NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENYME PROTEASE TỪ RUỘT CÁ DIÊU HỒNG

N LIỆU .................................................................................................... 8 2.2.HÓA CHẤT .......................................................................................................... 8 2.3.THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ ...................................................................................... 8 2.4.THỰC HIỆN ........................................................................................................ 9 2.5.CÁC PHƯƠNG PHÁP ....................................................................................... 10 2.5.1.Định lượng protein bằng phương pháp Biuret ........................................... 10 2.5.2.Xác định hoạt tính của protease bằng phương pháp Anson cải tiến .......... 11 2.5.3.Phương pháp sắc ký lọc gel ....................................................................... 12 2.5.4.Phương pháp điện di .................................................................................. 13 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................................ 16 3.1.KẾT QUẢ ........................................................................................................... 16 3.1.1.Đường chuẩn xác định hàm lượng protein theo PP Biuret ........................ 16 3.1.2. Đường chuẩn xác định hoạt tính enzyme theo PP Anson cải tiến ............ 16 3.1.3.Kết quả lọc gel ........................................................................................... 17 3.1.4.Kết quả xác định hoạt tính enzyme, hàm lượng protein có trong mẫu ....... 17 3.1.5.Kết quả điện di ........................................................................................... N LIỆU .................................................................................................... 8 2.2.HÓA CHẤT .......................................................................................................... 8 2.3.THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ ...................................................................................... 8 2.4.THỰC HIỆN ........................................................................................................ 9 2.5.CÁC PHƯƠNG PHÁP ....................................................................................... 10 2.5.1.Định lượng protein bằng phương pháp Biuret ........................................... 10 2.5.2.Xác định hoạt tính của protease bằng phương pháp Anson cải tiến .......... 11 2.5.3.Phương pháp sắc ký lọc gel ....................................................................... 12 2.5.4.Phương pháp điện di .................................................................................. 13 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................................ 16 3.1.KẾT QUẢ ........................................................................................................... 16 3.1.1.Đường chuẩn xác định hàm lượng protein theo PP Biuret ........................ 16 3.1.2. Đường chuẩn xác định hoạt tính enzyme theo PP Anson cải tiến ............ 16 3.1.3.Kết quả lọc gel ........................................................................................... 17 3.1.4.Kết quả xác định hoạt tính enzyme, hàm lượng protein có trong mẫu ....... 17 3.1.5.Kết quả điện di ........................................................................................... N LIỆU .................................................................................................... 8 2.2.HÓA CHẤT .......................................................................................................... 8 2.3.THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ ...................................................................................... 8 2.4.THỰC HIỆN ........................................................................................................ 9 2.5.CÁC PHƯƠNG PHÁP ....................................................................................... 10 2.5.1.Định lượng protein bằng phương pháp Biuret ........................................... 10 2.5.2.Xác định hoạt tính của protease bằng phương pháp Anson cải tiến .......... 11 2.5.3.Phương pháp sắc ký lọc gel ....................................................................... 