Trích ly enzyme bromelain từ thân, lá và trái khóm phế phẩm (ananas comosus)

Trong công nghiệp thực phẩm, bromelain được sử dụng để làm mềm thịt, thủy phân gan bò, để đông tụ sữa, phá đục bia, thủy phân protein gluten trong sản xuất bánh mì làm khối bột nhào mềm

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học, công nghệ enzyme đã trở thành một ngành quan trọng và có nhiều đóng góp đáng kể vào sự phát triển chung của công nghệ sinh học Việc ứng dụng chế phẩm enzyme ngày càng được chú trọng ở nhiều lĩnh vực khác nhau Trong 20 năm cuối thế kỉ XX và các năm đầu của thế kỉ XXI các enzyme khác nhau đã được ứng dụng Ở Việt Nam bước đầu đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng các enzyme trong chế biến nông sản, thực phẩm, nhất là trong lĩnh vực sản xuất bia, rượu, chế biến tinh bột… Người ta có thể thu nhận enzyme từ nhiều nguồn khác nhau như từ thực vật, nội tạng động vật hay vi sinh vật Trong đó, protease là nhóm enzyme được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: nông nghiệp, công nghệ thực phẩm, y học…

Bromelain là tên gọi chung cho nhóm enzyme thực vật chứa nhóm sulfuhydryl, có khả năng phân giải protein được thu nhận từ họ Bromeliaceae, đặc biệt là ở cây khóm (thân và trái) Bromelain có nhiều tác dụng trong y học và trong chế biến thực phẩm Trong y học, bromelain được sử dụng làm giảm đau nhanh sau phẫu thuật, giảm đau đối với các trường hợp viêm khớp, viêm đa khớp, giảm thời gian tan các vết bầm tím và chống viêm Bromelain còn có khả năng chống đông tụ các tiểu cầu, làm giảm nguy cơ đột quỵ đối với các bệnh nhân tim mạch, tăng khả năng hấp thu các loại thuốc đặc biệt là loại thuốc kháng sinh như amoxicilline hay tetracycline và kiềm soát sự phát triển của các tế bào ung thư (Rabelo et al., 2004) Trong công nghiệp thực phẩm, bromelain được sử dụng để làm mềm thịt, thủy phân gan bò, để đông tụ sữa, phá đục bia, thủy phân protein gluten trong sản xuất bánh mì làm khối bột nhào mềm dẻo hơn tăng hương và chất lượng bánh (Lê Thanh Mai và ctv, 2005; Đặng Thị Thu và ctv, 2004; Lê Ngọc Tú, 2004)

Bromelain có mặt trong phụ, phế phẩm của khóm như: lõi trái, vỏ trái, thân, chồi và lá Phần phụ phế phẩm này chiếm một tỷ lệ lớn của lượng khóm nguyên liệu đưa vào chế biến (khoảng 70%) (Nguyễn Bá Mùi, 2002) Ở Việt Nam, do điều kiện khí hậu và đất đai thích hợp, cây khóm đã được phát triển mạnh từ

những năm 30 của thế kỉ này Đến nay diện tích trồng khóm ngày một tăng, trái thơm ngon trở nên nguồn xuất khẩu có giá trị Tuy nhiên, sự quan tâm đến cây khóm mới chỉ thuần túy như một loại cây nhằm ăn trái Để nâng cao giá trị kinh

tế của loại cây này cần khẳng định nó như một nguồn nguyên liệu protease có khả năng ứng dụng rộng lớn Vì thế, đề tài “Trích ly enzyme bromelain từ thân, lá và trái khóm phế phẩm (Ananas comosus)” được tiến hành

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Tách chiết enzyme bromelain từ thân khóm, lá khóm và trái khóm phếphẩm, nhằm nâng cao giá trị kinh tế, đa dạng hóa sản phẩm từ cây khóm, góp phần tăng thu nhập cho nông dân và bảo vệ môi trường

1.3 Nội dung nghiên cứu

- Thu nhận dịch enzyme bromelain từ các bộ phận của cây khóm: thân khóm, lá khóm và trái khóm phế phẩm

- Xác định hàm lượng protein và hoạt tính enzyme bromelain dịch chiết thô

từ thân khóm, lá khóm và trái khóm phế phẩm So sánh hàm lượng protein và hoạt tính enzyme bromelain giữa ba nguyên liệu để lựa chọn nguồn nguyên liệu thích hợp

- Ảnh hưởng loại tác nhân kết tủa (acetone, ammonium sulfate và ethanol) đến hiệu suất thu hồi enzyme bromelain So sánh, lựa chọn tác nhân kết tủa bromelain thích hợp

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về cây khóm

2.1.1 Nguồn gốc – phân bố

Nguồn gốc cây khóm là từ Nam Mỹ, trong khu vực tứ giác bao gồm vùng phía Nam Brazil và Bắc Argentina nơi người da đỏ bản xứ đã tuyển chọn và trồng trọt khóm lâu đời Đối với những người ở cựu lục địa thì lịch sử trồng khóm bắt đầu từ ngày 4/11/1493 – khi Christophe Colomb đổ bộ lên đảo Guadeloup đã phát hiện và ăn thử trái khóm đầu tiên, từ đó trái khóm được phổ biến khắp nơi. (http://diendan.truongmo.com, ngày truy cập 10/12/2011)

Tại Việt Nam:

Diện tích gieo trồng Năm 1976: 16.800 ha Năm 1990: 44.000 ha Năm 1995: 24.037 ha Năm 1998: 40.000 ha (Trần Thế Tục, 2002)

Miền Nam: 144 tạ/ha Miền Bắc: 46 tạ/ha

(http://diendan.truongmo.com, ngày truy cập 10/12/2011)

2.1.2 Đặc điểm thực vật của cây khóm

Khóm là loại cây ăn trái nhiệt đới có tên khoa học là Ananas comosus thuộc

họ Bromeliaceae Trong họ có nhiều cây khí sinh (sống trong không khí), có rễ khí sinh, dễ dàng hút sương, mưa nhỏ và các chất hòa tan trong đó Một số đặc điểm sinh học của khóm:

a Rễ

Khóm chỉ có rễ chùm mọc cạn Ở khóm trưởng thành, rễ phát triển yếu và

có khuynh hướng mọc ngang hơn là mọc sâu Khoảng 80% số rễ mọc ở tầng đất mặt khoảng 15-20cm Rễ khóm có thể phân nhánh liên tục ăn lan cách gốc 1m có khi đến 2m, nếu điều kiện môi trường thích hợp

b Thân

Thân khóm lúc mới trồng chỉ khoảng vài cm, nhưng khi thu hoạch thân có thể mọc dài 20-30cm, thay đổi tùy giống, tùy loại con trồng và tùy điều kiện canh tác và chăm sóc Nếu bốc hết lá và cắt sạch các rễ phụ, thân khóm có dạng một hình chùy ngắn

c Lá

Chiếm hơn 70% trọng lượng của toàn cây Lá khóm có thể dài hay ngắn, rộng hay hẹp và màu sắc lá cũng thay đổi tùy theo giống và tùy điều kiện ngoại cảnh Trên lá khóm, bìa phiến lá có gai hay không gai, gai nhiều hay gai ít tùy giống Trừ các lá non ở ngọn, các lá trưởng thành và lá già phía dưới đều có hình máng xối Lòng máng xối ngoài tác dụng hứng nước còn giúp cho lá cứng

d Hoa

Phát hoa khóm là một hoa kép trung bình có khoảng 100-150 hoa, trên cùng một phát hoa các hoa khóm nở theo thứ tự từ dưới lên trên, và sau 15-20 ngày các hoa mới nở xong Trên một phát hoa các hoa xếp quanh trục chính theo những đường xoắn ốc

e Trái

Sau khi hoa thụ tinh, mỗi hoa trên trục phát hoa sẽ trở thành một mắt trên trái khóm Như vậy trái khóm về phương diện thực vật là một trái kép và mỗi mắt khóm là một trái đơn

có lớp vỏ dày rất cứng ở bên ngoài, lớp phôi nhũ bên trong cũng cứng nên hạt khóm cứng như đá, nếu không xử lí trước khi gieo thì rất khó nẫy mầm.(Nguyễn Công Khanh và ctv, 1989)

