Trích ly enzyme bromelain từ thân, lá và trái khóm phế phẩm (ananas comosus)

Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học 2012 CHƯƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay, với phát triển khoa học, công nghệ enzyme trở thành ngành quan trọng có nhiều đóng góp đáng kể vào phát triển chung công nghệ sinh học Việc ứng dụng chế phẩm enzyme ngày trọng nhiều lĩnh vực khác Trong 20 năm cuối kỉ XX năm đầu kỉ XXI enzyme khác ứng dụng Ở Việt Nam bước đầu có nhiều nghiên cứu ứng dụng enzyme chế biến nông sản, thực phẩm, lĩnh vực sản xuất bia, rượu, chế biến tinh bột… Người ta thu nhận enzyme từ nhiều nguồn khác từ thực vật, nội tạng động vật hay vi sinh vật Trong đó, protease nhóm enzyme ứng dụng nhiều lĩnh vực như: nông nghiệp, công nghệ thực phẩm, y học… Bromelain tên gọi chung cho nhóm enzyme thực vật chứa nhóm sulfuhydryl, có khả phân giải protein thu nhận từ họ Bromeliaceae, đặc biệt khóm (thân trái) Bromelain có nhiều tác dụng y học chế biến thực phẩm Trong y học, bromelain sử dụng làm giảm đau nhanh sau phẫu thuật, giảm đau trường hợp viêm khớp, viêm đa khớp, giảm thời gian tan vết bầm tím chống viêm Bromelain có khả chống đơng tụ tiểu cầu, làm giảm nguy đột quỵ bệnh nhân tim mạch, tăng khả hấp thu loại thuốc đặc biệt loại thuốc kháng sinh amoxicilline hay tetracycline kiềm soát phát triển tế bào ung thư (Rabelo et al., 2004) Trong công nghiệp thực phẩm, bromelain sử dụng để làm mềm thịt, thủy phân gan bò, để đơng tụ sữa, phá đục bia, thủy phân protein gluten sản xuất bánh mì làm khối bột nhào mềm dẻo tăng hương chất lượng bánh (Lê Thanh Mai ctv, 2005; Đặng Thị Thu ctv, 2004; Lê Ngọc Tú, 2004) Bromelain có mặt phụ, phế phẩm khóm như: lõi trái, vỏ trái, thân, chồi Phần phụ phế phẩm chiếm tỷ lệ lớn lượng khóm nguyên liệu đưa vào chế biến (khoảng 70%) (Nguyễn Bá Mùi, 2002) Ở Việt Nam, điều kiện khí hậu đất đai thích hợp, khóm phát triển mạnh từ Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học 2012 năm 30 kỉ Đến diện tích trồng khóm ngày tăng, trái thơm ngon trở nên nguồn xuất có giá trị Tuy nhiên, quan tâm đến khóm túy loại nhằm ăn trái Để nâng cao giá trị kinh tế loại cần khẳng định nguồn nguyên liệu protease có khả ứng dụng rộng lớn Vì thế, đề tài “Trích ly enzyme bromelain từ thân, trái khóm phế phẩm (Ananas comosus)” tiến hành 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Tách chiết enzyme bromelain từ thân khóm, khóm trái khóm phế phẩm, nhằm nâng cao giá trị kinh tế, đa dạng hóa sản phẩm từ khóm, góp phần tăng thu nhập cho nơng dân bảo vệ môi trường 1.3 Nội dung nghiên cứu - Thu nhận dịch enzyme bromelain từ phận khóm: thân khóm, khóm trái khóm phế phẩm - Xác định hàm lượng protein hoạt tính enzyme bromelain dịch chiết thơ từ thân khóm, khóm trái khóm phế phẩm So sánh hàm lượng protein hoạt tính enzyme bromelain ba nguyên liệu để lựa chọn nguồn nguyên liệu thích hợp - Ảnh hưởng loại tác nhân