TRÍCH LY ENZYME FICIN TỪ MỦ CÂY SUNG

TRÍCH LY ENZYME FICIN TỪ MỦ CÂY SUNG Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, công nghiệp sản xuất các chế phẩm enzyme cũng ngày càng phát triển và có ứng dụng to lớn trong nhiều lĩnh vực khác nhau.

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, côngnghiệp sản xuất các chế phẩm enzyme cũng ngày càng phát triển và có ứng dụng tolớn trong nhiều lĩnh vực khác nhau

Trong những năm gần đây, giá trị thương mại của các enzyme công nghiệp trêntoàn thế giới đạt khoảng 2 tỷ USD, trong đó chủ yếu là các enzyme thủy phân (75%),

và protease là nhóm enzyme được ứng dụng nhiều nhất (60%).(http://ir.cftri.com:8080/417/1/T-1952.pdf)

Protease là nhóm enzyme thủy phân liên kết peptide trong phân tử protein, rấtcần thiết cho các sinh vật sống nên có mặt trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vikhuẩn, nấm, virus ) đến động vật (gan, dạ dày bê ) và thực vật (đu đủ, dứa, sung )rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể

So với protease động vật và vi sinh vật, protease thực vật có những đặc điểm rấtkhác biệt khó có thể thay thế được Có 3 loại protease thực vật phổ biến nhất làbromelain, papain và ficin Bên cạnh 2 loại enzyme đã được nghiên cứu rõ ràng và cónhiều ứng dụng cụ thể là bromelain và papain thì ficin cũng là một enzyme quan trọng

có nhiều ứng dụng cần được đầu tư nghiên cứu

Ficin được sử dụng nhiều nhất trong một số ngành sản xuất như: chế biến thựcphẩm (làm formage, làm mềm thịt, bổ sung để chống lại hiện tượng tủa protein trongquá trình làm trong bia, ngăn cản sự hóa nâu rau củ, xử lý phụ phế phẩm trong chếbiến thực phẩm…), trong y học như làm thuốc hỗ trợ tiêu hóa, tẩy giun Ngoài ra, cónhiều ứng dụng đang được nghiên cứu như sản xuất thuốc làm tan máu bầm, trị bệnhngoài da, mụn nhọt

Có thể thấy, sung là một loại cây dễ trồng, phát triển nhanh và enzyme ficinđược trích từ mủ sung là một loại enzyme có nhiều ứng dụng to lớn do đó đề tài “Trích

ly enzyme ficin từ mủ cây sung” được thực hiện nhằm tạo cơ sở cho các nghiên cứuứng dụng về sau

1.2 Mục tiêu đề tài

Khảo sát khả năng thu nhận enzyme ficin

Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme ficin

Khảo sát khả năng bất hoạt sự hóa nâu ở rau quả sơ chế

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Enzyme protease

2.1.1 Sơ lược enzyme protease

Nhóm enzyme protease (peptide – hydrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phânliên kết peptide R1-CO-NH-R2 trong phân tử protein và polypeptide tạo sản phẩm làpepton, di-, tri-peptide, amino acid và là một trong những nhóm enzyme quan trọngphổ biến có nhiều ứng dụng trong công nghiệp và có thể thu nhận từ nhiều nguồn khácnhau: protease thực vật (papain, bromelain, ficin), động vật (pepsin, trypsin,pancretin, ), vi sinh vật (protease từ nấm mốc, vi khuẩn ) (Đồng Thị Thanh Thu,1996)

Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vậnchuyển acid amin

Protease (peptidase) thuộc nhóm chính 3, nhóm phụ 4 (EC.3.4)

Hình 1 Sơ đồ phân loại nhóm enzyme thủy phân protein

Protease được phân chia thành hai nhóm: endopeptidase và exopeptidase

 Exopeptidase: cắt cầu nối peptidic ở đầu mạch (carboxipeptidase,aminopeptidase, dipeptidase…) Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide,exopeptidase được phân chia thành hai loại:

o Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của

Protease (EC.3.4)

o Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗipolypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.

 Endopeptidase: tác dụng vào các phần trung tâm của mạch polypeptid (pepsin,tripsin, chymotripsin, papain…) Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidaseđược chia thành bốn nhóm:

o Serin protease: là những protease chứa nhóm –OH của gốc serine trongtrung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác củaenzyme Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin Nhómchymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase

Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như Subtilisin carlsberg, Subtilisin

BPN Các serine protease thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tínhđặc hiệu cơ chất tương đối rộng

o Cysteine protease: Các protease chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạtđộng Cystein protease bao gồm các protease thực vật như papain, bromelin, một vàiprotein động vật và protease ký sinh trùng Các cystein protease thường hoạt động ởvùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng

o Aspartic protease: Hầu hết các aspartic protease thuộc nhóm pepsin.Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin.Các aspartic protease có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thườnghoạt động mạnh ở pH trung tính

o Metallo protease: Metallo protease là nhóm protease được tìm thấy ở vikhuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo protease thườnghoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA

Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:

- Protease acid: pH 2-4

- Protease trung tính: pH 7-8

- Protease kiềm: pH 9-11

Nguồn thu nhận enzyme protease:

a Protease vi sinh vật

Hầu hết các nhóm vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn đều có khả năng tổng hợp

protease Các chủng có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus subtilis, B.

mesentericus, B Thermorpoteoliticus, Aspergillus oryzae, A terricola, A fumigatus,

A saitoi, Penicillium chysogenum, A candidatus, P cameberti, P roqueforti…) (Lê

Ngọc Tú, 1982)

b Protease động vật

Nguồn protease từ động vật đã được ứng dụng từ lâu đời với nguồn gốc từ nộitạng như pepsin, tripsin, từ dạ dày bê như renin, và cả protease được trích từ ruột cábasa

c Protease thực vật

Có 3 loại protease thực vật phổ biến nhất là bromelain, papain và ficin Papain

thu được từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Carica papaya) còn bromelain thu từ quả, chồi, và vỏ dứa (Pineapple plant) và ficin thu được từ nhựa cây họ sung (Ficus).