12 2.5.4.Phương pháp điện di .................................................................................. 13 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................................ 16 3.1.KẾT QUẢ ........................................................................................................... 16 3.1.1.Đường chuẩn xác định hàm lượng protein theo PP Biuret ........................ 16 3.1.2. Đường chuẩn xác định hoạt tính enzyme theo PP Anson cải tiến ............ 16 3.1.3.Kết quả lọc gel ........................................................................................... 17 3.1.4.Kết quả xác định hoạt tính enzyme, hàm lượng protein có trong mẫu ....... 17 3.1.5.Kết quả điện di ...........................................................................................

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CƠNG NGHỆP PROTEIN ENZYME ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENYME PROTEASE TỪ RUỘT CÁ DIÊU HỒNG GVDH: Trần Trúc Thanh Lê Thanh Ân Phúc Nguyễn Thị Tuyết Sương Nguyễn Thị Minh Thương Phùng Thị Trâm 2018-2019 1612642 1612999 1613486 1613663 MỤC LỤC CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU 1.1.TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 1.1.1.Trong nước 1.1.2.Ngoài nước 1.2.TỔNG QUAN VỀ CÁ DIÊU HỒNG Ở VIỆT NAM 1.3.ENZYME HỆ TIÊU HÓA 1.3.1.Đặc điểm chung enzyme hệ tiêu hóa 1.3.2.Sự sản sinh enzyme hệ tiêu hóa 1.3.3.Đặc điểm tính chất số enzyme protease hệ tiêu hóa 1.3.3.1.Giới thiệu chung 1.3.3.2.Phân loại 1.3.3.3.Những enzyme protease có nhiều ruột cá 1.3.4.Ứng dụng chế phẩm enzyme protease hệ tiêu hóa cá CHƯƠNG II: VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP 2.1.NGUYÊN LIỆU 2.2.HÓA CHẤT 2.3.THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ 2.4.THỰC HIỆN 2.5.CÁC PHƯƠNG PHÁP 10 2.5.1.Định lượng protein phương pháp Biuret 10 2.5.2.Xác định hoạt tính protease phương pháp Anson cải tiến 11 2.5.3.Phương pháp sắc ký lọc gel 12 2.5.4.Phương pháp điện di 13 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 16 3.1.KẾT QUẢ 16 3.1.1.Đường chuẩn xác định hàm lượng protein theo PP Biuret 16 3.1.2 Đường chuẩn xác định hoạt tính enzyme theo PP Anson cải tiến 16 3.1.3.Kết lọc gel 17 3.1.4.Kết xác định hoạt tính enzyme, hàm lượng protein có mẫu 17 3.1.5.Kết điện di 17 3.2.BÀN LUẬN 18 3.2.1.Khả trích ly enzyme muối Na2CO3 1,2% 18 3.2.2.Rửa tủa enzyme dung môi hữu Acetone 18 3.2.3.Ly tâm tách enzyme khỏi dung môi 19 3.2.4.Bảo quản enzyme 19 3.2.5.Lọc gel Bio-gel P100 19 3.2.6 Điện di 20 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình 1.2 HÌnh 1.3 Hình 2.1 12 Hình 2.2 13 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Bảng 2.2 Bảng 2.3 Bảng 2.4 13 CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU Theo ghi nhận, sản lượng khai thác thủy sản giới đạt tới hàng trăm triệu tấn, có 50% dùng để chế biến làm thức ăn cho người Và có khoảng 30% sản lượng thật người tiêu thụ, phần lại trở thành phế phụ phẩm.[1] Trong năm gần đây, diện tích ni trồng thủy sản nước ta tăng cao Đặc biệt cá diêu hồng, loài cá nước dễ nuôi với suất cao (cao 80-100 con/m3 /vụ) người tiêu dùng nước ngồi nước ưa chuộng chất lượng thịt cao xương Người tiêu dùng ưa chuộng làm sản lượng cá diêu hồng tăng cao Mà sản lượng cao mối quan tâm nguồn phế phụ phẩm tăng theo Phụ phẩm thủy sản thường nội tạng, đầu, xương, da Để giải lượng lớn phụ phẩm nay, Việt Nam giới có xu hướng tận thu phần phụ phẩm để chế biến thành sản phẩm có giá trị gia tăng Bột cá thường dùng làm thức ăn gia súc, gia cầm; dầu cá dưỡng chất khác có ứng dụng to lớn lĩnh vực y học, dược phẩm, thực phẩm như: chế phẩm enzyme, peptide có hoạt tính sinh học, màng sinh học, mang lại hiệu kinh tế lớn cho người Với tình hình nước ta nay, phụ phẩm thủy hải sản cá diêu hồng chủ yếu sử dụng làm thức ăn cho gia súc, gia cầm, phân bón, Việc thu nhận phụ phẩm dùng để sản xuất chế phẩm ezyme protease vấn đề cần quan tâm khai thác Từ thực tế ghi nhận, tiến hành thực đề tài “Nghiên cứu thu nhận enzyme từ ruột cá diêu hồng” Trong nghiên cứu này, tiến hành thực nghiên cứu sau: - Khảo sát hoạt tính enzyme ruột cá diêu hồng (Oreochromis sp.) Khảo sát hàm lượng protein Thu nhận chế phẩm enzyme thô Tinh enzyme cột lọc gel Điện di xác định khối lượng loại enzyme thu 1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 