kết tủa (acetone, ammonium sulfate ethanol) đến hiệu suất thu hồi enzyme bromelain So sánh, lựa chọn tác nhân kết tủa bromelain thích hợp Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học 2012 CHƯƠNG LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung khóm 2.1.1 Nguồn gốc – phân bố Nguồn gốc khóm từ Nam Mỹ, khu vực tứ giác bao gồm vùng phía Nam Brazil Bắc Argentina nơi người da đỏ xứ tuyển chọn trồng trọt khóm lâu đời Đối với người cựu lục địa lịch sử trồng khóm ngày 4/11/1493 – Christophe Colomb đổ lên đảo Guadeloup phát ăn thử trái khóm đầu tiên, từ trái khóm phổ biến khắp nơi (http://diendan.truongmo.com, ngày truy cập 10/12/2011) Tại Việt Nam: Diện tích gieo trồng Năm 1976: 16.800 Năm 1990: 44.000 Năm 1995: 24.037 Năm 1998: 40.000 (Trần Thế Tục, 2002) Sản lượng: Năm 1990: 467.851 (trong miền Nam chiếm sản lượng 424.326 tấn) Năm 2007: 529.100 Tiền Giang tỉnh có sản lượng khóm đứng đầu nước (161.300 tấn) (Trần Thế Tục, 2002) Năng suất: Miền Nam: 144 tạ/ha Miền Bắc: 46 tạ/ha (http://diendan.truongmo.com, ngày truy cập 10/12/2011) Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học 2012 2.1.2 Đặc điểm thực vật khóm Khóm loại ăn trái nhiệt đới có tên khoa học Ananas comosus thuộc họ Bromeliaceae Trong họ có nhiều khí sinh (sống khơng khí), có rễ khí sinh, dễ dàng hút sương, mưa nhỏ chất hòa tan Một số đặc điểm sinh học khóm: a Rễ Khóm có rễ chùm mọc cạn Ở khóm trưởng thành, rễ phát triển yếu có khuynh hướng mọc ngang mọc sâu Khoảng 80% số rễ mọc tầng đất mặt khoảng 15-20cm Rễ khóm phân nhánh liên tục ăn lan cách gốc 1m có đến 2m, điều kiện mơi trường thích hợp b Thân Thân khóm lúc trồng khoảng vài cm, thu hoạch thân mọc dài 20-30cm, thay đổi tùy giống, tùy loại trồng tùy điều kiện canh tác chăm sóc Nếu bốc hết cắt rễ phụ, thân khóm có dạng hình chùy ngắn c Lá Chiếm 70% trọng lượng tồn Lá khóm dài hay ngắn, rộng hay hẹp màu sắc thay đổi tùy theo giống tùy điều kiện ngoại cảnh Trên khóm, bìa phiến có gai hay khơng gai, gai nhiều hay gai tùy giống Trừ non ngọn, trưởng thành già phía có hình máng xối Lòng máng xối ngồi tác dụng hứng nước giúp cho cứng d Hoa Phát hoa khóm hoa kép trung bình có khoảng 100-150 hoa, phát hoa hoa khóm nở theo thứ tự từ lên trên, sau 15-20 ngày hoa nở xong Trên phát hoa hoa xếp quanh trục theo đường xoắn ốc Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học 2012 e Trái Sau hoa thụ tinh, hoa trục phát hoa trở thành mắt trái khóm Như trái khóm phương diện thực vật trái kép mắt khóm trái đơn f Hạt Hoa khóm có đặc điểm giao phấn loại giống không thụ tinh bầu nỗn bị thối hóa nhanh nên trái khóm thơng thường khơng có có hạt cách giao phấn chéo giống khóm khác hoa khóm thụ tinh hình thành hạt nhỏ mắt khóm Hạt khóm nhỏ có dạng hình trứng nhọn đầu, trung bình dài 3-5mm, ngang 1-2mm, có lớp vỏ dày cứng bên ngồi, lớp phơi nhũ bên cứng nên hạt khóm cứng đá, khơng xử lí trước gieo khó mầm (Nguyễn Cơng