2.1.2 Ứng dụng của enzyme protease

Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau:

- Trong công nghiệp thực phẩm:

 Trong công nghiệp thịt, đồ hộp: làm mềm thịt, tăng hương vị vàgiá trị thịt sau khi chế biến

 Trong công nghiệp chế biến sữa: dùng các protease làm đông tụ

sữa (renin), protease vi sinh vật khác (Bacillus mensentericus, Mucor…) trong sản xuất

fomage

 Công nghiệp nước giải khát: làm trong bia, rượu, nước quả

 Công nghiệp nước chấm, nước mắm: rút ngắn quá trình thủyphân, chế biến nước mắm, muối cá, sản xuất bột cá…

- Trong y học: thuốc tiêu hóa, dùng cô đặc tinh chế huyết thanh miến dịch, thuốcđiều trị nghẽn tĩnh mạch, tiêu mủ vết thương…

- Trong công nghiệp nhẹ:

 Mỹ phẩm: dùng trong sản xuất xà phòng, dầu gôi, kem bôi da…

 Bột giặt: tăng khả năng tẩy rửa các vết bẩn

 Thuộc da: làm sạch lông, mềm da

 Tơ tằm: có thể sử dụng để làm bóng và tách rời các sợi tơ tằm do thủy phânlớp sericine làm dính bết các sợi tơ tự nhiên (Lê Ngọc Tú, 2004)

2.2 Enzyme ficin

Enzyme ficin hay còn gọi là ficain là một thiol-protease có trong dịch nhựa của

(papain, bromelain) ficin cũng có chứa nhóm sulfhydryl (-SH) ở trung tâm hoạt động,quyết định hoạt tính xúc tác của enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Mã số phân loại: EC 3.4.22.3

2.2.1 Lịch sử phát hiện

Người ta thấy rằng cách đây hàng mấy thế kỉ, chất dịch nhựa của các cây sung,

vả đã được sử dụng để làm đông tụ sữa và sản xuất fomage

Hàng thế kỉ nay, ở Trung Quốc và Nam Mỹ, chất nhựa của loài Ficus glasbrata

và Ficus laurifolia được biết đến như một loại thuốc uống để trị các bệnh do ký sinh

trùng đường ruột gây ra (Julia et al., 1987)

Robbins (1930) phát hiện ra một loại enzyme có trong nhựa cây sung, vả có thể

tiêu hóa được loài giun tròn Acaris còn sống do đó có thể tiêu diệt được chúng Ông là

người đầu tiên nghiên cứu enzyme này và đặt tên là ficin

Caldwel (1943) nhận thấy chất nhựa các loài cây Ficus có khả năng tiêu diệt loài sán dây Trichuris trichura.

Walti (1938) là người đầu tiên kết tinh được enzyme từ nhựa sung tươi

Sau này, quá trình tách chiết và tinh sạch ficin được nhiều tác giả nghiên cứutrong thời gian rất dài Nhìn chung các quá trình tinh sạch ficin đều liên quan đến việctủa sơ bộ bằng muối Sự tủa sơ bộ bằng muối đối với ficin được thực hiện lần đầu bởiEnglund (1968) (Sidney et al., 1970)

2.2.2 Nguồn gốc thu nhận

Ficin là một protease được tìm thấy trong dịch nhựa của những cây thuộc giống

Ficus Các cây thuộc giống Ficus có tên gọi thông thường là sung, vả, họ Moraceae,

bộ Urticales.

Ở Việt Nam, giống Ficus có khá nhiều loài khác nhau Có thể kể tên một số loài

sung, vả theo tài liệu của Giáo sư Phạm Hoàng Hộ (1962) như sau:

Sung trổ (Ficus variegata)

Sung (Ficus racemosa L.)

Sung ba thùy (Ficus hirta)

Sung thằn lằn (Ficus pumila L.)

Vả (Ficus auriculata Lour)

Sau đây là đặc điểm mô tả của một số loài thuộc giống Ficus có ở Việt Nam: Cây vả (Ficus auricalata Lour): cây đại mộc nhỏ, thân to, nhánh to Lá to gần

như tròn, mặt đưới có 5-7 gân lá, cuống lá khoảng 2,5cm, quả làm rau ăn Cây đượctrồng nhiều nơi ở Việt Nam và mọc hoang trong rừng (Phạm Hoàng Hộ, 2000)

Cây sung trổ (hay còn gọi là ngõa rừng, vả rừng) (Ficus variegata Blume) là cây

thân gỗ nhỏ, có nhánh, đường kính 5-6 mm rất nhẵn Lá hình trái xoan ngược, tù và cókhi tròn ở gốc, đầu hơi nhọn hoặc không, mặt trên lá rất nhẵn, bóng, mặt dưới màunhạt, mép lá có hoặc hơi có răng cưa không đều, lá dài 13-22 cm, rộng 5-13 cm, cuống2-4 cm Quả xếp 1-2 quả trên các nhánh từ gốc hoặc trên thân già, có cuống, quả hìnhcầu, nhẵn hoặc có lông mịn, quả khi chín có màu lục sọc đỏ hoặc đỏ, đường kính 3-4

cm Quả chín có vị ngọt

Cây si (Ficus benjamica L.) là cây ưa ẩm, mọc hoang, hiện nay được trồng ở

nhiều nơi Nhựa để chữa ứ huyết, nhức mỏi, chữa ho, cắt cơn hen

Cây vú bò, hay vú chó (Ficus heterophyllus L.) mọc hoang ở vùng đồi, ven rừng

dùng làm thuốc bổ chữa hư lao, bạch đới, ngâm rượu chữa tê thấp

Cây xộp (Ficus pumila L hay Ficus glomerata Roxb) mọc hoang nhiều nơi và

được trồng ở một số vùng, dùng làm thuốc bổ, quả làm mứt ăn ngon (Luisa et al.,2000)

Cây sung (Ficus racemosa L.) là loài cây nhỏ, không có rễ phụ, cành mềm có

nhiều vảy, u lồi và sẹo, lúc non có lông nâu mềm, lá hình bầu dục thuôn tù ở gốc, nhọn

