Khảo sát hoạt độ enzyme protease thu nhận từ Bacillus subtilis cố định trong gel Alginate

13 http:timtailieu.vntailieuthunhanungdungcuaenzymeprotease32354 2 http:kythuatnuoitrong.comdactinhsinhhoccuavikhuanbacillussutilis 4 Trần Hồng Thắng, Khảo sát hoạt độ enzyme protease thu nhận từ Bacillus subtilis cố định trong gel Alginate, 109 (2016). 5https:www.biobasic.comproductselectrophoresisrelatedladdersprotein20120 kda20120kdamidrangeproteinmolecularweightmarkerprestained Tài liệu được cung cấp bởi TS Huỳnh Ngọc Oanh – trưởng phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học trường ĐH Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh.13 http:timtailieu.vntailieuthunhanungdungcuaenzymeprotease32354 2 http:kythuatnuoitrong.comdactinhsinhhoccuavikhuanbacillussutilis 4 Trần Hồng Thắng, Khảo sát hoạt độ enzyme protease thu nhận từ Bacillus subtilis cố định trong gel Alginate, 109 (2016). 5https:www.biobasic.comproductselectrophoresisrelatedladdersprotein20120 kda20120kdamidrangeproteinmolecularweightmarkerprestained Tài liệu được cung cấp bởi TS Huỳnh Ngọc Oanh – trưởng phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học trường ĐH Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh.13 http:timtailieu.vntailieuthunhanungdungcuaenzymeprotease32354 2 http:kythuatnuoitrong.comdactinhsinhhoccuavikhuanbacillussutilis 4 Trần Hồng Thắng, Khảo sát hoạt độ enzyme protease thu nhận từ Bacillus subtilis cố định trong gel Alginate, 109 (2016). 5https:www.biobasic.comproductselectrophoresisrelatedladdersprotein20120 kda20120kdamidrangeproteinmolecularweightmarkerprestained Tài liệu được cung cấp bởi TS Huỳnh Ngọc Oanh – trưởng phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học trường ĐH Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh.

MỤC LỤC Chương 1: TỔNG QUAN Enzyme protease Bacillus subtilis Ứng dụng enzyme protease Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH Qui trình chung Thuyết minh quy trình Vật liệu 3.1 Đối tượng nghiên cứu 3.2 Thiết bị, dụng cụ 3.3 Môi trường giữ giống 3.4 Môi trường tăng sinh 10 Phương pháp nghiên cứu 10 4.1 Phương pháp Biuret 10 4.2 Phương pháp Anson 11 4.3 Phương pháp sắc ký lọc gel 14 4.4 Điện di 16 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 Biuret 21 1.1 Đường chuẩn Biuret 21 1.2 Kết đo nồng độ protein 22 Anson 23 2.1 Đường chuẩn Tyrosine 23 2.2 Kết đo Anson 23 Lọc gel 25 Điện di 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO 28 MỤC LỤC BẢNG Bảng Thiết bị dụng cụ sử dụng Bảng Phương pháp lập đồ thị đường chuẩn Biuret 11 Bảng Phương pháp xác định hàm lượng protein có mẫu 11 Bảng Phương pháp lập đường chuẩn Anson 13 Bảng Phương pháp xác định hoạt tính 13 Bảng Thành phần dung dịch resolving gel 18 Bảng Thành phần dung dịch stacking gel 18 Bảng Kết đo