Tán cây xòe tương đối rộng, lá ngắn và hẹp có rất nhiều gai và gai cong dạng móc câu, chân lá màu hồng hơi đỏ, có rất nhiều chồi nách Thịt trái vàng đậm, giòn, hương khóm, vị chua ngọt đậm đà Nhóm này có chất lượng cao nhất, trên thế giới thường được dùng để ăn tươi và xuất khẩu Dứa hoa, dứa tây, dứa Victoria, khóm cũng thuộc nhóm này, nhóm này được trồng nhiều nhất trong ba nhóm ở Việt Nam

b Nhóm Tây Ban Nha (Spanish)

Hình 2.2 Khóm Spanish

(http://a8.vietbao.vn, ngày truy cập 10/12/2011)

Tán cây hẹp, lá dài và hẹp thường có gai cũng có giống không có, chân lá màu lục hơi đỏ, có vài chồi nách Trái lớn hơn khóm Queen, mắt to và sâu Thịt trái màu vàng nhạt, có chỗ trắng, vị chua Khóm ta, khóm mật thuộc nhóm này Nhóm này có chất lượng kém nhất, được trồng lâu đời và tập trung ở khu vực Liễn Sơn (Tam Dương, Vĩnh Phú)

c Nhóm Caien (Cayenne)

Hình 2.3 Khóm Cayenne

(www.khuyennongtphcm.com, ngày truy cập 10/12/2011)

Tán cây xòe tương đối rộng, lá tương đối ngắn và rộng, chỉ có gai ở ngọn

lá, chân lá màu lục nhạt, có vài chồi nách Trái lớn nhất, mắt phẳng và nông Thịt trái kém vàng, nhiều nước, ít ngọt hơn khóm Queen Khóm độc bình, khóm tây thuộc nhóm này Vì phù hợp với chế biến công nghiệp, nhóm Caien được trồng hầu hết các vùng dứa lớn trên thế giới (Thái Lan, Hawaii, Philippine….), nhưng lại rất ít thấy ở Việt Nam

(http://diendan.truongmo.com, ngày truy cập 10/12/2011)

2.1.4 Một số ứng dụng

Trong nước khóm có 12-15% đường, 0,5-0,8% acid Cứ 100 g nước khóm

có 8,5 mg vitamin C, 0,3 mg Caroten, một ít vitamin B1, B2, PP… Trong nước khóm còn có enzyme bromelain gồm nhiều enzyme phân giải protein có tác dụng kích thích tiêu hóa

(http://diendan.truongmo.com, ngày truy cập 10/12/2011)

Trái khóm ngoài sử dụng để ăn tươi còn dùng làm nguyên liệu chế biến đồ hộp, mứt khóm, kẹo khóm, rượu vang, nước giải khát, điều chế acid citric và enzyme bromelain

Hình 2.4 Khóm khoang đóng hộp

(http://www.phiasiaholdings.com, ngày truy cập 10/12/2011)

Hình 2.5 Nước khóm

(http://img-m.24hstatic.com, ngày truy cập 10/12/2011)

Cứ 1 tấn quả khóm sau khi ép nước, còn lại bã chế biến ra được 30 kg thức

ăn khô cho gia súc Bã khóm sau 1năm ủ chứa 1,27% đạm, 0,08% kali, 0,18%

canxi, dùng làm phân bón rất tốt Sau khi thu hoạch, toàn bộ thân lá và chồi (khoảng 60 tấn/ha) đưa vào nhà máy nghiền bột, ép thành tấm (đạt khoảng 12

tấn/ha) dùng làm thức ăn gia súc. (http://diendan.truongmo.com, ngày truy cập 10/12/2011)

2.1.5 Nguồn phế phụ phẩm khóm

Phế phụ phẩm khóm bao gồm chồi ngọn của quả khóm, vỏ cứng ngoài, những vụn nát trong quá trình chế biến khóm, bã khóm ép và toàn bộ lá của cây khóm phá đi trồng mới Hàng năm các loại phế phụ phẩm này ở các nông trường khóm và các cơ sở chế biến khóm rất lớn Ước tính 1ha khóm phá đi để trồng lại sau 2 vụ thu quả sẽ để lại 50 tấn lá khóm; 1 tấn khóm đưa vào chế biến theo quy trình chế biến khóm đông lạnh cho 0,25 tấn chính phẩm và 0,75 tấn phụ phẩm, tức là cứ 4 kg khóm nguyên liệu cho 1kg thành phẩm; 1 tấn khóm đưa vào chế biến theo quy trình đóng hộp được 0,35 tấn chính phẩm và 0,65 tấn phụ phẩm

(http://www.dostbinhdinh.org.vn, ngày truy cập 10/12/2011).

Bảng 2.1 Sản lượng thành phẩm và phụ phẩm cả quả khóm tại các nhà máy chế biến ở phía Bắc

Nguồn: Nguyễn Bá Mùi, 2002

Phụ phẩm khóm có hàm lượng chất xơ cao, nghèo protein nên có thể sử dụng làm thức ăn cho trâu bò với tỷ lệ thích hợp Bên cạnh đó, phụ phẩm khóm

có hàm lượng đường dễ tan cao, thuận lợi cho quá trình lên men nên có thể ủ chua làm thức ăn để thay thế một phần thức ăn thô trong khẩu phần ăn của gia súc Như vậy, việc chúng ta tận dụng được nguồn phụ phẩm này từ các nhà máy

Sản lượng quả khóm (tấn) Thành phẩm khóm (tấn) Phụ phẩm khóm (tấn) Trong đó:

- Chồi ngọn (tấn)

- Bã khóm (tấn)

Tỷ lệ phụ phẩm/chính phẩm (lần)

5518.0 1682.9 3835.1

1655.4 2179.7 2.28

7033.0 2109.0 4923.1

2145.1 2778.0 2.33

16300.0 4808.5 11491.5

4890.4 6601.5 2.38

chế biến sẽ có ý nghĩa rất lớn trong việc bảo vệ môi trường, nâng cao hiệu quả kinh tế Hơn thế nữa, enzyme bromelain thu được từ phế phụ phẩm có ý nghĩa rất lớn trong nhiều ngành công nghiệp hiện nay

(http://www.dostbinhdinh.org.vn, ngày truy cập 10/12/2011)

2.2 Giới thiệu về enzyme bromelain

2.2.1 Khái niệm về enzyme

Trong cơ thể sống (các tế bào) luôn luôn xảy ra các quá trình trao đổi chất

Sự trao đổi chất ngừng thì sự sống không còn tồn tại Quá trình trao đổi của một chất là tập hợp các quy luật của rất nhiều các phản ứng hóa học khác nhau Các phản ứng hóa học phức tạp này có liên quan chặt chẻ với nhau và điều hòa lẫn nhau. (http://d.violet.vn, ngày truy cập 09/12/2011)

Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein và có tính đặc hiệu cao Mỗi enzyme có khả năng xúc tác cho một hoặc một số phản ứng nhất định Hoạt tính của enzyme càng mạnh thì lượng cơ chất được chuyển hóa hoặc lượng sản phẩm tạo thành trên một đơn vị thời gian càng lớn Vì vậy có thể đánh giá hoạt tính của enzyme bằng cách xác định tốc độ chuyển hóa cơ chất hoặc tốc độ tích lũy sản phẩm phản ứng (Nguyễn Hoài Hương, 2009)