ở đỉnh, mặt trên bóng, mép nguyên hay nhăn nheo, trên phiến lá có nhiều u nhỏ gọi là

vú sung Quả phức xếp dày đặc ở thân, cành, màu đỏ nâu khi chín, có hoa quanh năm,quả ăn được Cây thường mọc ở nơi ẩm ướt, bờ ao (Võ Văn Chi, 1990)

Theo Giáo sư Đỗ Tất Lợi (1981) Ficus racemosa L mọc hoang và được trồng

khắp nơi ở Việt Nam Tên thông thường là sung, ưu đàm hoặc Lova (tiếngCampuchia) Loài sung này có thân cây to, không có rễ phụ Thân có nhựa màu trắngnhư sữa, lá hình mũi giáo, đầu nhọn Lá non cả 2 mặt đều phủ lông, phiến lá nguyên

hoặc hơi có răng cưa, dài 4-10 cm, rộng 4-8 cm Lá sung bị loài sâu Syllidae ký sinh

gây ra những mụn nhỏ Quả mọc thành từng chùm trên thân hoặc những cành to khôngmang lá Khi chín quả màu đỏ nâu, mặt quả phủ lông mịn, cuống quả ngắn

Hầu hết các bộ phận của cây có chứa nhựa, thành phần gồm: cao su 2.4%, resin,albumin, cerin, malic acid, renin, protease, diatase, esterase, lipase, đường, catalase,peroxidase và đặc biệt là ficin (Nguyễn Đức Lượng, 2004).

Từ nhựa có thể tách chiết được enzyme ficin sử dụng cho quá trình làm mềm thịt,

làm tan máu bầm, hoặc lọc trong nước giải khát Ngoài ra, từ các cây giống Ficus

người ta còn tách chiết được một số hợp chất tự nhiên khác như: monoterpenoid,triterpenoid, các hợp chất phenol, flavonoid (Luisa et al., 2000)

2.2.3 Cấu tạo hóa học

Những kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học của enzyme ficin ở nhữngphòng thí nghiệm khác nhau thì khác nhau Tuy nhiên sự khác nhau này chấp nhậnđược vì có thể do tính đồng nhất của các chế phẩm enzyme thu được theo những tiếntrình khác nhau ở mỗi phòng thí nghiệm Ngoài ra, một trong những lý do dẫn đến sựkhác nhau này liên quan đến những hoạt chất có hoạt tính chuyên biệt được phân tách

ra từ dạng nhựa thô Bên cạnh đó, sự thu nhận chế phẩm enzyme ficin từ những loàikhác nhau cũng là một nguyên nhân quan trọng tạo nên sự khác nhau này (Sidney etal., 1970)

Theo Marini-Betolo (1963), Metrione (1963), Gould (1964) thu được kết quảthành phần các acid amin từ quá trình nghiên cứu chế phẩm enzyme ficin được tinhsạch chỉ bằng phương pháp tủa phân đoạn bởi muối trung tính Ngoài ra Englund(1968) đã xác định thành phần acid amin thu nhận từ quá trình tủa bằng muối và sắc

ký trên CM-cellulose

Bảng1 Thành phần amino acid của phân tử enzyme ficin

*số lượng các gốc amino acid/ 1 mol protein

Cấu trúc bậc I của ficin có chứa nhóm sulfhydryl (-SH) Trình tự các amino acid

ở gần trung tâm phản ứng khá giống với trình tự đã được tìm thấy của những protease thực vật như papain và bromelain

thiol-Tuỳ theo nguồn thu nhận enzymee ficin từ các loài khác nhau mà thành phần hóahọc sẽ khác nhau (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Hình 2 Trình tự các acid amin nằm ở vùng lân cận nhóm –SH hoạt động ở enzyme ficin so sánh với papain và bromelain (Whitaker, 1994)

a: kết quả được trình bày bởi R.C Wong và I.E Liener (1964) xác định trên chếphẩm ficin tinh sạch bởi muối

b: kết quả do A Light, R Frater, J.R Kimmel và E.L Smith (1964)

c: kết quả do L.P Chao và I.E Liener (1967), Husain và G Lowe (1968)

Tính tương đồng về trình tự của các acid amin nằm quanh vùng hoạt động củacác protease thực vật trên phản ánh một cơ chế xúc tác chung

2.2.4 Tính chất vật lý

Tùy theo nguồn thu nhận enzyme ficin mà tính chất vật lý của chúng khônggiống nhau Tuy nhiên sự khác nhau này không lớn Một bảng tóm tắt về những tínhchất vật lý nghiên cứu được được trình bày ở bảng 2 Tất cả các số liệu đều thu được

từ việc nghiên cứu trên các loài sung ở nước ngoài

Các kết quả ở bảng 3 tuy khác nhau nhưng sự chênh lệch không lớn Như vậychúng ta có thể xác định một số tính chất vật lý chung của enzyme ficin như sau:

Một số tính chất vật lý:

• Trọng lượng phân tử : 23000 – 27000 dalton

• Nhiệt độ có hoạt tính : 30 -800C Nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính xúc tác:50-65oC

Hệ số lắng (S 0 )

Trọng lượng phân tử

Điểm đẳng điện

Hệ số tinh sạch

Hệ

số tắt

Bước sóng (nm)

Tác giả

ký trên CM_cellulose, pH7

25.500±750 1,95 21,0 267 Englund

và Gutfreund

ký trên CM_cellulose, pH4,4

F carica var

Kadota

Mỗi hợp chất có hoạt tính được tách trực tiếp từ nhựa bằng sắc ký trên CM_cellulose, pH7

− Dịch nhựa tươi cây sung có pH = 5

− pH hoạt động của ficin khá rộng, từ pH 4-9,5

− pH tối thích (pHopt) của ficin phụ thuộc vào loại cơ chất của enzymee:gelatin : pHopt = 5, casein : pHopt= 9.5 , hemoglobin: pHopt =7 Đối với cơ chất nhân tạonhư benzoyl-L-arginine ethyl ester, benzoyl L-argininamide, hippurylamide vàhippuryl methylester thì pHopt= 6,5 (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