OD đường chuẩn Biuret 21 Bảng Kết đo nồng độ protein phương pháp Biuret 22 Bảng 10 Kết OD đường chuẩn Tyrosine 23 Bảng 11 Kết đo OD phương pháp Anson 23 Bảng 12 Kết hoạt tính riêng protease 24 Bảng 13 Kết điện di 26 MỤC LỤC HÌNH Hình Phương trình đường chuẩn Biuret 21 Hình Phương trình đường chuẩn Tyrosine 23 Hình Đồ thị sắc ký trình lọc gel 25 Hình Thang chuẩn 26 Hình Kết điện di 26 Chương 1: TỔNG QUAN Enzyme protease Protease nhóm enzyme thủy phân có khả cắt liên kết peptide phân tử polypeptide, protein số chất tương tự thành amino acid peptide có phân tử lượng thấp Mỗi loại enzyme lại có hướng xúc tác khác phản ứng.[1] Protease enzyme có nhiều ứng dụng rộng rãi phục vụ đời sống Protease thu nhận từ nguồn: thực vật (đu đủ, sung, thơm,…), động vật (niêm mạc dày, ruột non, tuyến tụy, trùn,…), vi sinh vật (Bacillus subtillis, nấm mốc Aspergillus oryzae,…) Bacillus subtilis Bacillus subtilis thuộc giới Bacteria, ngành Firmicutes, lớp Bacilli, Bacillales họ Bacillaceae, giống Bacillus, loài Bacillus subtilis Có đất, rơm, rạ, cỏ khơ (Đất trồng trọt có khoảng 106 – 107 triệu CFU/g) Bacillus subtilis trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram (+), kích thước 0.5-0.8 µm x 1.5-3 µm, đơn lẻ thành chuỗi ngắn Vi khuẩn có khả di động, có 812 lơng, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ nằm lệch tâm tế bào Vi khuản phát triển điều kiện hiếu khí vẫ phát triển mơi trường thiếu Oxy, nhiệt độ tối ưu 370C, pH = 7.0 – 7.4 Bào tử phát triển cách nảy mầm nứt bào tử, khơng kháng acid, có khả chịu nhiệt 100oC 180 phút, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ, áp suất, chất sát trùng sống vài năm đến vài chục năm.[2] B subtilis có khả tiết enzyme protease môi trường nuôi cấy để phân giải chất dinh dưỡng có mơi trường Ứng dụng enzyme protease Enzyme protease ứng dụng rộng rãi ngành như: - Công nghệ thực phẩm: chế biến thịt, bia, sữa, sản xuất nước mắm, sản xuất bánh mì, bánh quy, làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị, thực phẩm cho người ăn kiêng,… - Công nghiệp thuộc da, chất tẩy rửa, dệt may, mỹ phẩm - Trong y học: men tiêu hóa, điều chế mơi trường sản xuất vacxin,… - Ngồi enzyme protease sử dụng sản xuất keo động vật, sản xuất thức ăn gia súc.[3] Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH Qui trình chung Chuẩn bị mơi trường Khử trùng 1210C t = 15 phút Làm nguội Ni cấy VSV Lắc 150 vòng/phút t = 24h Dịch Đo E0 Ly tâm 3000 vòng t = 10 phút Sinh khối TB B.Subtilis Kết tủa Đo E1 Dịch : Cồn = : Ly tâm Dịch Đo E2 Tủa Đo E3 Hòa tan vào đệm Phosphate pH = Lọc gel Thuyết minh quy trình • Ni cấy lỏng lắc 150 vòng/phút, 24h 100ml mơi trường tăng sinh • Ly tâm 3000v/p, 10 phút, thu dịch • Kết tủa dịch cồn theo tỉ lệ Dịch : Cồn tuyệt đối = 1:3 • Ly tâm 4000v/p, 10p, thu tủa dịch lỏng • Hòa tan tủa 1ml đệm phosphate, sau pha lỗng 20 lần - Tinh sạch: Lọc gel điện di - Chỉ tiêu phân tích: • Hàm lượng protein: Biuret • Hoạt tính protease: Anson Vật liệu 3.