Khảo sát hoạt độ enzyme protease thu nhận từ Bacillus subtilis cố định trong gel Alginate

13 http:timtailieu.vntailieuthunhanungdungcuaenzymeprotease32354 2 http:kythuatnuoitrong.comdactinhsinhhoccuavikhuanbacillussutilis 4 Trần Hồng Thắng, Khảo sát hoạt độ enzyme protease thu nhận từ Bacillus subtilis cố định trong gel Alginate, 109 (2016). 5https:www.biobasic.comproductselectrophoresisrelatedladdersprotein20120 kda20120kdamidrangeproteinmolecularweightmarkerprestained Tài liệu được cung cấp bởi TS Huỳnh Ngọc Oanh – trưởng phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học trường ĐH Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh.13 http:timtailieu.vntailieuthunhanungdungcuaenzymeprotease32354 2 http:kythuatnuoitrong.comdactinhsinhhoccuavikhuanbacillussutilis 4 Trần Hồng Thắng, Khảo sát hoạt độ enzyme protease thu nhận từ Bacillus subtilis cố định trong gel Alginate, 109 (2016). 5https:www.biobasic.comproductselectrophoresisrelatedladdersprotein20120 kda20120kdamidrangeproteinmolecularweightmarkerprestained Tài liệu được cung cấp bởi TS Huỳnh Ngọc Oanh – trưởng phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học trường ĐH Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh.13 http:timtailieu.vntailieuthunhanungdungcuaenzymeprotease32354 2 http:kythuatnuoitrong.comdactinhsinhhoccuavikhuanbacillussutilis 4 Trần Hồng Thắng, Khảo sát hoạt độ enzyme protease thu nhận từ Bacillus subtilis cố định trong gel Alginate, 109 (2016). 5https:www.biobasic.comproductselectrophoresisrelatedladdersprotein20120 kda20120kdamidrangeproteinmolecularweightmarkerprestained Tài liệu được cung cấp bởi TS Huỳnh Ngọc Oanh – trưởng phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học trường ĐH Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh.

MỤC LỤC

Chương 1: TỔNG QUAN 4

1 Enzyme protease 4

2 Bacillus subtilis 4

3 Ứng dụng của enzyme protease 4

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 6

1 Qui trình chung 6

2 Thuyết minh quy trình 8

3 Vật liệu 8

3.1 Đối tượng nghiên cứu 8

3.2 Thiết bị, dụng cụ 8

3.3 Môi trường giữ giống 9

3.4 Môi trường tăng sinh 10

4 Phương pháp nghiên cứu 10

4.1 Phương pháp Biuret 10

4.2 Phương pháp Anson 11

4.3 Phương pháp sắc ký lọc gel 14

4.4 Điện di 16

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

1 Biuret 21

1.1 Đường chuẩn Biuret 21

1.2 Kết quả đo nồng độ protein 22

2 Anson 23

2.1 Đường chuẩn Tyrosine 23

2.2 Kết quả đo Anson 23

3 Lọc gel 25

4 Điện di 26

MỤC LỤC BẢNG

Bảng 1 Thiết bị và dụng cụ sử dụng 8

Bảng 2 Phương pháp lập đồ thị đường chuẩn Biuret 11

Bảng 3 Phương pháp xác định hàm lượng protein có trong mẫu 11

Bảng 4 Phương pháp lập đường chuẩn Anson 13

Bảng 5 Phương pháp xác định hoạt tính 13

Bảng 6 Thành phần dung dịch resolving gel 18

Bảng 7 Thành phần dung dịch stacking gel 18

Bảng 8 Kết quả đo OD của đường chuẩn Biuret 21

Bảng 9 Kết quả đo nồng độ protein bằng phương pháp Biuret 22

Bảng 10 Kết quả OD của đường chuẩn Tyrosine 23

Bảng 11 Kết quả đo OD phương pháp Anson 23

Bảng 12 Kết quả hoạt tính riêng protease 24

Bảng 13 Kết quả điện di 26

MỤC LỤC HÌNH

Hình 1 Phương trình đường chuẩn Biuret 21

Hình 2 Phương trình đường chuẩn Tyrosine 23

Hình 3 Đồ thị sắc ký của quá trình lọc gel 25

Hình 4 Thang chuẩn 26

Hình 5 Kết quả điện di 26

Chương 1: TỔNG QUAN

1 Enzyme protease

Protease là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt các liên kết peptide trong phân

tử polypeptide, protein và một số chất tương tự thành các amino acid hoặc các peptide có phân tử lượng thấp Mỗi một loại enzyme lại có hướng xúc tác khác nhau trong một phản ứng.[1]

