Nghiên cứu một số phương pháp tinh chế collagen trích ly từ da cá tra ( pangasius hypophthalmus)

i ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA LÊ PHƢỢNG MAI NGHIÊN CỨU MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP TINH CHẾ COLLAGEN TRÍCH LY TỪ DA CÁ TRA (Pangasius hypophthalmus) Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm Đồ Uống LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng 08 năm 2011 ii CƠNG TRÌNH ĐƢỢC HỒN THÀNH TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH Cán hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phan Đình Tuấn TS Phan Ngọc Hồ Cán chấm nhận xét 1: PGS.TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO Cán chấm nhận xét 2: TS LÊ THỊ PHÚ Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường Đại Học Bách Khoa, ĐHQG Tp.HCM, ngày 09 tháng 08 năm 2010 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: PGS.TS NGUYỄN XÍCH LIÊN (Chủ tịch hội đồng) PGS.TS NGƠ MẠNH THẮNG (Thư kí) PGS.TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO (Uỷ viên) TS LÊ THỊ PHÚ (Uỷ viên) TS PHAN NGỌC HÒA (Uỷ viên) Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn Bộ môn quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa (nếu có) Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn Bộ môn quản lý chuyên ngành iii TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHIÃ VIỆT NAM PHÒNG ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC - Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc Tp HCM, ngày 30 tháng 07năm 2011 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: LÊ PHƯỢNG MAI Ngày, tháng, năm sinh: 21-02-1986 Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm Đồ Uống Phái: Nữ Nơi sinh: TP.HCM MSHV: 09110161 I- TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP TINH CHẾ COLLAGEN TRÍCH LY TỪ DA CÁ TRA (Pangasius Hypophthamus) II- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN: Tổng quan thành phần da cá Tra trình tách chiết collagen từ da cá Khảo sát trình kết tủa NaCl Khảo sát trình thẩm tích collagen Khảo sát q trình tinh chế collagen dung môi CO2 siêu tới hạn áp suất, lưu lượng, nhiệt độ, hàm lượng chất phụ trợ thời gian khác Phân tích tính chất collagen: trọng lượng phân tử, nhiệt độ biến tính, chụp SEM xác định cấu trúc sợi, phân tích phổ hồng ngoại xác định nhóm chức có mặt collagen III- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 14/02/2011 IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 01/07/2011 V- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƢỚNG DẪN: PGS.TS Phan Đình Tuấn TS Phan Ngọc Hoà Nội dung đề cương Luận văn thạc sĩ Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua CÁN BỘ HƢỚNG DẪN (Họ tên chữ ký) CHỦ NHIỆM BỘ MÔN QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH (Họ tên chữ ký) PGS TS Phan Đình Tuấn TS Phan Ngọc Hịa iv LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Bộ môn Công nghệ Thực Phẩm, Khoa Kỹ Thuật Hóa Học – Trường Đại Học Bách Khoa TP.HCM hổ trợ trang thiết bị, máy móc, vật tư, phịng thí nghiệm giúp em hồn thành tốt luận văn Xin cảm ơn dự án RBE (Research Based Education) - JICA hổ trợ suốt trình thực đề tài B2-06 ‘Purification fish collagen extraction and application’ xin gửi lời tri ân đến quý PGS.TS Phan Đình Tuấn, TS Phan Ngọc Hồ tận tình hướng dẫn, hổ trợ tạo điều kiện làm việc tốt cho em hoàn thành luận văn Cuối