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng Bacillus subtilis cung cấp PTN Protein- Enzyme – trường Đại học Bách Khoa – Đại học Quốc gia TP.HCM 3.2 Thiết bị, dụng cụ Bảng Thiết bị dụng cụ sử dụng STT Dụng cụ Số lượng Erlen 250ml Becher 1000ml Becher 250ml Ống nghiệm 20 Ống đong 500ml Mục đích Đựng mơi trường, dịch chiết, sinh khối Đựng mơi trường Giữ giống, đo Anson, đo Biuret, lọc gel Ống đong 250ml Bình định mức 100ml Bình định mức 250ml Đèn cồn Cấy 10 Que cấy Cấy 11 Ống bóp nhựa 12 Ống bóp cao su 13 Bình nước cất 14 Giá ống nghiệm Đựng ống nghiệm 15 Pipet 1ml, 2ml Hút mẫu 16 Ống ly tâm 50ml Ly tâm, điện di 17 Màng bọc Bọc 18 Giấy lọc 19 Máy ly tâm Ly tâm 20 Máy lắc Lắc môi trường nuôi cấy 21 Máy đo pH Đo pH 22 Máy đo OD Đo OD Lọc 3.3 Môi trường giữ giống Dùng môi trường NB để giữ giống: - Cân 1.3g NB, hòa tan nước cất định mức lên 100ml - Cân 2g agar, đun nóng đến tan hết agar 3.4 Môi trường tăng sinh Tăng sinh mơi trường lỏng có thành phần: cao thịt (2.5g), peptone (2.5g), NaCl (1.25g), dung dịch A (1.25ml), saccharose (2.5g), thêm nước cất cho đủ 250mL.[4] Dung dịch A: MgSO4.7H2O (1.15g), MnSO4.4H2O (0.28g) hòa tan 100 ml nước cất.[4] Phương pháp nghiên cứu 4.1 Phương pháp Biuret 4.1.1 Mục đích Phương pháp Biuret để định lượng protein cách đo mật độ quang dung dịch phức tạo thành bước sóng 540nm, sau tính toán dựa định luật Beer-Lambert 4.1.2 Nguyên tắc Dựa vào phản ứng tạo màu protein Cu2+ mơi trường kiềm tạo phản ứng màu xanh tím Cường độ màu tỉ lệ thuận với lượng Cu2+ số liên kết peptide chuỗi polypeptide 4.1.3 Hóa chất Biuret - 1.5 g CuSO4.5H2O - g NaKC4H4O6 H2O (Kali Natri tartrate) - 30g NaOH Quy trình pha Biuret Bước 1: Cân nguyên liệu Bước 2: Pha 300ml dung dịch NaOH 10% Lưu ý vừa cho từ từ xút rắn vào 300ml dd nước cất vừa khuấy đều, không để xút kết tụ đáy (dung dịch A) Bước 3: Pha CuSO4.5H2O NaKC4H4O6 4H2O vào 500ml nước cất, khuấy cho hòa tan hết (dung dịch B) 10 Dịch lọc (ml) Na2CO3 0.5M (ml) Folin 1:3 (ml) - Lọc - Vortex 1 1 5 5 1 1 Chờ 20 phút, sau đo OD 660nm 4.3 Phương pháp sắc ký lọc gel 4.3.1 Mục đích: Tinh mẫu enzyme 4.3.2 Nguyên tắc - Nguyên tắc phương pháp sắc ký Dựa phân bố chất tan hai pha không trộn lẫn vào nhau, cho chất di chuyển (pha động) qua chất đứng yên (pha tĩnh) Như sắc ký chia làm hai pha: + Pha cố định (pha tĩnh): chất mang (chất rắn, giấy, mỏng,…) + Pha di động: Hỗn hợp protein, dung môi,… - Nguyên tắc phương pháp sắc ký lọc gel Dựa vào khác kích thước, trọng lượng phân tử cho hỗn hợp protein qua cột gel Những phân tử có kích thước đủ nhỏ để lọt bên lỗ gel di chuyển chậm, phân tử lớn di chuyển bên hạt gel nên