0.059472 1 0.059472 0.0073
pH*pH (X1*X1) 0.294533 1 0.294533 0.0000
Thoi gian*Thoi gian (X2*X2)
1.5776 1 1.5776 0.0000
Thoi gian*pH (X1*X2) 0.0307851 1 0.0307851 0.0488 Ta thấy, tất cả các nhân tố đều có giá trị P nhỏ hơn 0.05 đã chứng tỏ tất cả các nhân tố đều có ảnh hƣởng đến hoạt tính của enzyme protease trích ly. Đồng thời, trong kết quả thống kê cho thấy hệ số hồi quy bậc một của X1, X2 , hệ số tƣơng tác của X1*X2 và hệ số hồi quy bậc hai của X12, X22 đều có ý nghĩa về mặt thống kê, ở độ tin cậy 95%. Điều này đã góp phần khẳng định khả năng ảnh hƣởng của biến độc lập và ảnh hƣởng sự tƣơng tác của chúng đến hoạt tính của enzyme protease trong quá trình trích ly.
Dựa trên kết quả phân tích ANOVA, phƣơng trình hồi quy mô phỏng hoạt tính enzyme protease (Y) đƣợc thiết lập nhằm mục đích dự đoán hoạt tính của enzyme protease gần với giá trị thực nhất.
Y= - 6.89178 + 1.37021* X1+ 0.140972* X2 - 0.0783542* X12 - 0.00181271* X22
- 0.002027* X1*X2 với giá trị R2
= 86.6% (1)
Giải phƣơng trình hồi quy (1) và dựa trên kết quả thu đƣợc ở hình 4.3, điều kiện thích hợp để trích ly enzyme từ ruột cá tra là: pH = 8.5 và nhiệt độ 35°C.
CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