1.1.1 Trong nước Hầu phản ứng hoá học thể sống cần phải có vai trò xúc tác enzyme - chất xúc tác sinh học Chính vậy, nghiên cứu enzyme thu hút quan tâm cán hoá sinh học, sinh học thực nghiệm nhiều nhà nghiên cứu lĩnh vực liên quan khác Các nghiên cứu nhằm theo hướng tách, tinh enzyme, tạo chế phẩm có độ khác nhau, nghiên cứu cấu trúc, mối liên quan cấu trúc hoạt tính sinh học enzyme, khả ứng dụng enzyme thực tế Nghiên cứu công nghệ enzyme tiến hành nhiều tác sử dụng phủ tạng lò mổ để sản xuất pancrease, pepsin, trypsin Đã có thử nghiệm cơng nghệ sản xuất amino acid từ nhộng tằm protease, bột protein thịt bromelain từ đọt dứa, lên men rượu enzyme cố định cột Đặc biệt, có nhiều nghiên cứu nội tạng cá để thu nhận enzyme protease: cá basa, cá tra, 1.1.2 Ngoài nước: Trong năm gần đây, giá trị thương mại enzyme công nghiệp toàn giới đạt khoảng tỷ USD, chủ yếu enzyme thủy phân (75%), protease ba nhóm enzyme lớn sử dụng công nghiệp (60%) 1.2 TỔNG QUAN VỀ CÁ DIÊU HỒNG Ở VIỆT NAM Cá điêu hồng hay cá diêu hồng hay gọi cá rơ phi đỏ (danh pháp khoa học: Oreochromis sp.) loài cá nước thuộc họ Cá rơ phi (Cichlidae) có nguồn gốc hình thành từ lai tạo Thuật ngữ diêu hồng hay điêu hồng xuất phát từ việc dịch từ tiếng Trung Quốc Ở Việt Nam, người dân xứ gọi cá diêu hồng cá rơ chúng có hình dạng màu sắc giống Cá diêu hồng lồi cá nước ngọt, hình thành qua q trình chọn lọc nhân tạo nên mơi trường sống chủ yếu ni nhốt Cá thích hợp với nguồn nước có độ pH: 6,2 – 7,5, khả chịu phèn phát triển tốt vùng nước nhiễm mặn nhẹ – 12‰ , cá sống tầng nước Cá thịt nuôi ao lồng bè Sản lượng cá đạt 800-900g/con từ – 4,5 tháng tỷ lệ hao hụt thấp Cá diêu hồng chăn nuôi chủ yếu miền Nam bộ, tập trung đồng sơng Cửu Long, nơi có điều kiện thổ nhưỡng, thủy lưu thích hợp cho lồi cá Hiện nay, cá diêu hồng ni với hình thức lồng bè với số lượng lớn, cho mẻ cá đồng kích thước chất lượng 1.3 ENZYME HỆ TIÊU HÓA 1.3.1 Đặc điểm chung enzyme hệ tiêu hóa Sự tiêu hóa thức ăn động vật gồm chủ yếu chuỗi q trình hóa sinh xảy miệng, dày, ruột làm gảm kích thước phân tử làm hòa tan thành phần thức ăn enzyme tiêu hóa.[2] Thực phẩm bao gồm thành phần protein, cacbonhydrat, chất béo, nước, chất khống lượng nhỏ nguyên tố khác Cơ chế xác tiêu hóa chúng (sự tiêu hóa, hấp thụ sử dụng) phức tạp enzyme tiêu hóa góp phần cần thiết vào q trình Một vài enzyme tiêu hóa:[3] - Enzyme pepsin - Enzyme trypsin - Enzyme chymotrypsin - Enzyme cacboxypaptidase - Enzyme aminopeptidase - Enzyme ligase - Enzyme amylase Enzyme matase Enzyme nuclease 1.3.2 Sự sản sinh enzyme hệ tiêu hóa: Enzyme tiêu hóa sản sinh tuyến khác như: tuyến nước bọt, tuyến dày, tụy tạng tuyến ruột non Những enzyme hệ tiêu hóa là: lipase, amylase, protease 1.3.3 Đặc điểm tính chất số enzyme protease hệ tiêu hóa: 1.3.3.1 Giới thệu chung Nhóm enzyme protease (peptit – hidrolase 3.4) xúc tác trình thuỷ phân liên kết liên kết peptit (-CO-NH-)n phân tử protein, polypeptit đến sản phẩm cuối axit amin Ngoài ra, nhiều protease có khả thuỷ phân liên kết este vận chuyển axit amin Hình 1.1 Mơ hình enzyme Protease thủy phân phân tử Protein Protease cần thiết cho sinh vật sống, đa dạng chức từ mức độ tế bào, quan đến thể nên phân bố rộng rãi nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) động vật (gan, dày bê ) So với protease động vật thực vật, protease vi sinh vật có đặc điểm khác biệt Trước hết hệ protease vi sinh vật hệ thống phức tạp bao gồm nhiều enzyme giống cấu trúc, khối lượng hình dạng phân tử nên khó tách dạng tinh thể đồng Cũng phức hệ gồm nhiều enzyme khác nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để đa dạng Hình 1.2 Cấu trúc không gian enzyme Protease 1.3.3.2 Phân loại Protease (peptidase) thuộc phân lớp lớp thứ (E.C.3.4) Peptidase (Protease) (E.C.3.4) Exopeptidase Endopeptidase (E.C 3.4.11-17) (E.C 3.4.21-99) Serine proteinase Aminopeptidase Cystein proteinase Aspartic proteinase Carboxypeptidase Metallo proteinase Hình 1.3 Sơ đồ phân loại protease Protease phân chia thành hai loại: endopeptidase exopeptidase * Dựa vào vị trí tác động mạch polypeptide, exopeptidase phân chia thành hai loại: + Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide đầu N tự chuỗi polypeptide để giải phóng amino acid, dipeptide tripeptide + Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide đầu C chuỗi polypeptide giải phóng amino acid dipeptide * Dựa vào động học chế xúc