Hoạt tính protease.
3.2.2. Thí nghiệm 2: Xác định tỉ lệ pha lỗng mủ sung bằng nước cấta. Mục đích a. Mục đích
Xác định lượng nước cho vào mủ sung để hòa tan tối đa enzyme trong mủ sung.
b. Tiến hành thí nghiệm
Mủ sung được pha lỗng với nước cất pH = 7.0 theo các tỉ lệ (w/v): 1:1, 1:2, 1:3, 1:4
Để yên dung dịch trong khoảng 10-15 phút sau đó tiến hành ly tâm với tốc độ 13.000 vịng/phút (rpm) trong 10 phút sau đó thu lấy dịch trong.
Đo hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford, đo hoạt tính protease bằng phương pháp Anson cải tiến.
c. Chỉ tiêu đánh giá
Hàm lượng protein Hoạt tính protease
3.2.3. Thí nghiệm 3: Xác định tác nhân tủa thu enzyme a. Mục đích a. Mục đích
Xác định tác nhân tủa và lượng tối ưu cần dùng cho kết tủa có hàm lượng protein và hoạt tính protease cao nhất.
b. Tiến hành thí nghiệm
Phương pháp tủa bằng tác nhân tủa là các dung mơi hữu cơ (acetone và ethanol)
Ngun tắc: độ hịa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc nhiều yếu tố, một
trong số đó là hằng số điện mơi của dung dịch. Nhìn chung, những phân tử dung mơi có hằng số điện mơi lớn (nước, dimethylsulphoxide) có thể ổn định các tương tác giữa chúng với các phân tử protein và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của protein trong dung dịch. Ngược lại, độ hòa tan của những phân tử protein giảm và xảy ra sự kết tủa do sự làm giảm hằng số điện môi hữu hiệu của mơi trường. Điều này có được bằng cách thêm một dung môi tan trong nước vào dung dịch chứa protein. Sự tủa bằng acetone hoặc ethanol có nhiều thuận lợi vì nó tương đối rẻ, có sẵn ở dạng tinh khiết với ít chất tạp nhiễm gây ức chế đối vơi enzyme. Do nhiệt độ bay hơi của dung môi thấp nên dễ tách bỏ dung mơi khỏi chế phẩm enzyme.
Tiến hành thí nghiệm:
o Kết tủa ficin bằng aceton và ethanol lạnh với các tỉ lệ lần lượt là 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 (v/v)
o Để yên dung dịch sau khi tủa trong một khoảng thời gian từ 15-20 phút.
o Ly tâm lạnh hỗn hợp với tốc độ 10.000rpm trong 10 phút, thu kết tủa.
o Hòa tan protein tủa trong buffer Tris-HCl 0.05M pH 8.5
o Đo hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford, đo hoạt tính protease bằng phương pháp Anson cải tiến.
Tủa phân đoạn bằng muối amonium sulfate
nhau, trong đó có yếu tố nồng độ muối trong dung dịch. Tại nồng độ muối thấp, sự hiện diện của muối giúp ổn định các nhóm chức năng khác nhau của một phân tử protein, vì vậy giúp protein tan trong dung dịch và làm tăng tính hịa tan của protein (salting-in). Tuy nhiên, nồng độ muối tăng lên đạt đến mức hòa tan cực đại của protein và nếu càng tăng nồng độ muối thì sự hịa tan càng giảm và làm cho protein bắt đầu kết tủa.
Tiến hành thí nghiệm:
o Kết tủa phân đoạn enzyme ficin bằng muối amonium sulfate với các nồng độ lần lượt là 30%, 40%, 50%, 60%.
o Để yên dung dịch sau khi tủa trong một khoảng thời gian từ 30-60 phút.
o Ly tâm lạnh hỗn hợp với tốc độ 10.000 rpm trong 10 phút, thu kết tủa.
o Hòa tan protein tủa với buffer Tris-HCl 0,05M pH 8.5
o Đo hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford, đo hoạt tính protease bằng phương pháp Anson cải tiến.
o Thu nhận enzyme ficin và xác định nồng độ muối trích ly hiệu quả nhất..
c. Chỉ tiêu đánh giá
Hàm lượng protein. Hoạt tính protease. Hiệu suất tinh sạch.
3.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát mợt số yếu tố ảnh hưởng lên khả năng thủyphân protein của enzyme ficin phân protein của enzyme ficin