Khanh ctv, 1989) 2.1.3 Phân loại Khóm có tất khoảng 60-70 giống, gộp chung thành ba nhóm chính: a Nhóm Hồng Hậu (Queen) Hình 2.1 Khóm Queen (www.hadico.net/ /nongnghiep40VN.aspx, ngày truy cập 10/12/2011) Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học 2012 Tán xòe tương đối rộng, ngắn hẹp có nhiều gai gai cong dạng móc câu, chân màu hồng đỏ, có nhiều chồi nách Thịt trái vàng đậm, giòn, hương khóm, vị chua đậm đà Nhóm có chất lượng cao nhất, giới thường dùng để ăn tươi xuất Dứa hoa, dứa tây, dứa Victoria, khóm thuộc nhóm này, nhóm trồng nhiều ba nhóm Việt Nam b Nhóm Tây Ban Nha (Spanish) Hình 2.2 Khóm Spanish (http://a8.vietbao.vn, ngày truy cập 10/12/2011) Tán hẹp, dài hẹp thường có gai có giống khơng có, chân màu lục đỏ, có vài chồi nách Trái lớn khóm Queen, mắt to sâu Thịt trái màu vàng nhạt, có chỗ trắng, vị chua Khóm ta, khóm mật thuộc nhóm Nhóm có chất lượng nhất, trồng lâu đời tập trung khu vực Liễn Sơn (Tam Dương, Vĩnh Phú) Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học 2012 c Nhóm Caien (Cayenne) Hình 2.3 Khóm Cayenne (www.khuyennongtphcm.com, ngày truy cập 10/12/2011) Tán xòe tương đối rộng, tương đối ngắn rộng, có gai lá, chân màu lục nhạt, có vài chồi nách Trái lớn nhất, mắt phẳng nông Thịt trái vàng, nhiều nước, khóm Queen Khóm độc bình, khóm tây thuộc nhóm Vì phù hợp với chế biến cơng nghiệp, nhóm Caien trồng hầu hết vùng dứa lớn giới (Thái Lan, Hawaii, Philippine….), lại thấy Việt Nam (http://diendan.truongmo.com, ngày truy cập 10/12/2011) 2.1.4 Một số ứng dụng Trong nước khóm có 12-15% đường, 0,5-0,8% acid Cứ 100 g nước khóm có 8,5 mg vitamin C, 0,3 mg Caroten, vitamin B1, B2, PP… Trong nước khóm có enzyme bromelain gồm nhiều enzyme phân giải protein có tác dụng kích thích tiêu hóa (http://diendan.truongmo.com, ngày truy cập 10/12/2011) Trái khóm ngồi sử dụng để ăn tươi dùng làm nguyên liệu chế biến đồ hộp, mứt khóm, kẹo khóm, rượu vang, nước giải khát, điều chế acid citric enzyme bromelain Luận văn tốt nghiệp chun ngành Sinh học 2012 Hình 2.4 Khóm khoang đóng hộp (http://www.phiasiaholdings.com, ngày truy cập 10/12/2011) Hình 2.5 Nước khóm (http://img-m.24hstatic.com, ngày truy cập 10/12/2011) Cứ khóm sau ép nước, lại bã chế biến 30 kg thức ăn khô cho gia súc Bã khóm sau 1năm ủ chứa 1,27% đạm, 0,08% kali, 0,18% canxi, dùng làm phân bón tốt Sau thu hoạch, toàn thân chồi (khoảng 60 tấn/ha) đưa vào nhà máy nghiền bột, ép thành (đạt khoảng 12 Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học 2012 tấn/ha) dùng làm thức ăn gia súc (http://diendan.truongmo.com, ngày truy cập 10/12/2011) 2.1.5 Nguồn phế phụ phẩm khóm Phế phụ phẩm khóm bao gồm chồi khóm, vỏ cứng ngồi, vụn nát q trình chế biến khóm, bã khóm ép tồn khóm phá trồng Hàng năm loại phế phụ phẩm nơng trường khóm sở chế biến khóm lớn Ước tính 1ha khóm phá để trồng lại sau vụ thu để lại 50 khóm; khóm đưa vào chế biến theo quy trình chế biến khóm