− Ở dạng nhựa tươi, ficin dễ bị oxy hoá bởi không khí làm cho dịch nhựachuyển sang màu hồng nâu hoặc nâu và đồng thời hoạt tính xúc tác bị giảm xuống

− Dưới tác dụng của các tác nhân oxy hóa, ficin bị mất hoạt tính

2.3.6 Hoạt động

a Cơ chế tác động

Hầu hết các tác giả đều thừa nhận vai trò nhóm –SH của cystein, nhómimidazole của histidine trong hoạt động thủy phân của ficin Nhóm –SH tham gia tạothành acyl-thioester trung gian với nhóm carboxyl của cơ chất (nơi các liên kết peptide

Ở giai đoạn đầu, Zn2+ rất quan trọng, chúng kết hợp với nhóm –SH của tâm hoạtđộng hình thành mercaptid phân ly yếu (nhưng vẫn còn khả năng tạo liên kết phối trí

bổ sung với các nhóm chức năng khác của phân tử protein như amin, carboxyl…)

Enzyme –SH +Zn2+ => enzyme-S-Zn + H+

Do vậy nhóm –SH trong tâm hoạt động đã bị ester hóa bởi cơ chất, cấu trúckhông gian được bảo vệ ổn định

b Sự hoạt hóa và bất hoạt của ficin

Giống như các hợp chất sinh học khác, ficin cũng bị ảnh hưởng bởi các yếu tốnhư nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại, một số nhóm chức,phương pháp ly trích, phương pháp tinh sạch

Các yếu tố hoạt hoá

Khi có mặt của các nhân tố kim loại kiềm như EDTA và các nhân tố khử như:cyanide, cystein, 1,2-dimercaptopropanol hoặc mercaptoethanol thì hoạt tính của ficin

sẽ tăng lên (Nguyễn Hữu Chấn, 1996)

Cystein hoặc 1,2-dimercaptopropanol nồng độ 0.005-0.05M có thể làm tăng hoạttính ficin ở dạng tinh thể và HCN 0.075M làm ficin có hoạt tính xúc tác cực đại so vớicác tác nhân hoạt hóa khác Hoạt tính ficin còn tăng cao hơn khi phối hợp HCN vớicystein (cao hơn khi sử dụng riêng lẻ HCN)

Các yếu tố kìm hãm

Do nhóm –SH tham gia trực tiếp vào các hoạt động xúc tác của ficin nên ficin bịbất hoạt bởi những chất có tác dụng kết hợp với lưu huỳnh như HgCl2, N-ethylmalenide, iodo acetic acid, chloroacetamide hay iodoacetamide

Một số chất kìm hãm hoạt động của các protease động vật cũng có thể làm bấthoạt ficin như: những dẫn xuất chloromethyl ceton của N-tosyl-L-phenyalanine và N-tosyl-L-lysine, diisopropylphosphofluoridae (DFP) do gốc cystein tối cần thiết cho xúctác của enzyme liên kết với các gốc này.(Lê Ngọc Tú, 1982)

1,3- dibromoacetone cũng gây ra sự bất hoạt ficin do nối với gốc cystein và vớigốc histidin cách xa gốc cystein phản ứng khoảng 5 Α0 .(Nguyễn Tiến Thắng, 1998)

Trong lòng trắng trứng có một loại protein có một loại protein có khả năng kìmhãm hoạt động của ficin Người ta cho rằng khi protein này kết hợp với ficin tạo ra

một phức hợp mang tính chất bất hoạt đã được tách chiết với nồng độ không đổi là1x10-9 M (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

c Tính chuyên biệt

Các liên kết peptide của nhiều loại protein tự nhiên như: protein sữa,hemoglobin, protein đậu nành, gelatin, collagen, elastin, fibrin, fibrinogen và cả loài

giun Ascaris sống đều có thể bị thuỷ giải bởi enzymee ficin

Ficin còn thể hiện tính chuyên biệt rộng liên quan đến thuỷ giải các liên kếtpeptide, este, các liên kết amide của cơ chất nhân tạo (Đỗ Tất Lợi, 1981)

Dựa vào công thức cấu tạo chung R’ - NH – CHR – CO – X, sự phân cắt nối –

CO – X được xác định khi gốc R là chuỗi bên của glycine, serine, threonine,methionine, lysine, arginine, citruline, leucine, isoasparagine và tyrosine Những cơchất có gốc R xuất phát từ alanine, phenylalanine hoặc tryptophan có thể đóng vai trònhư một chất cho hoặc nhận trong các phản ứng chuyển peptide (transpeptidation) doficin xúc tác Cấu phần X của các cơ chất này không những xuất phát từ các rượu,ammoniac, mercaptan, aniline, hoặc γ-nitrophenol Một nhóm benzoyl carbobenzoyl

đã được sử dụng như chất thay thế R’ của cơ chất nhân tạo (Nguyễn Hữu Chấn, 1996)

Sự khác biệt trong việc khảo sát tính chuyên biệt của ficin cũng được giải thíchbởi nguyên do: hầu hết các thí nghiệm đã được tiến hành với các chế phẩm enzymechưa tinh sạch và chế phẩm thu được là hỗn hợp nhiều hợp chất có hoạt tính riêng lẻ

và có thể bị biến đổi Englund (1968) đã khảo sát tính chuyên biệt của một hợp chất cóhoạt tính của chế phẩm ficin bằng cách cho nó phản ứng với chuỗi β đã được oxy hóacủa insulin, kết quả xác định được 7 điểm phân cắt chính xác và có 2 sự phân cắt khácđược đánh dấu phóng xạ

Mặc dù không có mô hình phân cắt có tính chuyên biệt nhưng dường như có một

sự ưu tiên thủy phân những liên kết peptide liên quan đến các acid amin thơm

d Tính bền vững (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Bền vững với nhiệt độ: W Cohen khi khảo sát tính bền vững của enzyme ficindạng tinh thể, Cohen nhận thấy chúng có thể giữ nguyên hoạt tính trong 2h ở 50oC.Dịch enzyme ficin sẽ bị mất hoạt tính qua thời gian bảo quản đông lạnh kéo dài mànguyên nhân có thể do từng phần của enzyme bị chuyển về dạng bất hoạt do hiệntượng oxi hoá