2.2.2 Đặc điểm chung về enzyme bromelain

 Bromelain trái là E.C.3.4.22.33

 Bromelain thân là E.C 3.4.22.32

 Tên gọi khác : bromelin, bromeline

 Tên khoa học và y học : sulfuhydryl proteolytic enzyme, cysteine protease

 Tên thương mại : Bromanase (Kramer – Novis) Bromelain 2400 maximum Strength (Vitalize Corp)

Enzyme Bromelain là tên gọi chung cho nhóm enzyme thực vật chứa nhóm sulfuhydryl, có khả năng phân giải protein được thu nhận từ họ Bromeliaceae, đặc biệt là ở cây khóm (thân và trái)

(http://www.scielo.br.com, ngày truy cập 10/12/2011)

Bromelain chiếm 50% protein trong trái khóm Tùy theo nguồn thu nhận

mà người ta phân biệt bromelain thân hay bromelain trái Bromelain thân là nhóm enzyme có giá trị kinh tế Nó có khả năng thủy phân khá mạnh và hoạt động tốt ở pH từ 6-8 Bromelain có hoạt tính xúc tác sự phân giải protein tương

tự như papain trong mủ đu đủ hay ficin trong cây thuộc họ Sung Enzyme bromelain có trọng lượng phân tử khoảng 33.000 Da, lớn gấp 1,5 lần papain

Thịt trái khóm chỉ có hoạt tính enzyme bromelain kể từ 3 tháng trước khi chín, trong đó hoạt tính bromelain cao nhất là khoảng 20 ngày trước khi chín

Khi trái chín, hoạt tính bromelain giảm xuống nhưng không mất hẳn (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.2.3 Tính chất của enzyme bromelain

Thành phần chủ yếu của bromelain có chứa nhóm sulfhydryl thủy giải protein Trong dịch chiết bromelain còn có chứa một ít peroxydase, phophatase acid và chất ức chế protease

Dịch chiết bromelain toàn phần có hoạt động trong khoảng pH 4,5-9,8 Bromelain được chiết tách từ các phần khác nhau trên cây khóm và bromelain từ các nguồn khác nhau sẽ có hoạt động sinh lý khác nhau nhưng hoạt tính thủy phân protein thì giống nhau Bromelain không ổn định với nhiệt độ do đó các hoạt động sinh lý của nó sẽ giảm đi nếu quá trình chiết tách hay điều kiện bảo quản không thích hợp

Bromelain có thể thấm qua dạ dày và ruột của động vật Nồng độ cao nhất của bromelain được tìm thấy trong máu sau khi ăn một giờ, tuy nhiên hoạt động thủy phân protein của nó bị bất hoạt nhanh chóng có lẽ là do tác động của các protease nội sinh và yếu tố α-2-macroglobuline của huyết thanh

2.2.4 Cấu tạo hóa học

Bromelain thân là một protease nhưng nó khác với các protease thực vật khác như papain, ficin ở chổ nó là một glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm

3 manose, 2 glucosamine, 1 xylose và 1 fructose Gốc carbohydrate này liên kết

với sợi polypeptide Trong sợi hydratecarbon này dường như một nửa không có liên quan đến cơ chế xúc tác của phân tử Người ta đề nghị cấu trúc gốc carbohydrate của phân tử bromelain như sau:

Hình 2.6 Cấu trúc gốc carbohydrate của bromelain

Khi phân tích thành phần acid amin ở bromelain thân và bromelain trái thì tùy theo phương pháp thu nhận và phương pháp phân tích mà có thành phần acid amin thay đổi khác nhau Bromelain có thành phần acid amin thay đổi trong khoảng 321-144 acid amin và bromelain trái là 283-161 acid amin

Bromelain thân là một sợi polypeptide có acid amin ở đầu amine là valine

và ở đầu carbohyrate là glycine, còn bromelain trái có acid amin ở đầu amine là alanine

2.2.5 Cấu trúc không gian của bromelain

Khi phân tích cấu trúc bậc một của enzyme bromelain Murachi và Busan nhận thấy cách xắp xếp acid amin trong phân tử bromelain như sau (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Ser – Val – Lys – Asn – Gln – Asn – Pro – Cys – Gly – Ala – Cys – Tryp –

- Gly – Cys – Lys –

Hình 2.7 Cách sắp xếp các acid amin trong phân tử enzyme bromelain

Bromelain là một protease trong tâm hoạt động có chứa cysteine và hai sợi polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối (– S – S –) Phân tử có dạng hình cầu

 Độ nhớt bên trong: 0,039 dl/gam

 Tỷ số ma sát f/fo: 1,26

 Điểm đẳng điện pI : 9,55

 Sự hấp thụ AL%cm: 20,1a cm (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.2.7 Hoạt tính của bromelain

a Hoạt tính phân giải

Bromelain có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase và esterase

Bromelain thân có thể thủy phân cả cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp như hemoglobin, casein, gelatin, BAA (Benzoyl – L – Arginine amidez), BAEE (Benzoyl – L – Arginine Ethyl Esther), BAEM (Benzoyl – L – Arginine Methyl Esther (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Khả năng phân giải cơ chất tự nhiên của bromelain

Bảng 2.2 Hoạt tính phân giải của bromelain

Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004

Đối với cơ chất là casein, hoạt tính phân giải của bromelain thân cao hơn bromelain trái xanh và bromelain trái chín

Khả năng phân giải cơ chất nhân tạo của bromelain Bromelain trái xanh có hoạt tính phân giải BAA cao hơn bromelain thân và bromelain trái chín

Bảng 2.3 Hằng số Michaelis (pH 6,0 5°C) với các cơ chất khác nhau như sau:

Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004

 BAA: Benzoyl – L – Arginine amidez

 BAEE: Benzoyl – L – Arginine Ethyl Esther

 BAEM: Benzoyl – L – Arginine Methyl Esther

Theo Murachi et al., (1964) với cơ chất là hemoglobin thì bromelain mạnh gấp 4 lần papain, với casein thì tương đương, với cơ chất BAA, BAEE thì kém hơn

Như vậy, hằng số xúc tác của bromelain đối với BAEE gấp 140 lần so với BAA, khác hẳn trường hợp papain và ficin

Ý nghĩa của hằng số Michaelis-Menten: chính là giá trị nồng độ cơ chất khi tốc độ phản ứng bằng ½ tốc độ cực đại Km có đơn vị là Molar, đơn vị nồng độ

Hằng số Michaelis là hằng số rất quan trọng Nó xác định ái lực của enzyme với

cơ chất Km càng nhỏ thì ái lực càng lớn, tốc độ phản ứng càng cao vì thế tốc độ cực đại Vmax đạt ở giá trị nồng độ cơ chất thấp

Hầu hết các tác giả đều thừa nhận vai trò của nhóm –SH của cystein, nhóm imidazole của histidine và nhóm disulfur trong hoạt động thủy phân của bromelain Nhóm –SH tham gia tạo thành acyl-thioester trung gian với nhóm carboxyl của cơ chất (nơi các liên kết peptide bị cắt) Nhóm imidazole làm chất trung gian nhận gốc acid và chuyển cho nhóm anion của chất nhận khác Cầu nối S-S có vai trò duy trì cấu trúc không gian của bromelain Casein và hemoglobin

là hai cơ chất tự nhiên được dùng nhiều nhất Đầu tiên, bromelain kết hợp với protein và thủy phân sơ bộ cho ra polypeptide và acid amine Protein kết hợp với nhóm –SH của enzyme khiến nó bị ester hóa rồi nhóm imidazole sẽ khử ester để giải phóng enzyme, acid amin và peptide

Ở giai đoạn đầu Zn2+ rất quan trọng, chúng kết hợp với nhóm –SH của tâm hoạt động hình thành mercaptid phân ly yếu (nhưng vẫn còn khả năng tạo liên kết phối trí bổ sung với các nhóm chức năng khác của phân tử protein như amine, carboxyl…)