đơng lạnh cho 0,25 phẩm 0,75 phụ phẩm, tức kg khóm nguyên liệu cho 1kg thành phẩm; khóm đưa vào chế biến theo quy trình đóng hộp 0,35 phẩm 0,65 phụ phẩm (http://www.dostbinhdinh.org.vn, ngày truy cập 10/12/2011) Bảng 2.1 Sản lượng thành phẩm phụ phẩm khóm nhà máy chế biến phía Bắc Năm Chỉ tiêu 1998 1999 2000 Sản lượng khóm (tấn) 5518.0 7033.0 16300.0 Thành phẩm khóm (tấn) 1682.9 2109.0 4808.5 Phụ phẩm khóm (tấn) 3835.1 4923.1 11491.5 - Chồi (tấn) 1655.4 2145.1 4890.4 - Bã khóm (tấn) 2179.7 2778.0 6601.5 2.28 2.33 2.38 Trong đó: Tỷ lệ phụ phẩm/chính phẩm (lần) Nguồn: Nguyễn Bá Mùi, 2002 Phụ phẩm khóm có hàm lượng chất xơ cao, nghèo protein nên sử dụng làm thức ăn cho trâu bò với tỷ lệ thích hợp Bên cạnh đó, phụ phẩm khóm có hàm lượng đường dễ tan cao, thuận lợi cho trình lên men nên ủ chua làm thức ăn để thay phần thức ăn thô phần ăn gia súc Như vậy, việc tận dụng nguồn phụ phẩm từ nhà máy Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học 2012 chế biến có ý nghĩa lớn việc bảo vệ môi trường, nâng cao hiệu kinh tế Hơn nữa, enzyme bromelain thu từ phế phụ phẩm có ý nghĩa lớn nhiều ngành cơng nghiệp (http://www.dostbinhdinh.org.vn, ngày truy cập 10/12/2011) 2.2 Giới thiệu enzyme bromelain 2.2.1 Khái niệm enzyme Trong thể sống (các tế bào) luôn xảy trình trao đổi chất Sự trao đổi chất ngừng sống khơng tồn Q trình trao đổi chất tập hợp quy luật nhiều phản ứng hóa học khác Các phản ứng hóa học phức tạp có liên quan chặt chẻ với điều hòa lẫn (http://d.violet.vn, ngày truy cập 09/12/2011) Enzyme chất xúc tác sinh học có chất protein có tính đặc hiệu cao Mỗi enzyme có khả xúc tác cho phản ứng định Hoạt tính enzyme mạnh lượng chất chuyển hóa lượng sản phẩm tạo thành đơn vị thời gian lớn Vì đánh giá hoạt tính enzyme cách xác định tốc độ chuyển hóa chất tốc độ tích lũy sản phẩm phản ứng (Nguyễn Hoài Hương, 2009) 2.2.2 Đặc điểm chung enzyme bromelain  Bromelain trái E.C.3.4.22.33  Bromelain thân E.C 3.4.22.32  Tên gọi khác : bromelin, bromeline  Tên khoa học y học : sulfuhydryl proteolytic enzyme, cysteine protease  Tên thương mại : Bromanase (Kramer – Novis) Bromelain 2400 maximum Strength (Vitalize Corp) Enzyme Bromelain tên gọi chung cho nhóm enzyme thực vật chứa nhóm sulfuhydryl, có khả phân giải protein thu nhận từ họ Bromeliaceae, đặc biệt khóm (thân trái) 10 Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học 2012 2.3 So sánh ảnh hưởng ba tác nhân kết tủa đến hiệu suất thu hồi chi phí sản xuất Hoạt tính tổng (IU) Source Nhân tố kết tủa Error Total S = 561.1 DF SS MS F P 2492278 1246139 3.96 0.080 1889109 314851 4381387 R-Sq = 56.88% R-Sq(adj) = 42.51% Level N Mean StDev Aceton 14298 390 Amomnium sulphate 13350 445 Ethanol 14580 771 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ -( -* -) ( -* -) ( -* -) -+ -+ -+ -+ -12800 13600 14400 15200 Pooled StDev = 561 Grouping Information Using Fisher Method Nhân tố kết tủa N Mean