cùng, xin gửi lời chúc sức khỏe lời cám ơn chân thành đến q thầy nhóm nghiên cứu tồn thể Bộ Mơn, bạn lớp cao học K2009 – Bộ Môn Công Nghệ Thực Phẩm, Khoa kỹ thuật hóa học Xin cảm ơn v TĨM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ Luận văn phần công trình nghiên cứu trích ly tinh chế collagen từ da cá tra, phụ phẩm có giá trị kinh tế thấp công nghiệp chế biến thuỷ sản nước ta Luận văn tập trung vào phương pháp tinh chế dịch trích ly collagen để tăng độ tinh khiết sản phẩm, đáp ứng nhu cầu thực phẩm mỹ phẩm Luận văn kế thừa nghiên cứu trước nhóm qui trình trích ly collagen thô: da cá tra loại tạp chất dung dịch LasNa 1% vòng nhiệt độ oC tẩy màu dung dịch H2O2 1% , NaOH 0,01M Sau đó, da cá cắt nhỏ đến kích thước x mm chiết acid acetic 0,75M, tỉ lệ da cá dung dịch acid acetic 1/50, tốc độ khuấy trộn 200rpm, 5oC vòng 24 Dịch chiết sau lọc loại bã không màu, đục, có mùi acid acetic nhẹ, độ nhớt cao, đạm tổng 4,62%, hàm lượng béo chiếm 6,34% hydroxyproline 400,119mg/L Đối với quy trình tinh chế dịch trích ly collagen, luận văn tập trung nghiên cứu giai đoạn: dùng dung dịch NaCl kết tủa thu nhận collagen, thẩm tích loại muối trích ly dung mơi CO2 siêu tới hạn để loại béo Kết collagen sau tinh chế có dạng rắn, màu trắng, mùi mùi acid acetic giảm hẳn Quá trình kết tủa dịch trích ly collagen với nồng độ muối NaCl tối ưu 0,9M, collagen thu có hàm lượng hydroxyproline 37,843mg/g, đạm tổng 94,16%, hàm lượng chất hữu 94,09% Q trình thẩm tích màng cellophane tối ưu oC với tỷ lệ dịch collagen/môi trường đệm acid acetic 0,1M 1/10 (v/v), thay môi trường đệm lần, lần thứ sau 16 giờ, lần thứ hai sau 14 giờ, tốc độ khuấy 120rpm, hàm lượng muối collagen 0,695%, hàm lượng tro chiếm 0,69%, hiệu suất loại muối đạt 97,9% Điều kiện tối ưu q trình trích ly 0,5g collagen/mẻ dung mơi CO2 siêu tới hạn: áp suất 200 bar, nhiệt độ 42oC, lưu lượng 10 g/phút 30 phút, hàm lượng béo lại 0,13%, hiệu suất loại béo đạt 97,27% vi MỤC LỤC TRANG BÌA NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ LỜI CÁM ƠN TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ MỤC LỤC vi DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC BẢNG x DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT xii ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƢƠNG : TỔNG QUAN 1.1 Collagen 1.1.1 Khái quát collagen 1.1.2 Đặc điềm cấu trúc collagen 1.1.2.1 Cấu trúc phân tử collagen 1.1.2.2 Đặc điểm cấu trúc sợi collagen 1.1.3 Tính chất lí hóa collagen 11 1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến collagen 12 1.1.5 Nguyên liệu tách chiết collagen 15 1.1.5.1 Các nguyên liệu tách chiết collagen 15 1.1.5.2 Ưu điểm đặc tính collagen trích ly từ da cá 15 vii 1.1.5.3 Một số đặc điểm da cá 17 1.2 Các phương pháp tinh dịch chiết collagen 20 1.2.1 Phương pháp kết tủa collagen 20 1.2.2 Phương pháp thu nhận tủa collagen 20 1.2.3 Phương pháp thẩm tích 21 1.2.4 Sắc ký 23 1.2.5 Phương pháp tách béo lưu chất siêu tới hạn 24 1.2.6 Làm khô bảo quản chế phẩm collagen 29 1.3 Các nghiên cứu collagen trích ly từ da thuỷ hải sản công bố 30 1.3.1 Các công trình nghiên cứu collagen trích ly từ thuỷ hải sản giới nước ta 30 1.3.2 1.4 Những vấn đề tồn hướng tập trung nghiên cứu giải 41 Nội dung nghiên cứu 45 CHƢƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 46 2.1 Nguyên vật liệu 46 2.1.1 Nguyên liệu 46 2.1.2 Hoá chất 46 2.1.3 Thiết bị 47 2.2 