tác, endopeptidase chia thành bốn nhóm: + Serin protease: protease chứa nhóm –OH gốc serine trung tâm hoạt động có vai trò đặc biệt quan trọng hoạt động xúc tác enzyme Nhóm bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin subtilisin Nhóm chymotrypsin bao gồm enzyme động vật chymotrypsin, trypsin, elastase Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN Các serine protease thường hoạt động mạnh vùng kiềm tính thể tính đặc hiệu chất tương đối rộng + Cysteine protease: Các protease chứa nhóm –SH trung tâm hoạt động Cystein protease bao gồm proteinase thực vật papayin, bromelin, vài protein động vật proteinase ký sinh trùng Các cystein protease thường hoạt động vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu chất rộng + Aspartic protease: Hầu hết aspartic protease thuộc nhóm pepsin Nhóm pepsin bao gồm enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin Các aspartic protease có chứa nhóm carboxyl trung tâm hoạt động thường hoạt động mạnh pH trung tính + Metallo protease: Metallo protease nhóm protease tìm thấy vi khuẩn, nấm mốc vi sinh vật bậc cao Các metallo protease thường hoạt động vùng pH trung tính hoạt độ giảm mạnh tác dụng EDTA Ngoài ra, protease phân loại cách đơn giản thành ba nhóm: - Protease acid: pH 2-4 - Protease trung tính: pH 7-8 - Protease kiềm: pH 9-11 1.3.3.3 Những enzyme protease có nhiều nội tạng cá: Trypsin: Trypsin protease serine, có tuyến tụy người động vật Trong thể sinh vật, trypsin hoạt động môi trường kiềm ruột nên gọi protease kiềm tính Vai trò trypsin tiếp tục thủy phân protein lại sau thủy phân phần dày Trong tuyến tụy, trypsin tiết dạng khơng hoạt động trypsinogen, sau trypsinogen chuyển hóa thành trypsin hoạt động tác dụng enzyme đường ruột enterokinase trypsin có tác dụng tự xúc tác Trypsin chuỗi polypeptide có 249 acis amin, trọng lượng phân tử 2268023400kb pH tối ưu cho hoạt động trypsin mà pH thích hợp 7.8-9.5 Tuy nhiên hoạt tính trypsin ổn định pH 3-5 Các kim loại có tác dụng hoạt hóa trypsin Ca, Co, Mn Các kim loại có tác dụng ức chế Cu, Ag, Hg Chymotrypsin: Chymotrypsin protease tiết từ tuyến tụy Đây protease kiềm tính quan trọng sau trypsin Chymotrypsin tụy tiết dạng khơng hoạt động chymotrypsinogen, sau chymotrypsinogen chuyển sang hoạt động chymotrypsin nhờ tác dụng trypsin Chymotrypsin cấu tạo từ sợi polypeptide: sợi A (acid amin từ 1-13), sợi B ( acid amin từ 16-146), sợi C ( acid amin 149-245) Các sợi liên kết với cầu nối disulfite Chymotrypsin protease hoạt động điều kiện mơi trường có pH kiềm nên xếp vào nhóm protease kiềm tính, tương tự trypsin Chymotrypsin hoạt động điều kiện pH 7-9 pH tối ưu 8-9, điểm đẳng điện pI=5.4 pH=5 không thuận tiện cho hoạt động Chymotrypsin pH chymotrypsin lại bền vững môi trường pH =8 ( môi trường kiềm dễ làm thủy phân trypsin chymotrypsin) Chymotrypsin chuỗi polypeptide có 245 acid amin, trọng lượng phân tử 22500kb Cả hai enzyme trypsin chymotrypsin có tác dụng giống nhau, tức mơi trường có độ pH gần hai enzyme thủy phân protein thành loại peptide Riêng chymotrypsin có tác dụng gây đơng sữa 1.3.4 Ứng dụng chế phẩm enzyme protease hệ tiêu hóa cá: Trypsin sử dụng để khôi phục màu caroten cho phế liệu động vật giáp xác để dùng thức ăn cho động vật nước nhiều vấn đề kĩ thuật Enzyme từ ruột cá dùng việc nướng, làm mềm thịt, sản xuất da, trứng cá muối, sốt cá mùi vị cá [4] CHƯƠNG II: VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP 2.1 NGUYÊN LIỆU Ruột cá điêu hồng: 65g Lưu ý: Ruột phải tách khỏi cá lúc làm thịt, thời gian từ lúc ruột tách khỏi thể cá đến thu gom bảo quản lạnh không 6h Ruột sau thu gom bảo quản lạnh túi nilon -20oC 2.2 HĨA CHẤT: Hóa chất Hàm lượng 12g khan 𝑁𝑎2 𝐶𝑂3 (1,2%) Acetone 1000 ml Đệm Gly-NaOH pH = 9.4 Báng 2.1 Các hóa chất riêng biệt cần dùng 2.3 THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ: Thiết bị Máy xay thịt Máy ly tâm Máy đo quang phổ Máy ủ nhiệt độ Cân kỹ thuật Bảng 2.2 Các thiết bị cần dùng Dụng cụ Ống nghiệm Phễu thủy tinh Erlen 100ml Erlen 250ml Cốc thủy tinh: 100ml Cốc thủy tinh: 250ml Ống nhựa ly tâm Số lượng 15 1 Dụng cụ Ống bóp cao su Bình tia Đũa thủy tinh Pipet 1ml Pipet 2ml Pipet 5ml Pipet 10ml Bảng 2.3 Các dụng cụ cần dùng Số lượng 1 1 1 2.4 THỰC HIỆN: Ruột cá diêu hồng bảo quản -20oC Rửa sạch, xay nhỏ, cân trọng lượng Trích ly Khơng có hoạt tính, hàm lượng Protein enzyme 65g mẫu Na2CO3 1,2%, tỷ lệ 1:2 10ph, nhiệt độ phòng Còn