Bền vững với pH: trong một vùng pH khá rộng (4.5-9.5) độ bền vững củaenzyme ficin đạt đến mức cực đại Tuy nhiên trong một vùng pH hẹp dao động quanh

pH = 8 thì nó lại có tính bền vững ở mức tối thiểu Nguyên nhân là do một nhóm –SHtối cần thiết bị oxi hoá Tuy nhiên sự giảm tính bền vững ở pH này sẽ mất đi khi giatăng nồng độ cystein từ 0.01 lên 0.025M

Ficin có độ bền vững cực đại ở pH = 7.5 và pHopt trung bình ở khoảng 6-7.5

Từ một nghiên cứu về tính bền vững của 10 hợp chất trích từ nhựa cây F cariva

var Kadata, người ta đã phát hiện rằng 5 hợp chất vẫn giữ lại ít nhất 75% hoạt tính

của chúng sau 1h ở pH = 7; 550C, cũng với điều kiện như thế, 5 hợp chất còn lại ít bềnhơn

Sự tái hoà tan các kết tủa enzyme (sau khi tủa bằng muối ) vào trong nước haycác dung dịch muối dễ bay hơi có thể gây ra sự bất hoạt enzyme Do đó, để tránh đượchiện tượng này người ta thường hoà tan kết tủa enzyme vào dung dịch đệm phosphate0.01M, pH 7 có NaCl 0.1M và việc gắn enzyme lên các nhân tố mang như: Blue acid

83 (BB), Red acid 17 (BR), Brilliant Blue R, Bordeaux R, Jurga’s Red, Lin Red (LE),Jenelle’s Orange (JO)…đề làm tăng tính bền vững của enzyme (Ohmori et al., 1996)

e Một số yếu tố khác ảnh hưởng lên khả năng thủy phân protein của ficin

Nhiệt độ: Hoạt động thuỷ giải protein của enzyme ficin chịu ảnh hưởng rất nhiều

bởi nhiệt độ Trong khoảng nhiệt độ không làm biến tính enzyme , tốc độ phản ứngcủa enzyme tỉ lệ thuận với sự gia tăng nhiệt độ Mỗi enzyme có một nhiệt độ thích hợpnhất cho hoạt động xúc tác của enzyme, tại đó tốc độ phản ứng của enzyme đạt đến tối

đa Điểm nhiệt độ đó được gọi là nhiệt độ tối thích cho hoạt động cùa enzyme

Độ pH: Độ pH của môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ phản ứng của

enzyme Mỗi enzyme có một giá trị pH thích hợp nhất cho hoạt động của enzyme gọi

là pH tối thích, tại đó tốc độ phản ứng của enzyme đạt đến mức cực đại

Độ pH ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme do:

- Tác động vào trạng thái ion hoá của phân tử enzyme

- Tác động vào trạng thái ion hoá của cơ chất

- Tác động vào độ bền của phân tử enzyme

- Tác động vào sự kết hợp giữa phần protein và phi protein của phân tửenzyme… (Nguyễn Đức lượng, 2004)

2.2.7 Cơ chế xúc tác của thiol protease

Thiol protease còn có các tên khác là cystein proteinase hoặc sulfhydryl protease.

pHopt trung bình khoảng 6 - 7,5 Có khả năng bền nhiệt từ 60 – 800C ở pH tựnhiên Tâm hoạt động gồm 2 acid amin là cystein và histidine

Cơ chế thủy phân gồm 2 giai đoạn: acyl hóa và đề acyl hóa

Hình 3 Cơ chế xúc xác của thiol protease 2.2.8 Một số ưng dụng của enzyme ficin

a Trong công nghiệp thực phẩm

- Trong lĩnh vực chế biến thịt: ficin được dùng để thủy phân một phần cácprotein tham gia cấu trúc kết quả là tăng chất lượng thịt, giảm thời gian chế biến

- Trong công nghiệp chế biến sữa và các sản phẩm từ sữa: Trong sản xuấtfomage, người Âu Mỹ dùng ficin thay thế cho rennin trong giai đoạn làm đông tụ sữa.Ficin là enzyme có khả năng làm đông tụ sữa tốt mà ít thủy phân sâu casein do đó ítảnh hưởng xấu đến chất lượng fomage Ficin được gọi là một rennin thực vật (Judie,1991)

Ficin cũng được dùng để bảo quản những sản phẩm chứa protein trong sữa, bơ vàsữa khô bằng cách làm giảm hiệu quả chịu nhiệt của kappa casein ở mức thấp nhất vàlàm cho vật liệu của sữa chịu đựng được tốt quá trình xử lý nhiệt hoặc thanh trùngPasteur (Hà Duyên Tư, 2000)

- Trong công nghiệp sản xuất bia: tăng cường độ bền của bọt bia và làm giảm độđục của bia trong suốt thời gian bảo quản (Ngô Tuấn Kỳ, 1998)

- Trong công nghiệp chế biến rau, củ, quả: Nguyên liệu rau, củ, quả tươi trongquá trình sơ chế khi bóc vỏ, cắt lát (khoai tây, táo ) thường bị hóa nâu do quá trìnhoxy hóa các hợp chất tự nhiên dưới tác dụng của một enzyme có sẵn trong nguyênliệu Trước đây người ta thường dùng sulfite (SO2) để tránh hiện tượng này Sự hóanâu này cần 4 yếu tố: O2, Cu, một enzyme (thường là polyphenol oxidase – PPO) vàmột cơ chất Cũng như papain, bromelain, ficin được dùng như một yếu tố kìm hãmphản ứng hóa nâu do enzyme Tác dụng thủy phân protein của ficin gây nên sự bấthoạt của enzyme gây phản ứng hóa nâu (Whitaker, 1994)

b Trong y học

Chế phẩm enzyme ficin chưa được ứng dụng nhiều, tuy nhiên người ta đã sửdụng enzyme này làm thuốc xổ giun, trị các bệnh do ký sinh trùng đường ruột gây ra,loét da, đau họng, dùng làm thuốc thử tế bào máu (Sidney et al., 1970)