Enzyme –SH +Zn2+ => enzyme-S-Zn + H+

Do vậy nhóm –SH trong tâm hoạt động đã bị ester hóa bởi cơ chất, cấu trúc không gian được bảo vệ ổn định

c Các đơn vị hoạt độ của enzyme

Đơn vị hoạt động của enzyme được coi là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa một lượng cơ chất nhất định trong một đơn vị thời gian nhất định ở điều kiện tiêu chuẩn Theo quy ước quốc tế có một số đơn vị hoạt độ sau:

 Đơn vị IU (đơn vị quốc tế)

Là lượng enzyme có khả năng xúc tác chuyển hóa được một micromole cơ chất sau thời gian một phút ở điều kiện tiêu chuẩn

 Hoạt độ riêng Hoạt độ riêng của một chế phẩm enzyme được biểu diễn bằng một đơn vị hoạt độ enzyme trên đơn vị khối lượng protein

IU hoặc kat/1 mg protein

2.2.8 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính bromelain

a Ảnh hưởng của nhiệt độ

Enzyme bromelain có hoạt tính cực đại trong khoảng nhiệt độ 50 – 60°C

Độ bền nhiệt của bromelain kém hơn papain Ở 70°C, bromelain bị biến tính nhanh gấp 20 lần papain ở 75°C Tuỳ thuộc cơ chất mà nhịêt độ tối ưu khác nhau

(Nguyễn Trọng Cẩn và ctv,1998) Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt lực xác tác của bromelain được giới thiệu ở hình 2.8

b Ảnh hưởng của pH

Enzyme bromelain có độ bền tương đối cao trong khoảng pH 4.5 – 8.3, biến tính nhanh trong môi trường pH < 4.5 và pH > 12 (Nguyễn Trọng Cẩn và ctv,1998)

Hình 2.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt tính bromelain

(http://www.nutriteck.com, ngày truy cập 10/12/2011)

c Ảnh hưởng của ion kim loại

Các ion kim loại có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme do chúng thường gắn vào các trung tâm hoạt động của enzyme Vì bromelain thuộc nhóm protease cystein, trung tâm hoạt động có nhóm –SH Bromelain bị ức chế bởi những ion hoặc hợp chất có ái lực mạnh hơn nhóm -SH, các tác nhân oxy hóa, halogen hóa, alkyl hóa như: Iodoacetate, bromoacetate, clo acetophenol, H2O2 Các ion kim loại như: Fe, Cu, Ag, Zn có xúc tác làm ổn định cấu trúc phân tử bromelain (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

d Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

Khả năng thuỷ phân của bromelain với các cơ chất khác nhau là khác nhau

Sự thuỷ phân tốt nhất là với casein và azocasein (Nguyễn Trọng Cẩn và ctv, 1998)

e Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Nhìn chung, trong trong điều kiện thừa cơ chất tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme được thể hiện ở hình 2.9

Đường biểu diễn có dạng như sau (Lê Ngọc Tú và ctv, 2003)

2.2.9 Ứng dụng enzyme bromelain

a Trong y học

Bromelain là enzyme được quan tâm đặc biệt trong y học vì nó được xem như là một trong những loại thuốc chữa bệnh, enzyme này được sử dụng nhờ các tác dụng:

Bromelain có tác dụng làm giảm các cơn đau Trong các nghiên cứu gần đây, việc sử dụng chế phẩm bromelain làm giảm hiện tượng sưng phồng, bầm dập, đau đớn đối với các sản phụ trải qua phẫu thuật nhỏ khi sinh và những người

bị bỏng rộp Bromelain cũng có tác dụng chữa đau nhức khớp gối…(Roger A et

al, 2006)

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng: bromelain có tác dụng loại trừ và làm giảm bớt các triệu chứng phù nề của bệnh nhân trải qua phẫu thuật hoặc vết thương trên mặt Trong một nghiên cứu trên thỏ, Neumayer C et al., (2006), đưa

ra kết quả khẳng định: bromelain làm giảm phù nề các vết thương tốt hơn khi kết hợp với trypsin và rutin (Roger A et al, 2006)

Mô hình nghiên cứu trên chuột đã khẳng định bromelain có khả năng loại trừ các tác nhân gây sưng và viêm tấy Bromelain cũng có ích trong việc chữa trị bệnh viêm, sưng Cũng trong một nghiên cứu trên chuột với bệnh viêm ruột kết, kết quả cho thấy bromelain làm giảm các triệu chứng lâm sàng (Roger A et al,

2006)

Bromelain ảnh hưởng có lợi trong làm lành các vết thương Trong một nghiên cứu về khả năng làm lành vết bầm ở những người trưởng thành, việc sử dụng thực phẩm có bổ sung bromelain cùng với một số vitamin và khoáng chất khác có tác dụng làm giảm vết bầm trên mô mềm Tuy nhiên, có điều cần lưu ý là hiệu quả của các thành phần bổ sung không được xác định rõ ràng và cũng không biết có bị ảnh hưởng bởi các chất phụ gia có trong đó không…(Roger A et al, 2006)

Từ 1963, bromelain của khóm đã được dùng vào điều trị bệnh rối loạn tiêu hóa dạ dày, ruột

Bromelain phối hợp với thuốc kháng sinh trong điều trị một số bệnh nhiễm khuẩn sẽ làm tăng hiệu quả kháng sinh, phối hợp với một số thuốc điều trị hen (theophyllin, ephedrin…) làm tăng tác dụng chống hen Mới đây, một nghiên cứu đăng trên tạp chí y học Anh cho biết, qua thử nghiệm trên chuột, các nhà khoa học đã nhận thấy bromelain làm giảm hơn 50% dấu hiệu viêm phổi đối với bệnh hen và liều lượng càng cao thì hiệu quả càng được cải thiện Bromelain làm tăng

hệ miễn dịch giúp cho người bị ung thư giảm được di căn (200 – 300 mg bromelain/kg thể trọng kết hợp với xạ trị hoặc hóa trị) Bromelain có tác dụng chữa đau tim (do làm tan máu tụ gây đau tim) (http://aids-cd.hiv.com.vn, http://www.caythuocquy.info.vn, ngày truy cập 10/12/2011)

b Trong công nghiệp thực phẩm

 Thuỷ phân gan bò Bromelain được ứng dụng để xử lý gan bò nhằm thu dịch thuỷ phân gan có hàm lượng acid amin cao Gan bò được xử lý bằng chế phẩm bromelain trong thời gian 10 giờ ở nhiệt độ 55°C, sau đó xử lý ở 100°C trong vòng 3 - 4 phút

Dịch thuỷ phân tách được đem lọc và đông khô Hàm lượng acid amin của chế

phẩm tăng lên gấp 1.5 - 2 lần so với sản phẩm ban đầu (Nguyễn Trọng Cẩn và ctv, 1998)

 Làm mềm thịt

Sử dụng chế phẩm bromelain để làm mềm thịt, kết quả là chất lượng của các loại thịt tăng cao, có thể chuyển loại thịt phẩm cấp thấp thành thịt có phẩm cấp cao (Lê Ngọc Tú, 2004)

 Làm đông tụ sữa Renin là loại enzyme được sử dụng làm đông sữa truyền thống, enzyme này được thu từ ngăn thứ tư của dạ dày bê Tuy nhiên, lượng renin không đáp ứng được nhu cầu ngày càng tăng của công nghiệp sữa Vì vậy, ngày nay người ta có

xu hướng thay thế enzyme renin bằng enzyme thực vật, trong đó bromelain được quan tâm sử dụng nhiều (Nguyễn Trọng Cẩn và ctv, 1998)

 Trong chế biến bia và nước giải khát Trong chế biến bia và nước giải khát: bromelain được dùng để làm trong bia và nước quả (Nguyễn Trọng Cẩn và ctv, 1998 ; Quách Đĩnh và ctv, 1996)