hoạt tính, hàm lượng Protein enzyme bỏ Lọc Tủa thu lấy enzyme Bã Acetone lạnh Tỷ lệ 1:4 Khuấy 10ph, để n 2h, 0-20oC Còn hoạt tính, hàm lượng Protein enzyme Ly tâm lấy tủa Giữ lạnh 2oC, 30ph Quay ly tâm 4oC, 4000 v/p, 10ph Enzyme thô Lọc gel Xác định hoạt tính, hàm lượng Protein enzyme Điện di Giải thích - Nội tạng cá: ruột cá diêu hồng bảo quản lạnh đơng trước đem trích ly để thu nhận enzyme (-20℃) Thời gian bảo quản nội tạng ngắn tốt để tránh tượng enzyme bị biến tính - - - - Xử lý: cắt nhỏ ruột cá đến kích thước x (mm x mm) phối trộn với dung dịch muối Na2CO3 1,2% theo tỷ lệ khối lượng 1:2 Xay mẫu: cho nguyên liệu trộn với dung mơi vào máy xay thịt xay nhuyễn Trích ly enzyme: Mẫu sau xay dung dịch muối giữ yên nhiệt độ phòng 10 phút Lọc để thu dịch chứa enzyme: mục đích loại bỏ tạp chất khơng tan chất nhày từ ngun liệu có dung dịch enzyme Phần bã bỏ Lấy phần mẫu để xác định hoạt tính hàm lượng protein, khơng có hoạt tính/hàm lượng protein, quay lại bước Kết tủa: để tinh enzyme, sử dụng dung môi hữu acetone với tỷ lệ nguyên liệu dung môi 1:4, khuấy 10 phút, để lắng 15 phút, giữ nhiệt độ 0-20oC để yên Khi kết tủa xuất hỗn hợp Sau giờ, lấy phần dịch có lẫn kết tủa để xác định hoạt tính hàm lượng protein Nếu khơng hoạt tính/hàm lượng protein, quay lại bước Ly tâm thu nhận protein kết tủa: giữ hỗn hợp nhiệt độ 2oC thời gian 30 phút tiến hành tách kết tủa khỏi hỗn hợp phương pháp ly tâm (4000V/phút, 10 phút) mục đích thu nhận phần kết tủa Enzyme thô sau ly tâm bảo quản nhiệt độ -20oC Trích phần hòa tan với đệm Gly-NaOH pH = 9.4 để xác định hoạt tính hàm lượng protein Lọc gel: Enzyme thơ sau hòa tan đệm Gly-NaOH pH = 9.4 lọc gel để tinh Điện di: kiểm tra độ tinh sau lọc gel có mặt protein mẫu loại protease thu Xác định hoạt tính enzyme phương pháp Anson cải tiến, hàm lượng protein phương pháp Biuret 2.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP: 2.5.1 Định lượng Protein phương pháp Biuret: Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng tạo màu Protein Cu2+ môi trường kiềm tạo phản ứng màu xanh tím có độ hấp thu cực đại bước sóng 550nm Cường độ màu phản ứng tỉ lệ thuận với lượng Cu số lượng liên kết peptid chuỗi polypeptid Cách tiến hành: Lập đường chuẩn: Lấy ống nghiệm đánh số từ đến cho vào chất theo bảng sau: STT Albumin 1% (ml) Nước cất (ml) 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0.8 0.6 0.4 0.2 10 Nồng độ protein (mg/ml) 10 Thuốc thử Biuret (ml) 5 5 5 Lắc ống nghiệm để yên 30 phút nhiệt độ phòng Đem đo độ hấp thu ống bước sóng 550nm ghi nhận mật độ quang Chuẩn bị dung dịch cần đo: Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch enzyme thô 5ml thuốc thử Biuret lắc để yên vòng 30 phút nhiệt độ phòng Sau đem đo mật độ quang bước sóng 550nm Ghi nhận mật độ quang Tính tốn: Lập đồ thị chuẩn ống nghiệm từ đến Trị số mật độ quang ống nghiệm từ đến mật độ quang ống nghiệm từ đến đo trừ cho mật độ quang ống Sau lập đồ thị biểu diễn biến thiên mật độ quang theo nồng độ Protein chuẩn Tương tự độ hấp thu thật Protein có ống thí nghiệm trị số mật độ quang ống nghiệm trừ ống đối chứng Sau đối chiếu vào đường chuẩn suy lượng Protein có mẫu thí nghiệm 2.5.2 Xác định hoạt tính protease phương pháp Anson cải tiến: Nguyên tắc Phương pháp dựa thủy phân protein casein protease có dịch nghiên cứu, tiếp làm vơ hoạt enzyme kết tủa protein chưa bị thủy phân dung dịch acid trichloracetic Định lượng sản phẩm tạo thành phản ứng thủy phân phản ứng màu với thuốc thử Folin Dựa vào đồ thị chuẩn Tyrosin để tính lượng sản phẩm enzyme xúc tác tạo nên Cách tiến hành: Các bước dựng đường chuẩn Tyrosin Lấy ống nghiệm đánh số từ đến cho vào chất theo bảng sau: Ống nghiệm Dung dịch Tyrosin chuẩn (ml) Dung dịch HCl 0.2N (ml) Dung dịch NaOH 0.5N (ml) Thuốc thử Folin Lượng Tyrosin tương ứng (µM) 0 5.0 10 0.2 4.8 10 0.2 0.4 4.6 10 0.4 0.6 4.4 10 0.6 0.8 4.2 10 0.8 10 Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD bước sóng 660nm Ống số ống thử không (TK), ống lại ống thí nghiệm (TN) Vẽ đường chuẩn Tyrosin tương quan lượng Tyrosin (μM) ΔOD Các bước chuẩn bị mẫu enzyme để đo hoạt tính: Dung dịch hóa chất Thử thật Dung dịch Casein 1% (ml) Dung dịch TCA 5% (ml) Dung dịch enzyme mẫu (ml) Lắc giữ 37oC 20 phút Dung dịch TCA 5% (ml) 10 Để yên 30 phút, lọc lấy dịch Ống nghiệm Thử không 10 Lấy ống nghiệm khác, cho vào ống thứ 5ml dịch lọc ống thử thật cho vào ống thứ hai 5ml dịch lọc cùa