Ở Việt Nam, enzyme ficin tinh sạch chưa phổ biến và chưa được dùng trong yhọc nhưng từ lâu, nhân dân ta coi nhựa sung, nguồn thu nhận của enzyme ficin là một

vị thuốc quí để chữa nhức đầu và một số bệnh ngoài da (chốc, nhọt, sưng đau, tụmáu ) (Đỗ Tất Lợi, 1981)

c Trong các lĩnh vực khác

Enzyme ficin có khả năng kìm hãm hiện tượng Melanosis (đốm đen) ở loài tôm

hồng (Penaeus duorarum) một cách đáng kể Ficin tác động như một chất thay thế cho

các sulfite trong việc tránh khỏi sự hình thành các chấm đen dưới điều kiện bảo quảnđông lạnh hơn một tuần Người ta cho rằng mô hình tác động của enzyme ficin là sựkìm hãm lên enzyme polyphenol oxydase, tác nhân gây nên hiện tượng xuất hiện đốmđen ở tôm

Ở các nước Âu Mỹ trước đây, ficin là một thành phần trong nước rửa chén Saunày nó không được dùng nữa vì người ta thấy nó có tác dụng xấu đối với da

Bên cạnh đó, ficin còn được dùng trong việc nghiên cứu sự thủy phân thức ăncho bò và một số ứng dụng trong lĩnh vực thú y (Whitaker, 1994)

d Một số chế phẩm enzyme ficin thương mại

Ficin thương mại là hỗn hợp một số protease và một ít peroxidase cộng thêm chấtđộn (đường hoặc bột), màu nâu nhạt, không mùi hoặc có thể là nhựa sung tươi đượctrích từ thân sau đó lọc rồi sấy phun hoặc đem sấy rồi nghiền thành bột

Enzyme Wied N: Chứa hỗn hợp của các enzyme thực vật như: bromelain,

papain, lipase, amylase, ficin, chiết xuất hạt nho và cây cà chua bổ sung vào chế độ ăn

hỗ trợ tiêu hóa giúp tăng cường chức năng đường ruột, tăng khả năng bảo vệ tế bào bởi

các vi sinh vật

Enzyme-Mix: Kết hợp các enzymee bromelain các enzyme bromelain từ quả

dứa, papain từ quả đu đủ và ficin từ quả sung hỗ trợ tiêu hóa protein

Ficin: hỗ trợ tiêu hóa

2.3.7 Tình hình nghiên cứu về enzyme ficin

Nghiên cứu tại Universidade Federal de Rio de Janeiro (Brazil) ghi nhận ficin

trích từ F carica khi cho dùng liều 3ml/kg/ngày trong 3 ngày liên tiếp, có hoạt tính tiêu diệt các loại giun Syphacia obvelata (41.7%) nơi chuột (Journal of

Ethnopharmacology, 1999)

Nghiên cứu tại ÐH Y học Ardabil (Iran) so sánh hoạt tính trừ mụn cóc của ficin

từ Ficus carica với phương pháp điều trị bằng sinh hàn (cryotherapy) ghi nhận kết quả

nơi 25 người: ficin có nhiều tác dụng tốt như thời gian trị liệu đuợc rút ngắn, khôngxẩy ra các phản ứng phụ, dễ sử dụng và mức độ tái nhiễm thấp hơn (theo dõi trong 6

Hình 4 Chế phẩm

Enzyme Wied N Hình 5 Chế phẩm Enzyme-Mix Hình 6 Chế phẩm Ficin

tháng) 11 bệnh nhân lành hẳn sau khi dùng ficin so với 14 bệnh nhân dùngcryotherapy (International Journal of Dermatology, 2007)

Nghiên cứu tại Truờng Y Tế Cộng đồng, ÐH Sơn đông (Trung Quốc) ghi nhận

ficin trích từ lá Ficus carica có các hoạt tính kháng HSV khi thử trên các dòng tế bào

Hep-2, BHK21 và PRK Các liều MTC là 0.5 mg/ml ; TDO là 15 mg/ml và TI là 30mg/ml (Chinese Pharmaceutical Journal, 2004)

Nghiên cứu ngăn chặn sự hóa nâu ở rau củ trong quá trình sản xuất thực phẩmbằng phương pháp sử dụng enzyme ficin (McEvily et al., 1992)

2.3 Kỹ thuật cơ bản chuẩn bị dịch protein thô chứa enzyme

2.3.1 Những nguyên tắc chung khi nghiên cứu enzyme

Enzyme là những chất xúc tác sinh học có bản chất protein và rất không ổn định.Trong những điều kiện bất lợi, chúng rất không bền, có thể dễ dàng bị biến tính(denaturation) và bị mất hoạt độ Do đó, khi làm việc với enzyme, phải luôn luôn chú

ý tránh những điều kiện dễ làm mất hoạt độ của nó Thông thường phần lớn cácenzyme hoạt động được ở vùng pH trung tính hoặc gần như trung tính (pH 7.2) Vìvậy các yếu tố acid mạnh, kiềm mạnh dễ gây biến tính enzyme