chuyển nhanh tách khỏi hỗn hợp sớm phân tử nhỏ 14 4.3.3 Hoá chất: - Biogel P-60 (Bio Rad, Mỹ) - Dung dịch đệm citrate-phosphate pH=5.0 - Đặc điểm gel sử dụng: kích thước hạt 90-180µm, thể tích gel sau trương nở 11ml/g, tốc độ chảy 4-6cm/giờ, khoảng phân đoạn 3000-60000 kDa 4.3.4 Các bước tiến hành: - Tính tốn lượng gel cần ngâm: + Cột có chiều cao 20cm, đường kính 0,7cm + Nhồi gel vào cột 18cm, thể tích gel cần sử dụng là: Vgel= 0,352 𝜋 18 = 6,19ml + Biogel P-60 ngâm có hệ số trương nở 11ml/g Vậy lượng gel cần thiết là: MBiogel P-60= Vgel/11 = 0,627g - Ngâm gel: cân lượng tính tốn cho vào becher Cho dung dịch đệm vào, thể tích dung dịch đệm phải gấp đơi thể tích gel sau trương nở Để yên 12h cho gel trương nở hoàn toàn Gạn bỏ hạt mịn bề mặt tránh làm cản trở trình lọc gel sau cách thay dung dịch đệm phía 4-5 lần Trước nhồi vào cột, cho them đệm vào hỗn hợp để hỗn hợp khơng q đặc - Nhồi cột: + Khố ống mao quản cột, cho gel vào với dung dịch đệm cách từ từ tránh tạo bọt khí + Sau cho lớp gel vào cột gel lắng thành lớp cao khoảng 5cm, mở khoá ống mao quản để dung dịch đệm chảy từ từ Sau tiếp tục cho gel vào cột đến đạt độ cao cần thiết Trên mặt gel ln có lớp dung dịch đệm để tránh gel bị khơ gel, khơng khí lọt vào + Khố mao quản lại, để gel ổn định khoảng 1-2h, sau cho chạy cột trước với dung dịch đệm, đến cột gel chạy ổn định cho mẫu vào cột 15 - Đưa mẫu vào cột: Mở khoá mao quản đến lớp dung dịch đệm vừa cạn tới mặt gel cho mẫu vào cột Dùng pipetman hút 1ml mẫu cho vào xilanh Bơm mẫu vào cột gel sau với màng lọc 0.45µm nhẹ nhàng tránh xáo trộn gel tạo bọt khí - Thu mẫu: Lần lượt hứng mẫu ống nghiệm, ống nghiệm khoảng 3ml Thu 20 ống, đem đo OD bước sóng 280nm - Sau lọc gel xong, tiến hành rửa gel nước cất, sau rửa tiếp cồn (tránh gel bị nhiễm mốc) bảo quản để sử dụng cho lần sau cột gel chưa bị tắt nghẽn 4.4 Điện di 4.4.1 Mục đích Điện di thường dùng việc tinh phân tích phân tử sinh học nucleic acid, protein số phức hợp carbohydrat, lipid 4.4.2 Nguyên tắc điện di – điện di SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide) Dựa vào di chuyển phân tử có mang điện tích điện trường Điện di protein gel tiến hành xử lý gel SDS Phân tử protein có điện tích tự chứa nhóm acid base Nếu phân tử protein không đạt điểm đẳng điện ảnh hưởng điện trường ngoài, chúng di chuyển sang cực Các protein khác có trị số điện tích tự khác Vì thế, tốc độ di chuyển chúng điện trường điều kiện định pH, lực ion nhiệt độ khác Do hỗn hợp loại protein tách thành số vùng riêng biệt phân đoạn riêng biệt SDS-PAGE phương pháp điện di kiểu biến tính phá cấu trúc, dùng để phân tách protein khác dựa khối lượng phân tử (MW) chúng Trong đó, SDS chất tẩy anion, gây biến tính protein bao quanh khung polypeptide khiến phân tử duỗi thẳng Mỗi phân tử SDS cung cấp