ống thử không 11 Tiếp tục thêm vào ống 10ml NaOH 0,5N 3ml thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau 10 phút đo OD bước sóng 660nm Tính ΔOD = ODTT – ODTK, sau dựa vào đồ thị chuẩn suy số μM Tyrosin Các định nghĩa Định nghĩa đơn vị Anson: đơn vị Anson lượng enzyme tối thiểu điều kiện thí nghiệm (35,50C: pH 7,6 …) thủy phân Casein phút tạo thành sản phẩm hòa tan TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD bước sóng 660nm tương ứng với 1μM Tyrosin đường chuẩn Hoạt độ enzyme = µ𝑀 𝑇𝑦𝑟𝑜𝑠𝑖𝑛 × 𝑉 × 𝐿 𝑡×𝑚×𝑣 (UI/g) Với: hoạt độ enzyme protease (UI/g) V : tổng thể tích hỗn hợp ống thử thật ống thử không (ml) v : thể tích dịch lọc đem phân tích (ml) t : thời gian thủy phân (phút) m : khối lượng mẫu enzyme đem xác định hoạt tính (g) L: độ pha loãng enzyme μM Tyrosin: lượng μM Tyrosin v (ml) suy từ đường chuẩn 2.5.3 Phương pháp sắc ký lọc gel: Nguyên tắc: Phương pháp sắc ký lọc gel dựa vào kích thước phân tử Mẫu nạp vào đầu cột chứa nhiều hạt có lỗ làm từ polymer khơng tan có tính hydrate hóa cao dextran, agarose hay polyacrylamide Những phân tử có kích thước nhỏ lọt vào bên lỗ gel bị trì hỗn, di chuyển chậm qua cột, phân tử lớn di chuyển bên hạt gel nên di chuyển nhanh tách khỏi cột sớm phân tử nhỏ Hình 2.1 Hình minh họa phương pháp lọc gel 12 Tiến hành Hình 2.2 Sơ đồ quy trình lọc gel Bảng 2.4 Đặc tính Bio-Gel P-Gels 2.5.4 Phương pháp điện di: Nguyên tắc: Dựa vào di chuyển phân tử có mang điện tích điện trường Điện di protein gel tiến hành xử lý gel SDS Phân tử protein có điện tích tự chứa nhóm acid base Nếu phân tử protein không đạt điểm đẳng điện ảnh hưởng điện trường ngồi, chúng di chuyển sang cực Các protein khác có trị số điện tích tự khác Vì thế, tốc độ di chuyển chúng điện trường điều kiện định pH, lực ion nhiệt độ khác Do hỗn hợp loại protein tách thành số vùng riêng biệt phân đoạn riêng biệt 13 Chuẩn bị gel điện di: Gel polyacrylamide thường đặt đứng Rửa thủy tinh nước, để khô lau lại ethanol Ráp thủy tinh theo hướng dẫn hãng sản xuất kẹp khuôn giá đỡ Pha gel điện di  Chuẩn bị dung dịch running gel (gel chạy) theo bảng Đổ gel chạy (running gel) trước, tới vạch khuôn kính Tổng thể tích bảng dùng cho gel Tách protein phụ thuộc vào kích thước lỗ nồng độ acrylamide % acrylamide Ảnh hưởng (Da) 7.5 45.000 – 200.000 10 20.000 – 200.000 12 14.000 – 70.000 20 5.000 – 45.000 Thêm uL SureCast TEMED cho mL dung dịch gel Trộn đổ gel vào giếng để dung dịch running gel (gel chạy) đông lại  Đổ stacking gel (gel gom) theo bảng Tổng thể tích bảng dùng cho gel 14 Thêm uL SureCast TEMED cho mL dung dịch gel Trộn đổ gel vào giếng để dung dịch stacking gel (gel gom) đông lại Nghiêng cầm tay để dung dịch chạm đáy Cho dung dịch stacking gel vào chạm vào cạnh miếng kiếng phía trước Đặt cầm tay trở vị trí thẳng đứng Đặt lược vào từ từ phía đầu trượt miếng kiếng đầu vào vị trí Để stacking gel đông lại (5-10phút) Kiểm tra đông gel cách xem lượng gel dư lại đơng chưa Bỏ kẹp lược Gel sử dụng gói giấy thấm nước giữ độ cho lần sau Sau gel gom (stacking gel) đơng Tháo kính khỏi khn kính Lắp kính có gel vào khung điện cực, đổ đệm điện di đầy khung điện cực  Chuẩn bị mẫu: Hút mẫu cần điện di 100µl vào tube 1,5ml có bổ sung 20µl Load buffer 6X Đun sơi cách thủy phút, để nguội  Tiến hành điện di: Nhẹ nhàng lấy lược khỏi điện di Bơm mẫu vào giếng với lượng 20µl Thang chuẩn Protein Ladder với lượng 10-15µl Đóng nắp hộp điện di, tiến hành chạy điện di với dòng điện ổn định, 100V200V, 30 - 90 phút Sau vạch màu thị xuống gần đến đáy gel, tắt điện lấy gel  Nhuộm gel rửa nhuộm: Sau lấy gel ra, cho gel vào hộp có chứa dung dịch nhuộm protein (Staining solution) Lắc nhẹ 10-30 phút cho Staining solution thấm vào gel Chuyển gel sang dung dịch rửa màu (Destaining solution) Thay dung dịch rửa vài lần với thời gian khoảng 15 phút/lần miếng gel có màu suốt xuất nhiều vạch xanh lơ gel 15 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 KẾT QUẢ 3.1.1 Đường chuẩn xác định hàm lượng protein theo PP Biuret: Nồng độ protein (mg/ml) OD550nm 10 0.092 0.188 0.286 0.374 0.465 3.1.2 Đường chuẩn xác định hoạt tính enzyme theo PP Anson cải tiến: Nồng độ Tyrosine (mg/ml) 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 OD660nm 0.171 0.295 0.455 0.566 0.693 16 3.1.3 Kết lọc gel: STT OD280 10 11 0.123 0.109 0.068 0.356 2.498 2.038 1.014 0.526 0.633 0.226 0.06 Series 2,5 OD280 1,5 0,5 10 11 STT Hòa chung dung dịch