Protease là một trong những enzyme có nhiều ứng dụng rộng rãi phục vụ đời sống Protease có thể thu nhận từ các nguồn: thực vật (đu đủ, sung, thơm,…), động vật (niêm mạc

dạ dày, ruột non, tuyến tụy, trùn,…), vi sinh vật (Bacillus subtillis, nấm mốc Aspergillus

oryzae,…)

2 Bacillus subtilis

Bacillus subtilis thuộc giới Bacteria, ngành Firmicutes, lớp Bacilli, bộ Bacillales họ Bacillaceae, giống Bacillus, loài Bacillus subtilis

Có trong đất, rơm, rạ, cỏ khô (Đất trồng trọt có khoảng 106 – 107 triệu CFU/g)

Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram (+), kích thước

0.5-0.8 µm x 1.5-3 µm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn Vi khuẩn có khả năng di động, có

8-12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn nằm giữa hoặc lệch tâm tế bào Vi khuản phát triển trong điều kiện hiếu khí nhưng vẫ có thể phát triển được trong môi trường thiếu Oxy, nhiệt độ tối ưu là 370C, pH = 7.0 – 7.4 Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt bào

tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt ở 100oC trong 180 phút, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ, áp suất, chất sát trùng và có thể sống vài năm đến vài chục năm.[2]

B subtilis có khả năng tiết enzyme protease trên môi trường nuôi cấy để phân giải các

chất dinh dưỡng có trong môi trường

3 Ứng dụng của enzyme protease

Enzyme protease được ứng dụng rộng rãi trong các ngành như:

- Công nghệ thực phẩm: chế biến thịt, bia, sữa, sản xuất nước mắm, sản xuất bánh mì, bánh quy, làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị, thực phẩm cho người ăn kiêng,…

- Công nghiệp thuộc da, chất tẩy rửa, dệt may, mỹ phẩm

- Trong y học: men tiêu hóa, điều chế môi trường sản xuất vacxin,…

- Ngoài ra enzyme protease còn được sử dụng trong sản xuất keo động vật, sản xuất thức ăn gia súc.[3]

pH = 7

2 Thuyết minh quy trình

• Nuôi cấy lỏng lắc 150 vòng/phút, 24h trong 100ml môi trường tăng sinh

• Ly tâm 3000v/p, trong 10 phút, thu dịch

• Kết tủa dịch bằng cồn theo tỉ lệ Dịch : Cồn tuyệt đối = 1:3

• Ly tâm 4000v/p, trong 10p, thu được tủa và dịch lỏng

• Hòa tan tủa trong 1ml đệm phosphate, sau đó pha loãng 20 lần

- Tinh sạch: Lọc gel và điện di

- Chỉ tiêu phân tích:

• Hàm lượng protein: Biuret

• Hoạt tính protease: Anson

3 Vật liệu

3.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng Bacillus subtilis được cung cấp bởi PTN Protein- Enzyme – trường Đại học Bách Khoa – Đại học Quốc gia TP.HCM

3.3 Môi trường giữ giống

Dùng môi trường NB để giữ giống:

- Cân 1.3g NB, hòa tan bằng nước cất định mức lên 100ml

- Cân 2g agar, đun nóng đến khi tan hết agar

3.4 Môi trường tăng sinh

Tăng sinh trong môi trường lỏng có thành phần: cao thịt (2.5g), peptone (2.5g), NaCl (1.25g), dung dịch A (1.25ml), saccharose (2.5g), thêm nước cất cho đủ 250mL.[4]

Dung dịch A: MgSO4.7H2O (1.15g), MnSO4.4H2O (0.28g) được hòa tan trong 100 ml nước cất.[4]

4 Phương pháp nghiên cứu

Quy trình pha Biuret

Bước 1: Cân nguyên liệu như trên

Bước 2: Pha 300ml dung dịch NaOH 10% Lưu ý vừa cho từ từ xút rắn vào 300ml dd nước cất vừa khuấy đều, không để xút kết tụ dưới đáy (dung dịch A)

Bước 3: Pha CuSO4.5H2O và NaKC4H4O6. 4H2O vào 500ml nước cất, khuấy cho hòa tan hết (dung dịch B)