hai điện tích âm, phân tử protein tích điện tỷ lệ với khối lượng phân tử chúng (hay chiều dài mạch) Khi xử lý SDS chất khử, protein có dạng hình cầu tích điện âm với số 16 điện tích đơn vị chiều dài Sau chạy điện di, vị trí bang dọc theo giếng cho biết giá trị gầ kích thước lượng protein có mẫu (căn vào độ bắt màu sau nhuộm), dựa vào đánh giá về: + Độ + Mức độ biểu + Điện chuyển miễn dịch + Chuẩn bị phân tích trình tự + Tạo khánh thể nhờ SDS-PAGE 4.4.3 Hóa chất điện di - Acrylamide 40% - Resolving Buffer pH 8.8 - Stacking Buffer pH 6.8 - APS 10% (Amonium persulfate) - Nước cất - Tris-Glycine Running Buffer - Staining solution (dung dịch nhuộm) - Destaining solution (dung dịch rửa màu) - Dung dịch xử lý mẫu - TEDMED 4.4.4 Các bước tiến hành Chuẩn bị gel điện di Gel polyacrylamide thường đặt đứng Rửa thủy tinh nước, để khô Ráp thủy tinh với silicone giữa, đặt lên giá đỡ kẹp lại Phần mặt chữ U thủy tinh hướng phía người sử dụng Chuẩn bị dung dịch resolving gel 17 Bảng Thành phần dung dịch resolving gel Dung dịch Polyacrylamide 12% Acrylamide 40% 2.4 mL Resolving Buffer 2.0 mL Nước cất 3.5 mL APS 10% 80 µL Tổng mL Thêm µL TEDMED vào mL dung dịch resolving gel Trộn đổ gel vào giếng Đổ resolving gel - Nghiêng giá đỡ - Dùng pipet hút dung dịch gel cho nhẹ nhàng vào khoảng hai thủy tinh chạm đến vạch có mặt kính - Thêm vào bề mặt gel khoảng 0.5-1.0 mL nước - Đặt giá đỡ vị trí ban đầu đợi gel đông lại khoảng từ đến 10 phút - Khi gel đông, đổ lớp nước dung giấy thấm nước đọng lại giếng Chuẩn bị dung dịch Stacking gel Bảng Thành phần dung dịch stacking gel Dung dịch 4% Acrylamide 40% 0.30 mL Stacking Buffer 0.75 mL Nước cất 1.92 mL APS 10% 30 µL Tổng mL 18 Thêm µL TEDMED vào mL dung dịch resolving gel Trộn đổ gel vào giếng Đổ stacking gel - Nghiêng giá đỡ để dung dịch chạm đáy - Cho dung dịch stacking gel vào nhẹ nhàng chạm vào cạnh kính phía trước - Đặt giá đỡ vị trí thẳng đứng - Đặt lược vào từ từ vị trí đầu trượt kính hai đầu vào vị trí - Để stacking gel đơng lại (khoảng 10 phút) - Kiếm tra đông gel cách xem lượng gel dư lại đơng chưa - Bỏ kẹp lược Gel sử dụng gói giấy thấm nước giữ nhiệt độ 4oC cho lần sau Sau gel đông lại, tháo kính khỏi giá đỡ Lắp kính có gel vào khung điện cực, đổ đệm điện di vào khung điện cực Xử lý mẫu - Hòa tan mẫu vào dung môi pha mẫu theo tỉ lệ 1:2 (Vdm pha mẫu : Vmẫu) để nồng độ protein vào khoảng 1mg/mL - Đun cách thủy phút nóng phút lạnh, lặp lại lần - Để nhiệt độ phòng Tiến hành điện di - Nhẹ nhàng lấy lược khỏi điện di - Đặt Multi-use Tool kính 19 - Bơm mẫu vào giếng với lượng khoảng 10 - 15 µL Thang chuẩn với lượng tương tự Thang chuẩn có phân tử lượng protein khoảng 20 – 120 kDa - Đóng nắp hộp điện di, tiến hành chạy điện di với dòng điện ổn định 125V 80-140 phút Nhuộm gel rửa nhuộm - Sau lấy gel ra, cho