ống nghiệm 5, để xác hoạt tính enzyme hàm lượng protein 3.1.4 Kết xác định hoạt tính enzyme, hàm lượng protein có mẫu: Mẫu Dung dịch sau trích ly Dịch sau tủa Enzyme thơ sau ly tâm Enzyme sau lọc gel Nồng độ pha loãng 50 𝑶𝑫𝟔𝟔𝟎𝒏𝒎 TK: 0.413 TT: 0.493 TK: 0.463 TT: 0.489 TK: 0.165 TT: 0.357 TK: 0.158 TT: 0.178 Hoạt tính enzyme (UI/g) H=0.352 𝑶𝑫𝟓𝟓𝟎𝒏𝒎 Hàm lượng protein (mg/ml) 0.665 12.22 H=0.00144 0.484 10.34 H=0.2008 0.688 14.71 H=0.00012 0.119 2.53 Hiệu suất hoạt tính enzyme so với mẫu sau trích ly: Hiệu suất hoạt tính enzyme sau ly tâm: H= 0.2008 Hiệu suất hoạt tính enzyme sau lọc gel: H= 3.1.5 Kết điện di: Sau điện di, nhóm khơng thu kết 17 0.352 100%= 57,05% 0.00012 0.352 100%= 0.034% 3.2 BÀN LUẬN 3.2.1 Khả trích ly enzyme muối Na2CO3 1,2% :  Tại chọn dung dịch muối Na2CO3 1,2% làm dung dịch trích ly ? Muối tác dụng với phân tử nước bao quanh protein enzyme làm chuyển hóa điện tích, làm thay đổi tích hòa tan enzyme Trong cơng nghiệp enzyme, người ta thường sử dụng muối Ammonium Sulfate Nhưng nhược điểm loại muối tính ăn mòn cao, cần tìm loại muối khác để thay thể Dung dịch muối Na2CO3 1,2% dễ pha dễ sử dụng phòng thí nghiệm lẫn cơng nghiệp Tuy muối khơng gây hư hỏng thiết bị tính hòa tan lại không cao Cần nghiên cứu thêm nồng độ thích hợp cho loại muối ứng dụng trích ly protein enzyme Dung dịch muối Na2CO3 1,2% có khả tách lượng enzyme (cụ thể Trypsin Chymotrypsin ruột cá) tương đối nhiều với hoạt độ enzyme cao sau trích ly (H = 0.352 nồng độ 1:50) Nhưng trình trích ly, dung dịnh muối khơng giữ lạnh trước trộn chung với nguyên liệu nên hoạt tính phần Nồng độ muối 1,2% thời gian trích 10 phút chưa lựa chọn tối ưu thí nghiệm này, nên lượng protein enzyme trích ly sau nhiều lần khảo sát đạt mức từ 12 đến 13 mg/ml nồng độ 1:50 3.2.2 Rửa tủa enzyme dung môi hữu Acetone: Tại lựa chọn tủa dung môi hữu Acetone ? Dựa vào số điện mơi loại dung mơi Nước có số điện môi lớn nên enzyme (bản chất protein) tan dễ dàng nước Đối với acetone loại dung mơi hữu khác có số điện môi nhỏ nên enzyme tan Khi enzyme tan nên không phân tán tốt môi trường, protein kết tủa lại Ngồi ra, sử dụng phương pháp tủa enzyme muối rẻ tiền hơn, tủa muối khó tách muối khỏi enzyme dẫn đến khó tinh Vậy nên thí nghiệm này, chọn sử dụng dung môi hữu acetone để tủa enzyme Protease thơ thu bền vững, đồng thời chất enzyme protein nên gặp dung mơi hữu có tính phân cực mạnh acetone, enzyme dễ dàng bị phá hủy bổ sung lượng acetone nhiều vào để kết tủa [5] Thời gian rửa tủa có ảnh hưởng đến enzyme Cùng tỉ lệ khối lượng nguyên liệu dung môi 1:4, thời gian rửa tủa lâu hoạt tính enzyme giảm Nếu thời gian rửa tủa q tạp chất chưa loại bỏ mong muốn Nếu giảm lượng aceton lại khơng thể rửa tồn enzyme thô, thời gian rửa tủa lâu hoạt tính enzyme hàm lượng protein có mẫu dần aceton phá hủy Thế nên thí nghiệm này, chúng tơi rửa tủa aceton với tỷ lệ aceton nguyên liệu 1:4 thời gian nhiệt độ 0-20oC để enzyme vừa rửa khỏi tạp chất từ nguồn nguyên liệu ban đầu không bị phá hủy dung môi aceton Nếu tăng tỷ lệ aceton thể tích hỗn hợp vượt q 80% hiệu suất thu hồi protease mức tinh chế phẩm giảm [6] 18 3.2.3 Ly tâm tách enzyme khỏi dung môi : Protease dễ bị phân hủy nhiệt độ cao, ly tâm, nhiệt độ tăng làm biến tính enzyme Để tách hồn tồn dung môi khỏi tủa enzyme thô cần thực ly tâm lạnh 10000 vòng/phút thời gian 20 phút, điều kiện vòng thí nghiệm khơng cho phép, thực ly tâm 4000 vòng/phút 10 phút Nếu ly tâm tốc độ 4000 vòng/phút 20 phút 30 phút tách dung mơi khỏi enzyme nhiều hơn, đồng thời làm cho enzyme tiếp xúc với nhiệt độ cao tạo ly tâm lâu hơn, điều dẫn đến làm cho enzyme bị biến tính khơng hoạt tính bước xác định hoạt tính/hàm lượng protein enzyme sau ly tâm Nên lựa chọn ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút 10 phút lựa chọn hợp lí bảo đảm enzyme hạn chế bị biến tính nhiệt độ tăng cao trình ly tâm 3.2.4 Bảo quản enzyme : Thông thường enzyme bảo đảm hai cách sấy khơ, tách hồn tồn enzyme khỏi dung mơi, hoặc, hòa tan enzyme đệm để trữ đông Trong thời gian bảo quản mẫu dung dịch đệm Gly-NaOH pH=9.4, có lý khiến cho mẫu bị biến tính hoạt tính trước bước vào giai đoạn lọc gel sau: ▪ Enzyme thô thu không phân tách hồn tồn khỏi dung mơi hữu ( nước, aceton) dung dịch trích ly Na2CO3 1,2%, dung môi tiếp tục tác động lên enzyme ▪ Enzyme bị đông đá trước cho đệm Gly-NaOH pH=9.4 ▪ Đệm Gly-NaOH pH=9.4 chưa phải đệm tối ưu enzyme khảo sát