Bước 4: Đổ từ từ dung dịch A vào dung dịch B Vừa đổ vừa khuấy đều Định mức lên

1000 ml bằng nước cất Sản phẩm phức sẽ có màu xanh dương hơi đậm và không có kết tủa Lưu ý bảo quản trong bình màu tối

Bảng 3 Phương pháp xác định hàm lượng protein có trong mẫu

Enzyme (ml) Nước cất (ml) Biuret (ml)

Đo quang ở 540nm 4.2 Phương pháp Anson

4.2.1 Nguyên tắc

Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên sự thủy phân protein casein bằng enzyme

Protease có trong dịch nghiên cứu, tiếp đó làm bất hoạt enzyme và kết tủa protein chưa bị thủy phân bằng dung dịch acid trichloracetic (TCA) Định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng thủy phân bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin Dựa vào đồ thị chuẩn của Tyrosin để tính lượng sản phẩm do enzyme xúc tác tạo nên

Định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lượng enzym tối thiểu trong điều kiện

thí nghiệm (35.50C, pH 7.6 …) thủy phân Casein trong 1 phút tạo thành sản phẩm hòa tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở bước sóng 660nm tương ứng với 1µM Tyrosin trong đường chuẩn

Hoạt độ riêng Protease:

E (U/mg) = (𝐶𝑡𝑡−𝐶𝑡𝑘)×𝑉×1000

10×1×𝑤Trong đó:

• Ctt: nồng độ tại kết quả OD của ống thử thật

• Ctk: nồng độ tại kết quả OD của ống thử không

▪ Trộn 177ml dd Na2HPO4 và 23ml KH2PO4, sau đó đo pH = 7.6

▪ Cân 2g Casein, vừa đun vừa khuấy ở 600C

▪ TCA: Hòa tan 5g TCA trong nước sau đó định mức lên 100ml bằng nước cất

▪ Na2CO3 0.5M

▪ Folin 1:3

4.2.3 Lập phương trình đường chuẩn

Bảng 4 Phương pháp lập đường chuẩn Anson

+ Pha cố định (pha tĩnh): các chất mang (chất rắn, giấy, bản mỏng,…)

+ Pha di động: Hỗn hợp protein, dung môi,…

- Nguyên tắc phương pháp sắc ký lọc gel

Dựa vào sự khác nhau giữa kích thước, trọng lượng các phân tử khi cho hỗn hợp protein đi qua một cột gel Những phân tử có kích thước đủ nhỏ để lọt bên trong lỗ gel do

đó di chuyển chậm, trong khi đó những phân tử lớn hơn di chuyển bên ngoài các hạt gel nên sẽ duy chuyển nhanh hơn và được tách ra khỏi hỗn hợp sớm hơn các phân tử nhỏ

- Tính toán lượng gel cần ngâm:

+ Cột có chiều cao 20cm, đường kính 0,7cm

+ Nhồi gel vào cột 18cm, như vậy thể tích gel cần sử dụng là:

- Nhồi cột:

+ Khoá ống mao quản dưới cột, cho gel vào cùng với dung dịch đệm một cách từ từ tránh tạo bọt khí

+ Sau khi cho một lớp gel vào cột cho tới khi gel lắng thành lớp cao khoảng 5cm,

mở khoá ống mao quản để dung dịch đệm chảy ra từ từ Sau đó tiếp tục cho gel vào cột đến khi đạt độ cao cần thiết Trên mặt gel luôn có một lớp dung dịch đệm để tránh gel bị khô gel, không khí lọt vào

+ Khoá mao quản lại, để gel ổn định trong khoảng 1-2h, sau đó cho chạy cột trước với dung dịch đệm, đến khi cột gel chạy ổn định thì cho mẫu vào cột

- Đưa mẫu vào cột: Mở khoá mao quản đến khi lớp dung dịch đệm vừa cạn tới mặt gel thì cho mẫu vào cột Dùng pipetman hút 1ml mẫu cho vào xilanh Bơm mẫu vào cột gel sau với màng lọc 0.45µm nhẹ nhàng tránh xáo trộn gel và tạo bọt khí

- Thu mẫu: Lần lượt hứng mẫu bằng ống nghiệm, mỗi ống nghiệm khoảng 3ml Thu

20 ống, đem đi đo OD bước sóng 280nm

- Sau khi lọc gel xong, tiến hành rửa gel bằng nước cất, sau đó rửa tiếp bằng cồn (tránh gel bị nhiễm mốc) mới bảo quản để sử dụng cho lần sau nếu cột gel chưa bị tắt nghẽn

là một chất tẩy anion, gây biến tính protein bằng các bao quanh bộ khung polypeptide khiến phân tử duỗi thẳng Mỗi phân tử SDS sẽ cung cấp hai điện tích âm, các phân tử protein sẽ được tích điện tỷ lệ với khối lượng phân tử của chúng (hay chiều dài của mạch) Khi được

xử lý bằng SDS và chất khử, các protein đều có dạng hình cầu tích điện âm với cùng số