Grouping Ethanol 14580.3 A Aceton 14298.3 A B Amomnium sulphate 13350.0 B Means that not share a letter are significantly different Fisher 95% Individual Confidence Intervals All Pairwise Comparisons among Levels of Nhân tố kết tủa Simultaneous confidence level = 89.08% Nhân tố kết tủa = Aceton subtracted from: Nhân tố kết tủa Lower Center Upper Amomnium sulphate -2069.3 -948.2 172.8 Ethanol -839.0 282.0 1403.1 Nhân tố kết tủa Amomnium sulphate Ethanol + -+ -+ -+ ( * ) ( * -) + -+ -+ -+ -2400 -1200 1200 Nhân tố kết tủa = Amomnium sulphate subtracted from: Nhân tố kết tủa Lower Center Upper Ethanol 109.2 1230.3 2351.3 + -+ -+ -+ ( * -) + -+ -+ -+ -2400 -1200 1200 24 Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học 2012 Kết thống kê cho thấy hoạt tính tổng ba tác nhân kết tủa khơng khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê mức độ 5% (p = 0.08 > 0.05) Kết so sánh (Fisher) cho thấy hoạt tính tổng ammonium sulfate (13.350 IU) gần acetone (14.298,3 IU) hoạt tính tổng acetone gần với ethanol (14.580,3 IU) 16000 14.580,3A 14.298,3AB 14000 13.350B Hoạttínhtổng(IU) 12000 10000 8000 6000 4000 2000 Acetone Amomnium sulphate Tác nhân kết tủa Ethanol Hình 2.3.1 Hoạt tính tổng Hàm lượng protein tổng số (mg) Source Nhân tố kết tủa Error Total S = 19.80 DF SS MS F 6960 3480 8.88 0.016 2351 392 9311 R-Sq = 74.75% P R-Sq(adj) = 66.33% Level N Mean StDev Aceton 990.0 9.8 Amomnium sulphate 1057.9 32.4 Ethanol 1019.1 5.1 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ -( -* -) ( -* -) ( -* -) -+ -+ -+ -+ -980 1015 1050 1085 Pooled StDev = 19.8 25 Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học Grouping Information Using Fisher Method Nhân tố kết tủa N Mean Grouping Amomnium sulphate 1057.88 A Ethanol 1019.14 A B Aceton 990.00 B Means that not share a letter are significantly different Fisher 95% Individual Confidence Intervals All Pairwise Comparisons among Levels of Nhân tố kết tủa Simultaneous confidence level = 89.08% Nhân tố kết tủa = Aceton subtracted from: Nhân tố kết tủa Amomnium sulphate Ethanol Lower Center Upper 28.34 67.89 107.44 -10.41 29.14 68.69 Nhân tố kết tủa Amomnium sulphate Ethanol + -+ -+ -+ ( -* ) ( -* -) + -+ -+ -+ -50 50 100 Nhân tố kết tủa = Amomnium sulphate subtracted from: Nhân tố kết tủa Lower Center Upper + -+ -+ -+ Ethanol -78.30 -38.75 0.80 ( -* -) + -+ -+ -+ -50 50 100 Kết thống kê cho thấy hàm lượng protein tổng ba tác nhân kết tủa khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê mức độ 5% (p = 0.016 < 0.05) Kết so sánh (Fisher) cho thấy hàm lượng protein tổng acetone (990 mg) gần ethanol (1.019,14 mg) hàm lượng protein tổng ethanol gần với ammonium sulfate (1.057,88 mg) Hoạt tính riêng (IU/mg) Source Nhân tố kết tủa Error Total S = 0.5436 DF SS MS F P 6.247 3.123 10.57 0.011 1.773 0.296 8.020 R-Sq = 77.89% R-Sq(adj) = 70.52% Level N Mean StDev Aceton 14.463 0.323 Amomnium sulphate 