Những ion kim loại nặng như chì, đồng, thủy ngân và các điều kiện về nhiệt độcao cũng thường làm mất hoạt độ enzyme Đặc biệt là khi tách và làm sạch enzyme,cần tiến hành ở nhiệt độ thấp (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Nhiệt độ thường dùng cho các công việc này thông thường từ 00C đến 50C Đốivới các enzyme không bền, các công đoạn làm sạch có thể được tiến hành ở nhiệt độthấp hơn (từ - 50C đến - 200C) Trong các trường hợp này, người ta hay sử dụng cáchỗn hợp lạnh như nước đá với CO2 hoặc nước đá với muối NaCl, hoặc thậm chí người

ta dùng cả hỗn hợp nước đá với sulfuric acid đậm đặc

Như trên đã nói, nhiều enzyme bị mất hoạt tính ở các dung dịch có pH < 5hoặc pH > 9, tuy rằng có một số ngoại lệ như pepsin bền trong acid Do đó, tùythuộc mỗi loại enzyme, song nên chú ý tránh pH quá acid hoặc quá kiềm Khi điềuchỉnh pH của dung dịch đệm có chứa enzyme cần phải thêm từ từ và rất thận trọngcác acid hoặc kiềm Và khi thêm hóa chất để điều chỉnh pH thì nên tiến hành ở 00C.Khi làm việc với enzyme cũng cần chú ý tránh tạo bọt vì nhiều enzyme bị biến tính(mất hoạt tính) ở mặt phân cách hai pha nước và khí Để tránh việc tạo bọt có thể

xảy ra, người ta thường rót dung dịch enzyme theo thành ống thủy tinh và khôngđược lắc Có khi việc tách từng phần enzyme bằng bột dễ làm mất hoạt tínhenzyme Vì vậy, để khắc phục tình trạng này, người ta thường thêm ammoniumsulfate dưới dạng dung dịch bão hòa.

Trong khi xử lý các mẫu thí nghiệm như cắt, thái, xay nhỏ các mẫu thực vật

và động vật (ví dụ lá cây, thịt, các cơ quan nội tạng ) không dùng các dụng cụ, daokéo đã han rỉ để tránh tác dụng của các ion kim loại nặng như (Cu, Pb, Fe ) mà phảidùng dụng cụ inox (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Khi dùng các dung môi hữu cơ như aceton, alcol để kết tủa enzyme cầntiến hành ở nhiệt độ thấp Tách kết tủa enzyme bằng cách ly tâm lạnh tốt hơn lọclạnh vì tiến hành nhanh hơn Ở một số trường hợp, khi tách và làm sạch enzyme cóhiện tượng giảm dần hoạt độ, vì vậy cần phải làm thí nghiệm nhanh Tốt nhất làthực hiện thí nghiệm liên tục, không ngắt quảng Ví dụ: tách chiết các enzymechống oxy hóa (antioxidant enzyme) ở ty thể trong vòng 6h và đo luôn nếu không thìmất hoạt tính Còn ở microsome thì tiến trình có thể kéo dài hơn vẫn khôngảnh hưởng đến hoạt độ các enzyme chống oxy hóa và các enzyme oxy hóakhử

Một điều cần chú ý nữa là trong khi tiến hành xác định hoạt độ của các enzyme,nếu đã xác định trong khoảng nhiệt độ nào thì tất cả các thành phần của hỗn hợp phảnứng phải được giữ ở nhiệt độ ấy Lúc này nhất thiết phải dùng máy ổn nhiệt(thermostate) Khi hỗn hợp phản ứng đã đạt được nhiệt độ cần thiết thì mới tiến hành

đo pH trong quá trình này cũng phải được giữ ổn định bằng dung dịch đệm và phảiđảm bảo độ chính xác của pH những phản ứng tạo acid thì phải thêm kiềm vào vàngược lại Để đảm bảo kết quả tin cậy, tránh sai số nhiều, phải lấy thật chính xáclượng dịch enzyme Người ta thường dùng loại pipette không chia độ hoặc sau nàydùng các loại micropipette Trong khi thí nghiệm cần chú ý tránh đánh rơi enzymevào dung dịch nghiên cứu Ví dụ đang làm thí nghiệm với amylase chẳng hạn thìkhông nói chuyện nhiều Khi đã có chế phẩm enzyme, cần bảo quản chúng ởnhiệt độ thấp Một số enzyme ổn định ở dung dịch đậm đặc của ammonium sulfate.Trong trường hợp này, người ta giữ các kết tủa ở dạng huyền phù trong dung dịchammoni sulphate bão hòa và lấy chế phẩm ra bằng cách ly tâm Trong điều kiệnphòng thí nghiệm, việc sấy khô chế phẩm enzyme sẽ làm mất hoạt độ enzyme hoàn

toàn Nhưng ở điều kiện chân không nếu sấy khô ở nhiệt độ thấp hoặc dùngphương pháp đông khô (lyophilization) thì có thể duy trì được hoạt động bìnhthường của chúng.

2.3.2 Một số phương pháp tinh sạch enzyme

Tinh sạch enzyme là một quá trình tách chiết, thu nhận và loại bỏ các tạp chấtkhông cần thiết nhưng đặc biệt là enzyme vẫn giữ được hoạt tính sau quá trình tinhsạch Đồng thời các phương pháp sử dụng để tinh sạch enzyme phải phụ thuộc vàohoạt tính, độ ổn định của enzyme vào pH, nhiệt độ, lực ion, tính hòa tan và tính bềnvững trong các dung môi hữu cơ, trong dung dịch muối… Người ta thường dùng cácphương pháp sau đây để tinh sạch enzyme:

a Phương pháp tách chiết enzyme dựa trên tính hòa tan

Kết tủa bằng muối (Wang, 2001)

Đây là phương pháp kết tủa protein nhờ vào sự bổ sung muối trung tính ở nồng

độ cao vào dung dịch protein Protein tồn tại trong dung dịch nhờ sự cân bằng giữacác lực tĩnh điện và các tương tác kỵ nước nên khi thêm muối ở nồng độ cao thì sựcân bằng sẽ bị phá vỡ làm chúng tạo tủa lắng xuống

Các phân tử protein trong dung dịch được một lượng nước che chắn, bao bọccác phần tử kỵ nước trên bề mặt phân tử protein cản trở các phân tử protein tương tácvới nhau Khi dung dịch có nồng độ muối cao sẽ tranh giành lớp vỏ nước làm cholượng nước liên kết giảm đi nên các protein có thể tương tác lẫn nhau tạo sự lắng tủa Người ta có thể sử dụng các loại muối khác nhau để lắng tủa protein như:nitrate, sulfate, phosphate, amoni, kali, natri…dựa trên cơ sở sự khác nhau về khảnăng kết tủa tủa các protein enzyme ở một nồng độ muối (tính theo phần % nồng