điện tích trên một đơn vị chiều dài Sau khi chạy điện di, vị trí của bang dọc theo giếng cho biết giá trị gầ đúng về kích thước và lượng protein có trong mẫu (căn cứ vào độ bắt màu sau khi nhuộm), dựa vào đó có thể đánh giá về:

- Tris-Glycine Running Buffer

- Staining solution (dung dịch nhuộm)

- Destaining solution (dung dịch rửa màu)

- Dung dịch xử lý mẫu

- TEDMED

4.4.4 Các bước tiến hành

Chuẩn bị gel điện di

Gel polyacrylamide thường đặt đứng

Rửa sạch các tấm thủy tinh bằng nước, để khô Ráp các tấm thủy tinh với tấm silicone

ở giữa, đặt lên giá đỡ và kẹp lại Phần mặt chữ U của tấm thủy tinh hướng về phía người sử dụng

Bảng 6 Thành phần dung dịch resolving gel

- Thêm vào trên bề mặt gel khoảng 0.5-1.0 mL nước

- Đặt giá đỡ về vị trí ban đầu và đợi gel đông lại khoảng từ 5 đến 10 phút

- Khi gel đã đông, đổ lớp nước đi và dung giấy thấm nước còn đọng lại trong giếng

Chuẩn bị dung dịch Stacking gel

Bảng 7 Thành phần dung dịch stacking gel

Thêm 3 µL TEDMED vào 3 mL dung dịch resolving gel Trộn đều và đổ gel vào giếng ngay lập tức

Đổ stacking gel

- Nghiêng giá đỡ để dung dịch có thể chạm đáy

- Cho dung dịch stacking gel vào nhẹ nhàng cho đến khi chạm vào cạnh trên của tấm kính phía trước

- Đặt giá đỡ về vị trí thẳng đứng

- Đặt lược vào từ từ bắt đầu từ vị trí đầu kia và trượt nó giữa tấm kính cho tới khi cả hai đầu vào đúng vị trí

- Để stacking gel đông lại (khoảng 10 phút)

- Kiếm tra sự đông gel bằng cách xem lượng gel còn dư lại đã đông chưa

- Bỏ kẹp và lược ra Gel có thể được sử dụng ngay hoặc gói trong giấy thấm nước và giữ ở nhiệt độ 4oC cho lần sau

Sau khi gel đông lại, tháo bộ kính ra khỏi giá đỡ Lắp bộ kính có gel vào khung điện cực, đổ đệm điện di vào khung điện cực

- Nhẹ nhàng lấy lược ra khỏi bộ điện di

- Đặt Multi-use Tool trên bộ kính

- Bơm từng mẫu vào từng giếng với lượng khoảng 10 - 15 µL Thang chuẩn với lượng tương tự Thang chuẩn có phân tử lượng protein khoảng 20 – 120 kDa

- Đóng nắp hộp điện di, tiến hành chạy điện di với dòng điện ổn định 125V trong 80-140 phút

Nhuộm gel và rửa nhuộm

- Sau khi lấy gel ra, cho gel vào hộp có chứa dung dịch nhuộm protein (Staining solution)

- Lắc nhẹ cho dung dịch thấm vào gel Đợi khoảng 10-30 phút

- Chuyển gel sang dung dịch rửa màu (destaining solution), thay dung dịch rửa mới khoảng

1 đến 2 lần với khoảng thời gian khoảng 10 phút/ lần cho đến khi miếng gel có màu trong suốt và xuất hiện các vạch xanh lơ trên gel

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1 Biuret

1.1 Đường chuẩn Biuret

Bảng 8 Kết quả đo OD của đường chuẩn Biuret

Hình 1 Phương trình đường chuẩn Biuret

y = 0.1925x + 0.0351R² = 0.9792

0 0.05

1.2 Kết quả đo nồng độ protein

Bảng 9 Kết quả đo nồng độ protein bằng phương pháp Biuret

- Ở môi trường E0, vẫn còn vi sinh vật, dẫn đến độ đục của mẫu đem đo OD cao hơn

- Sau khi đo hoạt tính E1, nhóm đã trữ lại 1 tuần sau đó mới đo hoạt tính E2 Quá trình trữ cũng làm hoạt tính và lượng protease bị giảm