gel vào hộp có chứa dung dịch nhuộm protein (Staining solution) - Lắc nhẹ cho dung dịch thấm vào gel Đợi khoảng 10-30 phút - Chuyển gel sang dung dịch rửa màu (destaining solution), thay dung dịch rửa khoảng đến lần với khoảng thời gian khoảng 10 phút/ lần miếng gel có màu suốt xuất vạch xanh lơ gel 20 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Biuret 1.1 Đường chuẩn Biuret Bảng Kết đo OD đường chuẩn Biuret Biuret OD 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.083 0.098 0.154 0.187 0.231 OD y = 0.1925x + 0.0351 R² = 0.9792 0.25 0.2 0.15 OD Linear (OD) 0.1 0.05 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 Hình Phương trình đường chuẩn Biuret 21 1.2 Kết đo nồng độ protein Bảng Kết đo nồng độ protein phương pháp Biuret Môi trường OD ODtb Nồng độ protein 0.184 23.21 0.1705 21.10 0.138 5.35 0.005 - 0.186 E0 0.182 0.173 E1 0.168 0.159 E2 0.117 0.008 E3 0.002 Nhận xét: - Hàm lượng protein E0 cao nhất, E3 thấp Bàn luận: - Ở môi trường E0 E1, sau nuôi cấy lỏng lắc 24h ta đem định lượng protein Điều nói lên enzyme protease có khả chưa bị thủy phân nhiều môi trường E2 E3 - Ở mơi trường E0, vi sinh vật, dẫn đến độ đục mẫu đem đo OD cao - Sau đo hoạt tính E1, nhóm trữ lại tuần sau đo hoạt tính E2 Q trình trữ làm hoạt tính lượng protease bị giảm - Dung dịch Biuret pha chưa xác hồn tồn, pha lỗng enzyme Điều dẫn tới sai số - Enzyme khơng phân bố hút - Kết đo OD mẫu E3 thấp phương trình đường chuẩn nên khơng thể tính hàm lượng protein 22 Anson 2.1 Đường chuẩn Tyrosine Bảng 10 Kết OD đường chuẩn Tyrosine Tyrosine OD 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.219 0.285 0.324 0.370 0.387 OD y = 0.2105x + 0.1907 R² = 0.964 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 OD 0.2 Linear (OD) 0.15 0.1 0.05 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 Hình Phương trình đường chuẩn Tyrosine 2.2 Kết đo Anson Bảng 11 Kết đo OD phương pháp Anson Kết OD Thử thật Mẫu Thử không E0 0.350 0.299 0.236 0.298 E1 0.389 0.363 0.368 0.354 E2 0.145 0.144 0.145 0.140 E3 0.056 0.053 0.047 0.046 23 Hoạt độ riêng protease: E (U/mg) = (𝐶𝑡𝑡−𝐶𝑡𝑘)×𝑉×1000 10×1×𝑤 Bảng 12 Kết hoạt tính riêng protease Thử thật Thử không Mẫu E ODtb Ctt ODtb Ctk E0 0.325 0.637 0.267 0.3625 0.1176 E1 0.376 0.880 0.361 0.809 0.0336 E2 0.145 - 0.143 - - E 0.055 - 0.047 - - Nhận xét: - Hoạt độ mẫu E0 cao - Mẫu E2 E3 bị hoạt tính Bàn luận: - Mẫu E0 sau ni cấy lỏng lắc 24h mẫu E1 sau ly tâm liền mang đo Anson nên hoạt tính enzyme không đáng kể - Mẫu E2 bảo quản tủ lạnh khoảng thời gian lâu, tủa sau ly tâm khơng hòa tan vào đệm liền mà trữ ngăn đá tủ lạnh, sau hòa tan (do hóa chất hết nên khơng pha đệm được) - Thao tác tiến hành góp phần ảnh hưởng sai số thí nghiệm - Do tủa cồn (cồn ảnh hưởng phần đến hoạt tính enzyme) 24 Lọc gel Hình Đồ thị sắc