12.630 0.505 Ethanol 14.323 0.726 Level Aceton Amomnium sulphate Ethanol Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ -( -* ) ( * -) ( * -) -+ -+ -+ -+ -12.0 13.0 14.0 15.0 Pooled StDev = 0.544 26 2012 Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học 2012 Grouping Information Using Fisher Method Nhân tố kết tủa N Mean Grouping Aceton 14.4626 A Ethanol 14.3228 A Amomnium sulphate 12.6296 B Means that not share a letter are significantly different Fisher 95% Individual Confidence Intervals All Pairwise Comparisons among Levels of Nhân tố kết tủa Simultaneous confidence level = 89.08% Nhân tố kết tủa = Aceton subtracted from: Nhân tố kết tủa Lower Center Upper Amomnium sulphate -2.9192 -1.8331 -0.7469 Ethanol -1.2259 -0.1398 0.9463 Nhân tố kết tủa -+ -+ -+ -+ Amomnium sulphate ( * ) Ethanol ( * ) -+ -+ -+ -+ -1.5 0.0 1.5 3.0 Nhân tố kết tủa = Amomnium sulphate subtracted from: Nhân tố kết tủa Lower Center Upper -+ -+ -+ -+ Ethanol 0.6072 1.6933 2.7794 ( * -) -+ -+ -+ -+ -1.5 0.0 1.5 3.0 Kết thống kê cho thấy hoạt tính riêng ba tác nhân kết tủa khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê mức độ 5% (p = 0.011 > 0.05) Kết so sánh (Fisher) cho thấy hoạt tính riêng acetone (14,4626 IU/mg) gần ethanol (14,3228 IU/mg) hoạt tính riêng ammonium sulfate (12,6296 IU/mg) thấp 27 Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học 2012 16 14,4626A 14,3228A 14 12,6296B Hoạttínhriêng(IU/mg) 12 10 Acetone Amomnium sulphate Tác nhân kết tủa Ethanol Hình 2.3.2 Hoạt tính riêng Hoạt tính bột enzyme (IU/g) Source Nhân tố kết tủa Error Total S = 103.5 DF SS MS F 5888033 2944016 274.81 0.000 64278 10713 5952311 R-Sq = 98.92% P R-Sq(adj) = 98.56% Level N Mean StDev Aceton 3146.6 44.7 Amomnium sulphate 1265.6 2.4 Ethanol 2744.9 173.6 Level Aceton Amomnium sulphate Ethanol Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ -(-* ) (-* ) ( *-) -+ -+ -+ -+ -1200 1800 2400 3000 Pooled StDev = 103.5 Grouping Information Using Fisher Method Nhân tố kết tủa N Mean Grouping Aceton 3146.6 A Ethanol 2744.9 B Amomnium sulphate 1265.6 C Means that not share a letter are significantly different 28 Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học 2012 Fisher 95% Individual Confidence Intervals All Pairwise Comparisons among Levels of Nhân tố kết tủa Simultaneous confidence level = 89.08% Nhân tố kết tủa = Aceton subtracted from: Nhân tố kết tủa Lower Center Upper Amomnium sulphate -2087.8 -1881.0 -1674.2 Ethanol -608.4 -401.6 -194.8 Nhân tố kết tủa Amomnium sulphate Ethanol -+ -+ -+ -+ -(-*-) (-*-) -+ -+ -+ -+ 2000 -1000 1000 Nhân tố kết tủa = Amomnium sulphate subtracted from: Nhân tố kết tủa Lower Center Upper Ethanol 1272.6 1479.4 1686.2 -+ -+ -+ -+ -(-*-) -+ -+ -+ -+ 2000 -1000 1000 Kết thống kê cho thấy hoạt tính bột enzyme ba tác nhân kết tủa không khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê mức độ 5% (p = 0.000