2.2.10 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme bromelain

a Nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, trong những năm gần đây các nhà khoa học đã bắt đầu quan tâm nghiên cứu về bromelain nhưng chưa nhiều Việc nghiên cứu phương pháp thu nhận enzyme có hiệu quả cao, đồng thời xác định một số đặc tính cơ bản của enzyme, từ đó đưa ra quy trình thu nhận, tinh chế enzyme bromelain từ phế phụ phẩm khóm là việc làm cần thiết, không những nâng cao giá trị kinh tế của trái khóm mà còn góp phần bảo vệ môi trường

Từ trước đến nay ở nước ta đã có vài nơi nghiên cứu về bromelain như Viện Pasteur, Trường Đại Học Tổng Hợp Hà Nội, hoặc ứng dụng nó và đã cho thấy những tính chất đặc biệt của bromelain Công trình này nhằm tìm ra phương pháp tối ưu cho phép thu nhận chế phẩm bromelain từ trái và tìm hiểu khả năng

sử dụng chế phẩm ấy cho việc thủy giải protein cá kém giá trị thương phẩm

Dương Thị Hương Giang và ctv (2002) đã nghiên cứu đánh giá các phương pháp trích ly bromelain từ nước khóm thô bằng acetone và bằng ammonium sulphate đã kết luận: phương pháp trích ly bromelain bằng acetone (-20°C) theo

tỷ lệ 1:1 thu nhận chế phẩm bromelain thô đạt hiệu suất thu hồi 76% so với hoạt tính ban đầu Phương pháp trích ly bromelain bằng ammonium sulphate theo tỷ

lệ 70% bảo hòa thu nhận bromelain thô cho hiệu suất thu hồi khá cao 92% so với hoạt tính ban đầu

Lại Thị Ngọc Hà (2009) đã nghiên cứu tách và tạo chế phẩm enzyme bromelain từ chồi ngọn khóm bằng cách kết tủa dịch chồi ngọn khóm ở nồng độ 80% v/v, sau đó đông khô kết tủa trong 3giờ Kết quả nghiên cứu cho thấy sản phẩm enzyme thu được có màu trắng ngà với độ ẩm 10%, hoạt tính là 72,48 U/g

và hiệu suất thu hồi của quá trình là 63,43% Ngoài ra, nghiên cứu còn cho thấy

là enzyme kém chịu nhiệt, có nhiệt độ tối thích là 55°C và pH tối ưu là 6,5

Nguyễn Đình Huyên và ctv (1994), đã nghiên cứu sản xuất và ứng dụng bromelain từ phần thịt quả dứa bằng phương pháp kết tủa với ba tác nhân là acetone và ethanol (-4°C) và ammonium sulphate bão hòa 70% ở 27°C đã kết luận rằng phương pháp tủa bằng ammonium sulfate cho kết quả tốt nhất, hoạt tính tổng của bromelain là 1.120.000 UI Phương pháp kết tủa bằng ethanol thu được bromelain có hoạt tính tổng 744.000 UI Phương pháp dùng tác nhân kết tủa là acetone thu được bromelain có hoạt tính tổng thấp nhất là 604.000 UI

b Nghiên cứu ngoài nước

Yih – Ming Chen et al., (1972) đã nghiên cứu về enzyme bromelain và tinh bột trích từ thân khóm Kết quả thu được cho thấy aceton ở nồng độ 40-50% và nhiệt độ kết tủa 5°C thì lượng enzyme và hoạt tính thu được là cao nhất Sản phẩm bromelain thân này có nhiệt độ tối ưu là 57°C và pH tối ưu là 7 Ngoài ra,

Zn2+ và Mg2+ lần lượt là chất ức chế và chất hoạt hóa mạnh nhất

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu liên quan đến bromelain, nhiều chế phẩm thương mại ra đời và có ứng dụng hiệu quả Ở Philipines người ta làm mềm dăm bông và chế tạo xúc xích đạt kết quả tốt đồng thời làm tăng hương thơm nhờ sử dụng trực tiếp nước khóm tươi

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Địa điểm, thời gian

Địa điểm thực hiện: Phòng thí nghiệm Hóa sinh thực phẩm, Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ

Thời gian thực hiện đề tài: Từ tháng 01/2012 đến tháng 05/2012

- Coomassie brilliant blue G (Ấn Độ)

- Bovine Serum Albumin (BSA)

- Trichloaceticacid (TCA)

- -Mercaptoethanol

- L-Cystein

- Mononatri orthophosphate (NaH2PO4.2H2O)

- Dinatri hydrophosphate (Na2HPO4.12H2O)

- Acid sulfuric (H2SO4)

- Nước cất

- Casein (Trung Quốc)

- Tyrosine ( C9H11O7.H2O) (Ấn Độ)

3.1.4 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

- Máy xay ( Retsch, ZM100, Germany)

- Máy ly tâm lạnh ( Rotanta 46R, Germany)

- Máy đo quang phổ ( Pharmacia LKB – Ultrospec, USA)

- Micropipette, pipette, nhiệt kế

- Cân phân tích ( OHAUS Corp, ARA520, USA)

3.2 Nội dung và phương pháp thí nghiệm

Quy trình trích ly enzyme bromelain được thể hiện ở hình 3.1

thân khóm, hoặc lá khóm hoặc trái khóm phế phẩm

Hình 3.1 Sơ đồ thu nhận enzyme bromelain

3.2.1 Thí nghiệm 1: Chọn nguồn nguyên liệu có thể trích lượng enzyme bromelain tốt nhất từ thân khóm, lá khóm và trái khóm phế phẩm.

Bã

Đo hoạt tính

Hình 3.2 Sơ đồ tiến hành thí nghiệm 1

Thuyết minh quy trình thí nghiệm

- Thu nhận 100 g thân khóm, 100 g lá khóm và 100 g trái khóm phế phẩm tại các vườn khóm ở xã Hỏa Tiến – Vị Thanh

- Xử lý và thu dịch: thân khóm, lá khóm và trái khóm phế phẩm rửa sạch bụi bẩn, cắt thành miếng để dễ xay nhuyễn thu được dịch Dịch thu được tiếp tục

đi ly tâm (ly tâm lạnh ở 8°C, 7000 vòng/phút trong 15 phút) loại bỏ các tạp chất

bị tủa bám dưới đáy bình ly tâm chỉ thu dịch trong

- Tiến hành đo hoạt tính và hàm lượng protein từ dịch trong thu được bằng phương pháp Kunitz cải tiến (xem phụ lục 1) và phương pháp Bradford (xem phụ lục 1)

- Thí nghiệm được tiến hành riêng biệt đối với thân, lá và trái khóm phế phẩm và lặp lại 3 lần Từ đó chọn ra nguồn nguyên liệu cho hiệu suất và hoạt tính tối ưu để ứng dụng cho thí nghiệm tiếp theo

d Chỉ tiêu theo dõi

- Hoạt tính tổng của enzyme bromelain (IU) bằng phương pháp Kunitz cải tiến (xem phụ lục 1)

- Hàm lượng protein tổng số (mg) bằng phương pháp Bradford (xem phụ lục 1)

- Hoạt tính riêng (IU/mg protein)

e Xử lý kết quả

Xử lý số liệu bằng chương trình thống kê Minitab 16

3.2.2 Thí nghiệm 2: So sánh ảnh hưởng của ba tác nhân kết tủa bromelain đến hiệu suất thu hồi và chi phí sản xuất.

 Mục đích Chọn tác nhân kết tủa bromelain thích hợp

 Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố với ba tác nhân kết tủa và

3 lần lặp lại

Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm 2

Tổng số đơn vị thí nghiệm: 3 x 3 = 9 đơn vị thí nghiệm

 Tiến hành thí nghiệm

a Thí nghiệm 2.1: Khảo sát tác nhân kết tủa acetone

b Thí nghiệm 2.2: Khảo sát tác nhân kết tủa ammonium sulfate.

c Thí nghiệm 2.3: Khảo sát tác nhân kết tủa ethanol

Sơ đồ tiến hành thí nghiệm của ba tác nhân kết tủa thể hiện ở hình 3.3

Số lần lặp lại

Nhân tố (tác nhân kết tủa)

Acetone (-20°C)

Ammonium sulfate (70% bão hòa)

Ethanol (80% v/v)

Rửa tủa bằng acetone (-20°C)

Sấy trong bình hút ẩm

Ammonium sulfate (70 % bão hòa ) Tophòng,tủa trong 1 giờ

Ly tâm lạnh (8°C,

7000 vòng/15phút) thu tủa

Rửa tủa bằng acetone (-20°C)

Sấy trong bình hút ẩm

Acetone (-20°C)

Tỷ lệ ( 1dd: 2acetone), tủa trong 1 giờ

Ly tâm lạnh (8°C,

7000 vòng/15phút) thu tủa

Rửa tủa bằng acetone (-20°C)

Sấy trong bình hút ẩm

Bromelain ở dạng bột Bromelain ở dạng bột Bromelain ở dạng bột

Xác định hoạt tính Xác định hoạt tính Xác định hoạt tính (Thí nghiệm 2.3) (Thí nghiệm 2.2) (Thí nghiệm 2.1)

Hình 3.3 Sơ đồ tiến hành thí nghiệm 2

Thuyết minh sơ đồ Thu 500 g thân khóm tại các vườn khóm ở xã Hỏa Tiến – Vị Thanh

Xử lý và thu dịch: tách hết lá ra khỏi thân để thu thân khóm, rửa sạch thân khóm, cắt thành miếng để dễ xay nhuyễn thu dịch bỏ bã Dịch thu được tiếp tục được ly tâm (ly tâm lạnh ở 8°C, 7000 vòng/phút trong 15 phút) loại bỏ tạp chất

để thu dịch trong Dịch trong sau khi thu được ở trên được làm lạnh ở 4°C và bổ sung -Mercaptoethanol theo tỉ lệ 5.10-3 mol/l Sau đó tiến hành kết tủa với ba tác nhân: acetone, ammonium sulfate, ethanol

 Tiến hành kết tủa với tác nhân acetone (acetone được lạnh đông -20°C) với tỉ lệ 1 dịch khóm: 2 acetone (Phạm Thị Trân Châu và ctv, 2007) cho vào từ từ, hỗn hợp để trên máy khuấy từ, khuấy khoảng 20 phút rồi để ổn định ở 4°C khoảng 40 phút Sau đó đem ly tâm lạnh ở 8°C trong 15 phút với vận tốc 7000 vòng/phút và thu phần tủa bỏ dịch

 Tiến hành kết tủa với tác nhân ammonium sulfate (70% bão hòa) với tỉ lệ 100ml dịch khóm: 47,2 g ammonium sulfate (Phạm Thị Trân Châu và ctv, 2007) cho vào từ từ, hỗn hợp để trên máy khuấy từ, khuấy khoảng 30 phút rồi để ổn định ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút Sau đó đem ly tâm lạnh ở 8°C trong 15 phút với vận tốc 7000 vòng/phút và thu phần tủa bỏ dịch

 Tiến hành kết tủa với tác nhân ethanol (80% v/v) với tỉ lệ 1 dịch khóm:

4ethanol (Lại Thị Ngọc Hà, 2009) cho vào từ từ, hỗn hợp để trên máy khuấy từ, khuấy khoảng 20 phút rồi để ổn định ở 4°C cho đến khi đạt thời gian là 2 giờ Sau đó đem ly tâm lạnh ở 8°C trong 15 phút với vận tốc

7000 vòng/phút và thu phần tủa bỏ dịch

Kết tủa thu được rửa nhanh bằng acetone lạnh, sau đó đem sấy trong bình hút ẩm chân không: mẫu được để trong bình hút ẩm có chuẩn bị dĩa acid sulfuric đậm đặc, tiếp đó dùng máy hút, hút hết không khí trong bình, sau đó đem trữ trong tủ lạnh (ở 4°C)

Chế phẩm kỹ thuật thu được enzyme bromelain ở dạng bột Cuối cùng đem cân khối lượng sau cho khối lượng hai lần cân tương đối ổn định thì xác định hoạt tính theo phương pháp Kunitz cải tiến và hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Bradford

 Chỉ tiêu theo dõi

- Khối lượng bột enzyme bromelain (g)

- Hàm lượng protein tổng (mg) (theo phương pháp Bradford)

- Hoạt tính tổng của enzyme Bromelain (IU) ( theo phương pháp Knunitz cải tiến)

- Hoạt tính riêng (IU/mg protein)

- Hoạt tính bột enzyme bromelain (IU/g)

- Hiệu suất thu hồi (%)

- Chi phí sản xuất 20.000 IU (VND)

 Xử lý kết quả Bằng chương trình thống kê Minitab 16 để xử lí số liệu thu được

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Chọn nguồn nguyên liệu có thể trích lượng enzyme bromelain tốt nhất từ thân khóm, lá khóm và trái khóm phế phẩm.

Thân khóm, lá khóm và trái khóm phế phẩm sẽ được xử lý và xay nhuyễn để thu dịch chiết enzyme thô sau khi ly tâm loại bỏ các tạp chất Tiến hành thí nghiệm chuẩn bị các mẫu được đem phân tích hoạt tính enzyme theo phương pháp Kunitz Kết quả thí nghiệm giá trị đo được trên máy quang phổ (độ hấp thụ OD, bước sóng 275nm) chính là nồng độ Tyrosine (mol) sinh ra do quá trình thuỷ phân cơ chất casein Từ giá trị độ hấp thụ này xác định hoạt tính enzyme bromelain theo đơn vị IU/ml

Từ các mẫu dịch khóm cũng đem xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford Từ giá trị độ hấp thụ đo được trên máy quang phổ (độ hấp thụ OD, bước sóng 595nm) xác định hàm lượng protein của enzyme bromelain theo đơn

vị mg/ml Sự khác biệt hoạt tính và hàm lượng protein của enzyme bromelain từ các nguồn nguyên liệu khóm được thể hiện ở bảng 4.1

Bảng 4.1 Kết quả thí nghiệm chọn nguồn nguyên liệu khóm

*Số liệu là trung bình của 3 lần lặp lại Trong cùng một cột, những giá trị có kèm các chữ cái khác nhau biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 5% (p<0.05).

Từ kết quả bảng 4.1 cho thấy ở thân có hoạt tính tổng (4.787,1 IU), hàm lượng protein tổng số (360,43 mg) và hoạt tính riêng (13,378 IU/mg) của enzyme bromelain là cao nhất, tiếp đó là trái (1.191,4 IU; 119,80 mg; 9,948 IU/mg) và thấp nhất là lá (444,5 IU; 65,20 mg; 6,820 IU/mg) Kết quả này phù hợp với kết

Các nguồn nguyên liệu khóm

Khối lượng (g)

Thể tích dịch chiết enzyme thô (ml)

Hoạt tính tổng (IU)

Hàm lượng Protein tổng (mg)

Hoạt tính riêng (IU/mg)

Trái khóm phế phẩm

quả nghiên cứu của Laura.P.Hale et al., (2004) và Nguyễn Đức Lượng (2004) về hoạt tính đặc hiệu của bromelain trái và thân trên cơ chất casein thì bromelain thân cao hơn bromelain trái