Phương pháp nghiên cứu 47 viii 2.2.1 Phương pháp bảo quản 47 2.2.2 Phương pháp tiền xử lý 47 2.2.3 Phương pháp chiết collagen từ da cá 49 2.2.4 Phương pháp tinh dịch chiết collagen 50 2.2.4.1 Kết tủa collagen 51 2.2.4.2 Thẩm tích loại muối 52 2.2.4.3 Tách béo CO2 siêu tới hạn 54 2.2.5 Phương pháp phân tích sản phẩm collagen 58 2.2.5.1 Phân tích hàm lượng ẩm 58 2.2.5.2 Phân tích hàm lượng chất vô cơ, chất hữu 59 2.2.5.3 Phân tích đạm tổng 60 2.2.5.4 Phân tích hàm lượng chất béo 61 2.2.5.5 Phân tích hàm lượng muối NaCl 62 2.2.5.6 Phân tích hàm lượng hydroxyproline 63 2.2.5.7 Phương pháp sắc kí điện di 68 2.2.5.8 Phương pháp xác định thành phần acid amin 69 2.2.5.9 Phương pháp đo độ nhớt dung dịch collagen 70 2.2.5.10 Xác định cấu trúc bề mặt collagen 71 2.2.5.11 Phổ hồng ngoại IR 71 ix CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .72 3.1 Giai đoạn xử lý da cá 72 3.1.1 Thành phần da cá ban đầu 72 3.1.2 Thành phần da cá sau trình tiền xử lý 73 3.1.2.1 Sau trình tách béo 73 3.1.2.2 Sau trình tẩy màu 74 3.2 Thành phần dịch chiết collagen – acid acetic 75 3.3 Kết khảo sát trình tinh 76 3.3.1 Quá trình kết tủa thu collagen 76 3.3.2 Q trình thẩm tích loại muối 79 3.3.2.1 Chế độ tĩnh 79 3.3.2.2 Thẩm tích động 84 3.3.2.3 So sánh hàm lượng muối lại dịch collagen 90 3.3.3 Độ nhớt nhiệt độ biến tính collagen 91 3.3.4 Quá trình tách béo dung môi siêu tới hạn 94 3.3.4.1 Kết phân tích ANOVA phân tích điện di xét riêng yếu tố 96 3.3.4.2 Kết phân tích ANOVA phân tích điện di mẫu tối ưu 101 3.3.5 Hình ảnh bề mặt cấu trúc collagen 104 3.3.6 Phổ IR 107 x 3.4 Kết collagen sau tinh 109 CHƢƠNG IV : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 112 4.1 Kết luận 112 4.2 Kiến nghị 113 TÀI LIỆU THAM KHẢO .114 PHỤ LỤC 119 10 - 15 -0.64325 4.56797 -* denotes a statistically significant difference Thời gian: Summary Statistics for Hieu suat tach beo% thoi gian Standard deviation Minimum Maximum -30 0.738997 96.7463 97.7914 60 0.821234 97.5277 98.6891 120 0.80391 97.5989 98.7358 -Total 0.758581 96.7463 98.7358 ANOVA Table for Hieu suat tach beo% by thoi gian ANOVA Table for Hieu suat tach beo% by thoi gian Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups Within groups 1.01041 1.86681 0.505207 0.81 0.5226 0.622271 Total (Corr.) 2.87723 Multiple Range Tests for Hieu suat tach beo% by thoi gian -Method: 95.0 percent LSD thoi gian Count Mean Homogeneous Groups -30 97.2689 X 60 98.1084 X 120 98.1673 X -Contrast Difference +/- Limits -30 - 60 -0.83955 2.51045 30 - 120 -0.8985 2.51045 60 - 120 -0.05895 2.51045 -* denotes a statistically significant difference Phụ lục D.3: Kết phân tích điện di : Mẫu collagen chưa tách béo dung môi CO2 siêu tới hạn Các mẫu tách béo CO2 siêu tới hạn điều kiện: 1: 100 bar, 34oC, hàm lượng ethanol 0%, thời gian 30 phút, lưu lượng 10g/ph 2: 100 bar, 42oC, hàm lượng ethanol 0%, thời gian 30 phút, lưu lượng 10g/ph 3: 200 bar, 34oC, hàm lượng ethanol 0%, thời gian 30 phút, lưu lượng 10g/ph 4: 300 bar, 34oC, hàm lượng ethanol 0%, thời gian 30 phút, lưu lượng 10g/ph 5: 100 bar, 34oC, hàm lượng ethanol 5%, thời gian 30 phút, lưu lượng 10g/ph 6: 100 bar, 34oC, hàm lượng ethanol 10%, thời gian 30 phút, lưu lượng 10g/ph 7: 100 bar, 38oC, hàm lượng ethanol 0%, thời gian 30 phút, lưu lượng 10g/ph 8: 100 bar, 34oC, hàm lượng ethanol 0%, thời gian 60 phút, lưu lượng 10g/ph 9: 100 bar, 34oC, hàm