ký q trình lọc gel Nhận xét: Mẫu hoạt tính khơng cao Đồ thị sắc ký trình lọc gel xuất peak Bàn luận: - Do cột gel có nhiều bọt khí nên q trình lọc khơng xác dẫn tới sai số kết - Tỉ lệ pha loãng lớn, pha loãng tỉ lệ 20 lần → nồng độ enzyme thấp, nên giá trị OD nhỏ - Mẫu trữ lâu (1 tuần) nên bị hoạt tính - Do nhóm khơng đủ thời gian để hứng 20 ống theo phương pháp nên nhóm peak 25 Điện di Bảng 13 Kết điện di Giếng Mẫu Mẫu E0 X Nhóm E1 Hình Thang chuẩn[5] Nhóm E2 X Mẫu chuẩn 10 Mẫu Nhóm E3 Hình Kết điện di Nhận xét - Giếng không đẹp, nhiều giếng bị hỏng - Băng điện di chạy không bị lệch - Thang chuẩn có vệt - Bảng gel có màu xanh, gel chưa suốt - Giếng có xuất vạch đậm nằm ngồi thang chuẩn - Giếng có xuất vạch nhạt nằm thang chuẩn 26 - Giếng có xuất vạch nhạt nằm thang chuẩn, có kích thước khoảng 34kDa - Các giếng lại không xuất vạch Bàn luận - Khi chuẩn bị stacking gel, lúc cho TEDMED vào không chạm bề mặt hỗn hợp, chưa Vortex nên gel đông không - Rửa gel không kỹ nên bảng gel màu xanh thuốc nhuộm - Khi bơm mẫu vào giếng, thao tác thực chưa chuẩn giếng cạn nên mẫu bị tràn sang giếng Vì vậy, trường hợp xảy ra: + Thứ nhất: Vạch giếng số không xác định rõ mẫu bị trộn mẫu lại với Khi kích thước protein mẫu tương tự + Thứ hai: Vạch giếng só protein mẫu E1, giếng không xuất vạch tức lượng protein giếng q nên khơng ảnh hưởng đến mẫu giếng - Những giếng không xuất khơng protein 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1][3] http://timtailieu.vn/tai-lieu/thu-nhan-ung-dung-cua-enzyme-protease-32354/ [2] http://kythuatnuoitrong.com/dac-tinh-sinh-hoc-cua-vi-khuan-bacillus-sutilis/ [4] Trần Hồng Thắng, Khảo sát hoạt độ enzyme protease thu nhận từ Bacillus subtilis cố định gel Alginate, 109 (2016) [5]https://www.biobasic.com/products/electrophoresis-related/ladders-protein/20-120kda/20-120kda-mid-range-protein-molecular-weight-marker-prestained Tài liệu cung cấp TS Huỳnh Ngọc Oanh – trưởng phòng thí nghiệm Cơng Nghệ Sinh Học trường ĐH Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh 28 ... http://kythuatnuoitrong.com/dac-tinh-sinh-hoc-cua-vi-khuan -bacillus- sutilis/ [4] Trần Hồng Thắng, Khảo sát hoạt độ enzyme protease thu nhận từ Bacillus subtilis cố định gel Alginate, 109 (2016) [5]https://www.biobasic.com/products/electrophoresis-related/ladders-protein/20-120kda/20-120kda-mid-range-protein-molecular-weight-marker-prestained... vật (Bacillus subtillis, nấm mốc Aspergillus oryzae,…) Bacillus subtilis Bacillus subtilis thu c giới Bacteria, ngành Firmicutes, lớp Bacilli, Bacillales họ Bacillaceae, giống Bacillus, loài Bacillus. .. suất, chất sát trùng sống vài năm đến vài chục năm.[2] B subtilis có khả tiết enzyme protease mơi trường nuôi cấy để phân giải chất dinh dưỡng có mơi trường Ứng dụng enzyme protease Enzyme protease