Lá khóm rất cứng và có gai, thích hợp cho quá trình ủ chua làm thức ăn cho gia súc hoặc làm phân bón Theo các nghiên cứu trước bromelain có nhiều trong thân và trái hơn so với lá Vì thế thân và trái có có thể sử dụng để trích ly enzyme bromelain Từ các kết quả nghiên cứu, enzyme bromelain thân và enzyme bromelain trái có điểm riêng biệt Do hai loại enzyme là hai protein riêng biệt (Ota et al., 1985), hay được mô tả với hai hình thức đơn lẻ (Iida et al., 1973;

Sasaki et al., 1973) Protein đã xác định số lượng nhưng khác nhau giữa protein trên thân và protein thịt trái (Yamada et al., 1976) Theo Trần Anh Dũng (2006) Bromelain thân gồm hỗn hợp bốn loại cystein-protease nên khác với bromelain trái chỉ có một loại duy nhất Bên cạnh đó, thân khóm được dùng để sản xuất bromelain thương mại có giá trị kinh tế cao (Trần Anh Dũng, 2006)

Từ kết quả đạt được và những nghiên cứu trước đây cho thấy nguồn nguyên liệu là thân khóm sẽ thích hợp để trích ly enzyme bromelain Vì thế thân khóm được sử dụng làm nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo

4.2 Khảo sát và chọn lựa tác nhân kết tủa bromelain tốt nhất từ ba tác nhân kết tủa acetone, ethanol, ammonium sulphate.

4.2.1 Khảo sát tác nhân kết tủa là acetone

Dựa tiến trình của Phạm Thị Trân Châu và ctv ( 2007) Kết quả thể hiện ở bảng 4.2:

Bảng 4.2 Kết quả khảo sát tác nhân kết tủa là acetone

*Số liệu là trung bình của 3 lần lặp lại Trong cùng một cột, những giá trị có kèm các chữ cái khác nhau biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 5% (p<0.05).

Kết quả bảng 4.2, cho thấy rằng dịch nước khóm ban đầu có hoạt tính tổng

là 16.698,1 IU và hàm lượng protein tổng là 1.261,5 mg cao hơn so với hoạt tính tổng (14.298,3 IU) và hàm lượng protein tổng (990 IU) của bột enzyme Điều này cho thấy không phải tất cả bromelain trong dịch khóm ban đầu đều được kết tủa, các protein còn lại có thể là các protein tạp

Kết quả thí nghiệm (Bảng 4.2) cho thấy lượng bột enzyme thu được 4,5392

g, hoạt tính tổng 14.298,3 IU, hàm lượng protein tổng 990 mg, hoạt tính riêng 14,4623 IU/mg và hiệu suất thu hồi hoạt tính 85,626 % Theo Bành Thị Hoàng Kim (2008) khi trích ly enzyme bromelain từ 300 ml thân khóm trồng được một năm dùng phương pháp kết tủa phân đoạn thì kết quả như sau: khối lượng bột enzyme (2,350 g), hoạt tính tổng (5.170 U), hàm lượng protein tổng số (935,30

Chỉ tiêu theo dõi

Khối lượng thân khóm (g)

Thể tích (ml)

Khối lượng bột enzyme (g)

Hoạt tính tổng (IU)

Hàm lượng protein tổng (mg)

Hoạt tính riêng (IU/mg)

Hoạt tính bột enzyme (IU/g)

Hiệu suất thu hồi hoạt tính (%)

Chi phí sản xuất 20.000 IU (VND)

Dịch chiết thô

500 180 16.698,1 a 1.261,5 a 13,2367 b 100

Bột enzyme bromelain

500 4,5392 14.298,3 b 990 b 14,4623 a 3.146,6 85,626 190.819

mg), hoạt tính riêng (5,53 U/mg) và hiệu suất thu hồi (70,08 %) Các chỉ tiêu nghiên cứu của Bành Thị Hoàng Kim (2008) đều thấp hơn so với kết quả thí nghiệm của chúng tôi Điều này chứng tỏ rằng phương pháp kết tủa bằng tác nhân acetone mà đề tài thực hiện tương đối hiệu quả hơn phương pháp kết tủa phân đoạn

4.2.2 Khảo sát tác nhân kết tủa là ammonium sulfate.

Tiến trình thí nghiệm dựa trên nghiên cứu của Renee Tisseau (1976) Kết quả thí nghiệm thể hiện qua bảng 4.3

Bảng 4.3 Kết quả khảo sát tác nhân kết tủa là ammonium sulfate

*Số liệu là trung bình của 3 lần lặp lại Trong cùng một cột, những giá trị có kèm các chữ cái khác nhau biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 5% (p<0.05).

Chỉ tiêu

theo dõi

Khối lượng thân khóm (g)

Thể tích (ml)

Khối lượng bột enzyme (g)

Hoạt tính tổng (IU)

Hàm lượng protein tổng (mg)

Hoạt tính riêng (IU/mg)

Hoạt tính bột enzyme (IU/g)

Hiệu suất thu hồi hoạt tính (%)

Chi phí sản xuất 20.000 IU (VND)

Kết quả bảng 4.3, bột enzyme bromelain có hoạt tính tổng (13.350 IU), hàm lượng protein tổng (1.057,88 mg) và hoạt tính riêng (12,6293 IU/mg) thấp hoàn toàn so với dịch chiết thô hoạt tính tổng (21.174,5 IU), hàm lượng protein tổng (1.521,88 mg), hoạt tính riêng (13,9367 IU/mg) điều này chứng tỏ kết tủa bằng muối chỉ một phần enzyme bị tủa phần còn lại có thể là protein tạp, trong quá trình tủa vẫn còn sự hiện diện của ammonium sulfate trong chế phẩm

Kết quả thí nghiệm (bảng 4.3) cho thấy khối lượng bột enzyme thu được 10,5492 g, hoạt tính tổng 13.350 IU, hàm lượng protein tổng 1.057 mg, hoạt tính riêng 12,6293 IU/mg và hiệu suất thu hồi hoạt tính 63,052% Theo nghiên cứu của Bành Thị Hoàng Kim (2008), tiến hành trên 300 ml dịch chiết thô ban đầu kết quả như sau: khối lượng bột enzyme (17 g), hoạt tính tổng (6.970 U), hàm lượng protein tổng (1.734 mg), hoạt tính riêng (4,02 U/mg), hiệu suất (94,48 %)

Từ đó ta thấy rằng: hoạt tính tổng là 13.350 (IU) là cao hơn so với kết quả (6.970 U) và hoạt tính riêng là 12,6293 (IU/mg) cũng cao hơn so với kết quả (4,02 U/mg) của tác giả Bành Thị Hoàng Kim (2008) Có thể kết luận rằng mặc dù hiệu suất thu hồi hoạt tính thấp nhưng độ tinh sạch enzyme bromelain của phương pháp mà đề tài nghiên cứu là đạt kết quả tương đối tốt hơn nghiên cứu của tác giả Bành Thị Hoàng Kim (2008)

4.2.3 Khảo sát tác nhân kết tủa là ethanol

Tiến trình thí nghiệm dựa theo nghiên cứu của Lại Thị ngọc Hà (2009) Kết quả thể hiện ở bảng 4.4

Bảng 4.4 Kết quả khảo sát tác nhân kết tủa là ethanol

*Số liệu là trung bình của 3 lần lặp lại Trong cùng một cột, những giá trị có kèm các chữ cái khác nhau biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 5% (p<0.05).