nên khả bảo quản enzyme không cao ▪ Thời gian bảo quản enzyme bước vào giai đoạn q lâu, khiến enzyme khơng hoạt tính để thực bước ▪ Enzyme thô thu bị oxi hóa ▪ Enzyme thơ bị vi sinh vật làm biến đổi Từ nguyên nhân trên, để bảo đảm enzyme hoạt tính cho bước tiếp theo, cách khắc phục hợp lí phù hợp với điều kiện thí nghiệm rút ngắn thời gian bảo quản từ sau thu enzyme thô bước lọc gel điện di Thời gian bảo quản ngắn, khả enzyme thô thu bị ảnh hưởng bới ngun nhân => bảo đảm yêu cầu để thực bước sau 3.2.5 Lọc gel Bio-gel P100: Enzyme protease có ruột cá diêu hồng chủ yếu Trypsin Chymotrypsin, có trọng lượng phân tử khoảng từ 21 đến 26 kDa, dựa theo đặc tính (bảng 2.4) loại Bio-gel thích hợp để sử dụng Bio-gel P30 Tuy nhiên, điều kiện phòng thí nghiệm khơng cho phép, nên chúng tơi sử dụng Bio-gel P100 Việc sử dụng Bio-gel P100 dẫn đến việc lọc gel có hiệu suất khơng cao Các hạt gel lại phần enyme kích thước không phù hợp, nên ống nghiệm thu giá trị OD280 cao nghi ngờ phần lớn tạp chất sót khơng thể tách khỏi mẫu loại enzyme khác mà enzyme prorease cần thu theo mục tiêu ban đầu Điều dẫn đến hàm lượng protein giảm mạnh hoạt tính enzyme gần khơng sau giai đoạn lọc gel 19 3.2.6 Điện di: Nhóm khơng thu kết điện di có nguyên nhân sau:  Không lưu trữ mẫu sau lọc gel  Enzyme protein bị phân hủy hết phương pháp bảo quản sai thời gian bảo quản lâu  Xử lý mẫu chưa cách  Tỷ lệ hóa chất thành phần gel điện di chưa Do không lưu trữ mẫu sau lọc gel, nhóm phải dùng enzyme thơ sau ly tâm để điện di, dẫn đến tạp chất nhiều, enzyme đích khơng thể tách khỏi hỗn hợp mẫu Thời gian bảo quản mẫu từ sau ly tâm đến vào bước điện di mẫu lâu (gần tuần), protein enzyme có khả bị phân hủy hết, lại mẫu tạp chất nên khơng thể thu kết Hơn nữa, nhóm xử lý mẫu chưa cách, gel điện di làm chưa ảnh hưởng đến việc khơng có kết điện di Kết luận: Hàm lượng protein giai đoạn cao sau lọc gel hàm lượng protein giảm mạnh Ngun nhân dẫn đến giảm hàm lượng protein vi sinh vật ảnh hưởng, protein không bảo quản cách, thời gian từ lúc thu enzyme đến lọc gel lâu làm giảm hàm lượng protein Sau trình lọc gel enzyme gần hoạt tính hoàn toàn Enzyme chất protein Ngoài cấu trúc giống cấu trúc bình thường protein, enzyme có cấu trúc đặc biệt liên quan đến hoạt động thân loại enzyme Khi cấu trúc không gian enzyme bị biến đổi ảnh hưởng đến hoạt tính Các điều kiện nhiệt độ, pH, nồng độ chất làm thay đổi cấu hình khơng gian enzyme Từ ngun nhân lượng dung mơi sót lại, bảo quản enzyme không cách, thời gian bảo quản lâu, lựa chọn Bio-gel chưa phù hợp đến hoạt tính enzyme gần khơng 20 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Love, M.R- The chemical biology of fishes – Academic Press, London, U.K.,p.139,1970 [2] Robinson, E.H., A practical guide to nutrition, feel, and feeding of catfish, Thad Cochran National Warmwater Aquaculture Center, 2001 [3] Carlsen, B., The nutrition digest of esential nutrients, a concise reference for nutritional groups, the human digestive system, vitamins, mineral, enzymes, essential fatty acids, amino sugars and amino acids, p.170, 2005 [4] Archer, M., Watson, R., Denton, J.W., Fish Waste Production in the United Kingdom_The Quantities Produced and Opportunities for Better Utilisation, The Scafish Industry Authority Scafish Technology, 2001 [5] Hà Thị Thụy Vy, Trần Thanh Trúc, Nguyễn Văn Mười, Ảnh Hưởng Của Dung Môi Và Thời Gian Kết Tủa Đến Hiệu Quả Tinh Sạch Sơ Bộ Enzyme Protease Trích Ly Từ Thịt Đầu Tơm, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, Số chuyên đề: Nông nghiệp, p.9-17, 2016 [6] Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn, Nghiên Cứu Thu Nhận Chế Phẩm Enzyme Protease Từ Ruột Cá Basa (Pangasius Bocourti), Tạp Chí Phát Triển Khoa Học Và Congo Nghệ, 2007 21 ... nhận, tiến hành thực đề tài Nghiên cứu thu nhận enzyme từ ruột cá diêu hồng Trong nghiên cứu này, tiến hành thực nghiên cứu sau: - Khảo sát hoạt tính enzyme ruột cá diêu hồng (Oreochromis sp.) Khảo... nước thu c họ Cá rơ phi (Cichlidae) có nguồn gốc hình thành từ lai tạo Thu t ngữ diêu hồng hay điêu hồng xuất phát từ việc dịch từ tiếng Trung Quốc Ở Việt Nam, người dân xứ gọi cá diêu hồng cá. .. trứng cá muối, sốt cá mùi vị cá [4] CHƯƠNG II: VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP 2.1 NGUYÊN LIỆU Ruột cá điêu hồng: 65g Lưu ý: Ruột phải tách khỏi cá lúc làm thịt, thời gian từ lúc ruột tách khỏi thể cá đến thu