lượng ethanol 0%, thời gian 120 phút, lưu lượng 10g/ph 10: 200 bar, 42oC, hàm lượng ethanol 0%, thời gian 30 phút, lưu lượng 5g/ph 11: 200 bar, 42oC, hàm lượng ethanol 0%, thời gian 30 phút, lưu lượng 15g/ph 12: 300 bar, 42oC, hàm lượng ethanol 0%, thời gian 30 phút, lưu lượng 10g/ph 13: 100 bar, 38oC, hàm lượng ethanol 10%, thời gian 30 phút, lưu lượng 10g/ph 14: 200 bar, 42oC, hàm lượng ethanol 5%, thời gian 30 phút, lưu lượng 10g/ph 15: 300 bar, 38oC, hàm lượng ethanol 5%, thời gian 30 phút, lưu lượng 10g/ph PHỤ LỤC E SỐ LIỆU PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ẨM, TRO, CHẤT HỮU CƠ TRONG MẪU COLLAGEN THÀNH PHẨM Số thứ tự mẫu Cốc + nắp(g) Mẫu ƣớt (g) Cốc + nắp + mẫu sau sấy (g) Cốc + nắp + mẫu sau nung (g) mẫu khô (g) lƣợng ẩm (g) % ẩm % ẩm TB Tro (g) % tro/ mẫu ƣớt % tro TB/ mẫu ƣớt % tro/mẫu khô % tro TB/ mẫu khô Chất hữu (g) % chất hữu cơ/ mẫu ƣớt % chất hữu TB/ mẫu ƣớt % chất hữu cơ/ mẫu khô % chất hữu TB/ mẫu khô 335.9969 0.1426 336.1331 335.9980 0.1362 0.0064 4.4881 0.0011 0.7714 0.8076 0.1351 94.7405 99.1924 360.8860 0.1713 361.0480 360.8871 0.1620 0.0093 5.4291 5.2210 0.0011 0.6421 0.6896 0.6790 0.7273 0.1609 93.9288 94.0894 99.3210 99.2727 302.3807 0.1984 302.5677 302.3820 0.1870 0.0114 5.7460 0.0013 0.6552 0.6952 0.1857 93.5988 99.3048 SỐ LIỆU PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG MUỐI TRONG COLLAGEN THÀNH PHẨM NaCl tinh khiết Collagen thành phẩm 3 thứ tự mẫu 0.0985 0.0698 0.1011 m mẫu ƣớt (g) 0.0049 0.0076 0.0068 0.0934 0.0662 0.0958 m mẫu khô (g) Thể tích nƣớc deion hịa tan 20 20 20 50 50 50 mẫu (ml) 20 20 20 20 20 20 Thể tích đem chuẩn độ (ml) Thể tích AgNO3 chuẩn độ 19 29 26 0.1 0.078 0.104 đƣợc (ml) Nồng độ AgNO3 tính đƣợc 0.0453 0.0451 0.0449 (N) 0.0451 Nồng độ AgNO3 TB (N) 0.6696 0.7371 0.6785 % muối ( trọng lƣợng ƣớt) 0.7065 0.7777 0.7159 % muối ( trọng lƣợng khô) 0.6951 % muối TB ( trọng lƣợng ƣớt) 0.7334 % muối TB ( trọng lƣợng khơ) SỐ LIỆU PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG BÉO TRONG COLLAGEN THÀNH PHẨM m bì ƣớt m bì khơ m bì khơ+ mẫu ƣớt m mẫu + bì khơ m mẫu + bì sau chiết béo % béo (khơ) % béo (ƣớt) Hiệu suất loại béo (%) % béo ( mẫu khô) % béo ( mẫu ƣớt) lần 0.7803 0.7267 0.8914 0.8107 0.8106 0.1190 0.0607 97.7914 lần 0.7791 0.7168 0.9539 0.8669 0.8667 0.1332 0.0844 97.5277 0.1261 0.0725 PHỤ LỤC F: PHỤ LỤC F.1: TIÊU CHUẨN COLLAGEN TRÍCH LY TỪ DA BÒ ỨNG DỤNG TRONG THỰC PHẨM CỦA FDA CỦA MỸ (FOOD AND DRUG ADMINISTRATION) PHỤ LỤC F.2 TIÊU CHUẨN COLLAGEN THƢƠNG PHẨM TRÍCH LY TỪ DA CÁ Raw Material Data Sample Of: Sample ID: Lot Size: Date of Manufacture: Date C.O.A.: Shelf Life: Country of Origin: Site of Manufacture: Fish Collagen Powder Appearance: Particle Size: Crude Fat/Oil Protein-Kjeldahl Moisture: Ash: pH: Molecular weight: Arsenic: Lead: Chromium: Bulk Density: Tap Density: Microbiological Standard Plate Count: Coliforms: E Coli: Pseudomonas Salmonella: Staphylococcus Listeria Yeast & Mold: FISH COLLAGEN POWDER FC-082704 SAMPLE SAMPLE SAMPLE TWO YEARS, TO BE KEPT IN TWO CLEAR, TIGHTLY WRAPPED PLASTIC BAGS, IN A COOL DRY ENVIRONMENT UNITED STATES BUFFALO, NY Specification Off White to Amber powder 100 mesh < 2.0 % > 85.0 % < 7.0 % < 2.0 % 5.0 – 6.5 < ppm < ppm < ppm 45 g/cc - g/cc 65 g/cc - g/cc Result Conforms Conforms 0.36 % 89.7 % 4.87 % 1.30 % 5.6 285.000 Dalton Conforms Conforms Conforms 55 g/cc 76 g/cc