Kết quả bảng 4.4, hoạt tính tổng (17.232,4 IU), hàm lượng protein tổng (1.287 mg) của dịch chiết thô cao hơn nhiều so với bột enzyme có hoạt tính tổng (14.580,3 IU), hàm lượng protein (1.019,14 mg) nhưng hoạt tính riêng của bột enzyme (14,3227 IU/mg) và của dịch chiết thô (13,3927 IU/mg) không có khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê Kết quả này cho thấy trong kết tủa bằng tác nhân ethanol cũng có thể còn một số protein tạp có trong dịch chiết thô

Kết quả thí nghiệm (bảng 4.4) khối lượng bột enzyme là 5,314 g, hoạt tính tổng 14.580,3 IU, hàm lượng protein tổng 1.019,14 mg, hoạt tính riêng 14,3227 IU/mg và hiệu suất thu hồi 84,584 % Theo kết quả nghiên cứu của Lại Thị Ngọc

Hà (2009) kết tủa ở nồng độ cồn (80% v/v) trên chồi ngọn kết quả đạt được: hoạt lực (0,4645 U/ml); hàm lượng protein (1,9481 mg/ml); hoạt lực riêng (0,2384

Chỉ tiêu theo dõi

Khối lượng thân khóm (g)

Thể tích (ml)

Khối lượng bột enzyme (g)

Hoạt tính tổng (IU)

Hàm lượng protein tổng (mg)

Hoạt tính riêng (IU/mg)

Hoạt tính bột enzyme (IU/g)

Hiệu suất thu hồi hoạt tính (%)

Chi phí sản xuất 20.000 IU (VND)

Dịch chiết

thô

500 180 17.232,4 a 1.287 a 13,3927 a 100

Bột enzyme bromelain

500 5,314 14.580,3 b 1.019,14 b 14,3227 a 2744,9 84,584 187.128

U/mg) và hiệu suất thu hồi (76,33%) Ta thấy rằng hai phương pháp tiến hành gần như giống nhau nhưng kết quả của đề tài lại cao hơn kết quả của tác giả Lại Thị Ngọc Hà về hoạt tính riêng và hiệu suất thu hồi hoạt tính Điều này cho thấy

có thể enzyme bromelain được thu nhận từ thân khóm có hoạt tính bền hơn từ chồi ngọn

4.2.4 So sánh sự ảnh hưởng của ba tác nhân kết tủa đến hiệu suất thu hồi và chi phí sản xuất

Qua sơ đồ tiến hành thí nghiệm của ba tác nhân kết tủa về cơ bản ba phương pháp trải qua các giai đoạn tương tự nhau Đầu tiên xử lý nguyên liệu, phá vỡ tổ chức mô bằng cách dùng máy nghiền rồi lấy dịch ly tâm loại bỏ tạp chất thu được dịch chiết enzyme thô, sau đó dùng ba tác nhân khác nhau để gây tủa bromelain

Kết quả tổng hợp ba tác nhân kết tủa được trình bày ở bảng 4.5

Bảng 4.5 Kết quả tổng hợp ba tác nhân kết tủa là: acetone, ammonium sulfate và ethanol

*Số liệu là trung bình của 3 lần lặp lại Trong cùng một cột, những giá trị có kèm các chữ cái khác nhau biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 5% (p<0.05).

Kết quả bảng 4.5 cho thấy, lượng kết tủa thu được bằng phương pháp ammonium sulfate (10,55 g) cao hơn hẳn so với hai phương pháp còn lại (acetone: 4,54 g, ethanol: 5,15 g) mặc dù cả ba phương pháp đều tiến hành với cùng một lượng khóm như nhau (500g) Đó có thể là do trong bột enzyme mà ta thu được khi kết tủa với tác nhân ammonium sulfate vẫn có sự hiện diện các phân

Tác nhân kết

tủa

Khối lượng nguyên liệu (g)

Khối lượng bột enzyme (g)

Hoạt tính tổng (IU)

Hàm lượng protein tổng (mg)

Hoạt tính bột enzyme (IU/g)

Hoạt tính riêng (IU/mg)

Hiệu suất thu hồi hoạt tính (%)

Chi phí sản xuất 20.000 IU (VND) Acetone 500 4,5392 c 14.298,3 ab 990,00 b 3.146,6 a 14,4626 a 85,626 a 190.819 a

Ethanol 500 5,3140 b 14.580,3 a 1.019,14 ab 2.744,9 b 14,3228 a 84,584 a 187.128 b

Ammonium

sulfate 500 10,5492

a 13.350,0 b 1.057,88 a 1.265,6 c 12,6296 b 63,052 b 75.059 c

tử ammonium sulfate Vì thế, khối lượng bột enzyme khi kết tủa bằng tác nhân ammonium sulfate lại cao hơn acetone và ethanol

Từ kết quả chạy thống kê (phần phụ lục 2), hoạt tính tổng của ba phương pháp thì không khác biệt ý nghĩa về thống kê ở mức độ 5% (p>0.05) Ta cũng thấy rằng hai phương pháp kết tủa bằng acetone và ethanol đều không khác biệt ý nghĩa Do đó, ta có thể so sánh kết quả thí nghiệm theo hai nhóm: tác nhân kết tủa là dung môi hữu cơ (acetone và ethanol) và tác nhân ammonium sulfate

Kết quả bảng 4.5 phương pháp kết tủa bằng dung môi hữu cơ cho hoạt tính tổng (acetone: 14.298,3 IU; ethanol: 14.580,3 IU), hoạt tính bột enzyme (acetone: 3.146,6 IU/g; ethanol: 2.744,9 IU/g), hoạt tính riêng (acetone: 14,4626 IU/mg; ethanol: 14,3228 IU/mg) và hiệu suất thu hồi hoạt tính (acetone:

85,626%; ethanol: 84,584%) cao hơn nhiều so với tác nhân kết tủa là ammonium sulfate có hoạt tính tổng (13.350 IU), hoạt tính bột enzyme (1.265,6 IU/g), hoạt tính riêng (12,6296 IU/mg) và hiệu suất thu hồi hoạt tính (63,052 %) Điều này cho thấy tác nhân kết tủa là dung môi hữu cơ thì có hoạt tính tổng cao, hoạt tính bột enzyme cao và đặc biệt là hoạt tính riêng cũng cao nói lên độ tinh sạch của enzyme bromelain khi kết tủa bằng dung môi hữu cơ cao hơn tác nhân ammonium sulfate Do đó, có thể kết luận rằng phương pháp kết tủa bằng dung môi hữu cơ tốt hơn tác nhân kết tủa ammonium sulfate Mặt khác, ta thấy giữa tác nhân acetone và tác nhân ethanol thì hoạt tính tổng, hoạt tính riêng và hiệu suất thu hồi hoạt tính đều không khác biệt ý nghĩa thống kê, tuy nhiên hoạt tính bột enzyme của acetone là 3.146,6 (IU/g) cao hơn ethanol (2.744,9 IU/g) Đây cũng là một chỉ tiêu để đánh giá chất lượng enzyme bromelain Mặc dù, chi phí sản xuất 20.000 IU của acetone là 190.819 (VND) cao hơn ammonium sulfate (75.059 VND) và ethanol (187.128 VND), nhưng ta có thể thu hồi được lượng acetone đã dùng trong kết tủa để sử dụng lại Tóm lại, với những kết quả nhận được ở trên, nhận thấy rằng tác nhân kết tủa là acetone là tác nhân tốt nhất trong

ba tác nhân kết tủa là acetone, ammonium sulfate và ethanol

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận

Qua quá trình nghiên cứu trích ly enzyme bromelain từ thân khóm, lá khóm và trái khóm phế phẩm thì thu được kết quả như sau:

Thân khóm là nguồn nguyên liệu thích hợp để trích ly bột enzyme bromelain

Trong ba tác nhân kết tủa enzyme bromelain là acetone, ammonium sulfate

và ethanol thì acetone là tác nhân kết tủa tốt nhất

Đề xuất quy trình trích ly chế phẩm enzyme bromelain theo phương pháp kết tủa bằng acetone

Quy trình trích ly chế phẩm enzyme bromelain theo phương pháp kết tủa bằng acetone

Ly tâm lạnh (8°C,

7000 vòng/15phút) thu tủa

Rửa tủa bằng acetone (-20°C)

Sấy trong bình hút ẩm

Bromelain ở dạng bột

Xác định hoạt tính