độ bão hòa) xác định được dùng phổ biến để loại bỏ bước đầu protein tạp của cácdịch enzyme Tuy nhiên trong thực tế phòng thí nghiệm người ta thường dùng muốiamonium sulfate (NH4)2SO4 thêm vào dạng dung dịch bão hòa hoặc tinh thể để tủaphân đoạn loại bỏ những enzyme phi protein Khi thu được tủa protein người ta sẽdùng phương pháp thẩm tích để loại muối

Người ta đã nhận thấy muối (NH4)2SO4 là tốt nhất vì nó không ảnh hưởng màcòn giúp ổn định (làm bền) hầu hết các loại enzyme Loại muối này lại rẻ và phổbiến Độ hòa tan của nó lại rất lớn (bão hòa 767g/l ở 250C) Nồng độ (NH4)2SO4 cầnthiết để kết tủa enzyme khác nhau thì khác nhau Thường dùng hai dạng tinh thể hoặc

bão hòa

- Khi dùng dạng tinh thể:

Người ta cho từng ít một vào dịch chiết enzyme Cách cho cũng ảnh hưởng lớnđến lượng kết tủa ban đầu của enzyme Khi cho muối vào dịch chiết cần phải có máykhuấy từ để đảm bảo sự hòa tan của muối

- Khi dùng dung dịch bão hòa:

Cần tra bảng tính số lượng muối cần thiết để pha các dung dịch có độ bãohòa khác nhau ở những nhiệt độ nhất định, enzyme có thể bị kết tủa ở 50% (0,5)hoặc 70% (0,7) của độ bão hòa hoàn toàn của (NH4)2SO4 Khi cho dung dịch(NH4)2SO4 vào dịch chiết enzyme thì nồng độ(NH4)2 SO4 không tăng đột ngột

Sau khi kết tủa xong người ta thường để lắng khoảng 2h hoặc để qua đêm,mục đích là tạo kết tủa hoàn toàn Kết tủa được lấy ra bằng cách ly tâm hoặc lọcqua phễu Buckner Khi hòa tan kết tủa lại người ta thường thêm ion Ca++ làm bền(CaCl2 hoặc Ca(COOH)2)

Người ta cũng có thể dùng bản đồ toán (nomogram) để chiếu và xác địnhđược lượng (NH4)2SO4 thêm vào để dung dịch enzyme đạt được một độ bão hòa nhấtđịnh Hoặc có thể đối chiếu ở bảng có sẵn Lượng (NH4)2SO4 đưa vào để dungdịch có độ bão hòa nhất định có khác nhau tùy thuộc nhiệt độ thí nghiệm

Ở giai đoạn loại muối, người ta dùng phương pháp thẩm tích Thời gian thẩmtích thường là 24 - 48h, nước thay càng nhiều càng nhanh càng tốt

Có thể loại muối bằng cách lọc gel Ưu thế của phương pháp này là tiến hànhvới thời gian ngắn nên không làm mất hoạt độ enzyme

Giai đoạn tiếp theo là làm đông khô thành bột trắng Chuyển trạng thái từ dịchnước đá sang trạng thái khí mà không qua trạng thái lỏng

Kết tủa bằng dung môi hữu cơ

Trong nhiều quy trình sản xuất quy mô lớn người ta thường dùng phương phápnày để kết tủa protein Để đạt hiệu quả lắng tủa, dung môi phải trộn đều hoàn toàn vớinước và có tính ưa nước để tránh làm biến tính protein Sự bổ sung dung môi hữu cơ

có tác dụng làm giảm khả năng liên kết của nước quanh phân tử protein (NguyễnHữu Chấn, 1996)

Phương pháp này được tiến hành dựa trên cơ sở: độ hòa tan của protein phụthuộc vào sự tương tác của các nhóm tích điện trong phân tử protein với các phân tử

nước Sự tương tác đó (còn gọi là sự hydrate hóa) sẽ bị giảm xuống khi thêm vàodung dịch enzyme các dung môi hữu cơ Dung môi hữu cơ thường dùng là ethanol,isopropanol, acetone hoặc hỗn hợp các loại rượu (Whitaker, 1994)

Ở phương pháp này cũng chú ý tiến hành ở nhiệt độ thấp (từ 50C trở xuống).Dùng dung môi hữu cơ có thể tiến hành tách phân đoạn dưới 00C và có thể đến -200C,như vậy nó có tác dụng tốt đến độ ổn định cấu trúc không gian của protein enzyme.Khi đã có kết tủa, chú ý lấy nhanh kết tủa ra khỏi dung môi bằng cách dùng máy

li tâm Phương pháp này có lợi thế là không cần loại muối, nhưng có nhược điểm làdung dịch thường có màu và có thể xảy ra khả năng biến tính không thuận nghịch củaprotein (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

b Phương pháp sắc ký cột

Phương pháp dùng chất rây phân tử (lọc gel - gel filtration)

Cơ sở của phương pháp lọc gel là dựa vào sự khác nhau về kích thước hình dạng

và phân tử lượng của enzyme có trong hỗn hợp để tách chúng ra

Gel là mạng lưới phân tử có cấu trúc không gian 3 chiều ghép hở ở dạng hạt.Các lỗ bên trong hạt có kích thước trong một mức độ nào đó chúng chỉ cho nhữngphân tử nhỏ vừa hoặc nhỏ hơn đi qua mà các phân tử lớn hơn không đi qua được.Nguyên tắc chung của phương pháp này là dùng để tách các phân tử có trọnglượng phân tử khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel Những phân tử có kíchthước đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel sẽ bị trì hoãn và di chuyển chậm qua cộttrong khi các phân tử lớn hơn di chuyển bên ngoài các hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh

và rửa giải ra khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ

Gel sephadex là loại thường được sử dụng Sephadex là tên gọi của các dextran

mạng alkyl hóa (do các loài vi sinh vật khác nhau là Leuconostoc tạo ra khi chúng

được nuôi cấy trên môi trường chứa saccharose) Trọng lượng phân tử của dextran có

Hình 7 Hoạt động của phân tử sephadex