- Dung dịch Biuret đã pha có thể chưa chính xác hoàn toàn, pha loãng enzyme Điều

đó có thể dẫn tới sai số

- Enzyme có thể không được phân bố đều khi hút

- Kết quả đo OD mẫu E3 thấp hơn phương trình đường chuẩn nên không thể tính được hàm lượng protein

2 Anson

2.1 Đường chuẩn Tyrosine

Bảng 10 Kết quả OD của đường chuẩn Tyrosine

Hình 2 Phương trình đường chuẩn Tyrosine

2.2 Kết quả đo Anson

Bảng 11 Kết quả đo OD phương pháp Anson

0 0.05

Hoạt độ riêng protease:

- Mẫu E0 sau khi nuôi cấy lỏng lắc trong 24h và mẫu E1 sau khi ly tâm liền mang đi

đo Anson nên hoạt tính enzyme mất không đáng kể

- Mẫu E2 bảo quản trong tủ lạnh 1 khoảng thời gian lâu, tủa sau khi ly tâm không được hòa tan vào đệm liền mà được trữ trong ngăn đá tủ lạnh, sau đó mới hòa tan (do hóa chất hết nên không pha đệm được)

- Thao tác tiến hành góp phần ảnh hưởng sai số của thí nghiệm

- Do tủa bằng cồn (cồn ảnh hưởng 1 phần đến hoạt tính của enzyme)

3 Lọc gel

Hình 3 Đồ thị sắc ký của quá trình lọc gel

Nhận xét:

Mẫu vẫn còn hoạt tính nhưng không cao

Đồ thị sắc ký của quá trình lọc gel chỉ xuất hiện 1 peak

- Mẫu trữ lâu (1 tuần) nên bị mất hoạt tính

- Do nhóm không đủ thời gian để hứng 20 ống theo phương pháp nên nhóm chỉ ra được 1 peak

Mẫu Nhóm

- Giếng không đẹp, nhiều giếng bị hỏng

- Băng điện di chạy đều không bị lệch

- Thang chuẩn có 5 vệt

- Bảng gel có màu xanh, gel chưa trong suốt

- Giếng 9 có xuất hiện vạch đậm nằm ngoài thang chuẩn

- Giếng 4 có xuất hiện vạch nhạt hơn nằm ngoài thang chuẩn

- Giếng 1 có xuất hiện vạch nhạt nằm trên thang chuẩn, có kích thước khoảng 34kDa

- Các giếng còn lại không xuất hiện vạch

Bàn luận

- Khi chuẩn bị stacking gel, lúc cho TEDMED vào không chạm bề mặt của hỗn hợp,

và chưa Vortex nên gel đông không đều

- Rửa gel không kỹ nên bảng gel còn màu xanh của thuốc nhuộm

- Khi bơm mẫu vào giếng, do thao tác thực hiện chưa chuẩn và giếng 5 cạn nên mẫu

bị tràn sang giếng 4 Vì vậy, 2 trường hợp có thể xảy ra:

+ Thứ nhất: Vạch ở giếng số 4 không xác định rõ là mẫu nào do đã bị trộn 2 mẫu lại với nhau Khi đó có thể kích thước protein của 2 mẫu tương tự nhau

+ Thứ hai: Vạch ở giếng só 4 là protein của mẫu E1, do giếng 5 không xuất hiện vạch tức là lượng protein ở giếng đó quá ít nên không ảnh hưởng đến mẫu ở giếng 4

- Những giếng không xuất hiện do ít hoặc không còn protein

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1][3] http://timtailieu.vn/tai-lieu/thu-nhan-ung-dung-cua-enzyme-protease-32354/ [2] http://kythuatnuoitrong.com/dac-tinh-sinh-hoc-cua-vi-khuan-bacillus-sutilis/

[4] Trần Hồng Thắng, Khảo sát hoạt độ enzyme protease thu nhận từ Bacillus subtilis cố

định trong gel Alginate, 109 (2016)

[5]kda/20-120kda-mid-range-protein-molecular-weight-marker-prestained

https://www.biobasic.com/products/electrophoresis-related/ladders-protein/20-120-Tài liệu được cung cấp bởi TS Huỳnh Ngọc Oanh – trưởng phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học trường ĐH Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh