Khảo sát hệ enzyme cellulase thu nhận từ cộng đồng vi khuẩn trong dạ cỏ bò để phân giải rơm qua xử lý

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HỆ ENZYME CELLULASE THU NHẬN TỪ CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN TRONG DẠ CỎ BÒ ĐỂ PHÂN GIẢI RƠM QUA XỬ LÝ Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS HOÀNG QUỐC KHÁNH CN.NGÔ ĐỨC DUY Sinh viên thực hiện: LƯU THÁI HỊA MSSV: 1051110075 Lớp: 10DSH02 TP Hồ Chí Minh, 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đồ án tốt nghiệp kết nghiên cứu riêng hướng dẫn TS Hoàng Quốc Khánh CN Ngô Đức Duy, không chép Nội dung luận văn có tham khảo sử dụng tài liệu, thông tin đăng tải tác phẩm, tạp chí trang web theo danh mục tài liệu đồ án Nếu sai xin chịu hoàn toàn trách nhiệm kỷ luật khoa nhà trường đề Sinh viên thực Lưu Thái Hòa LỜI CẢM ƠN Trong thời gian làm đồ án tốt nghiệp Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thủ Đức, hướng dẫn tận tình Thầy Cơ, anh chị bạn, em hồn thành tốt báo cáo Em xin cảm ơn chân thành đến: Thầy TS Hồng Quốc Khánh, trưởng phòng Vi Sinh ứng dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học Công Nghệ Việt Nam, Thầy tạo điều kiện cho em làm đồ án tốt nghiệp đây, nhiệt tình hướng dẫn hỗ trợ để em thực tốt đồ án tốt nghiệp Thầy Ngô Đức Duy phòng Vi Sinh ứng dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học Công Nghệ Việt Nam tận tình bảo giúp đỡ em suốt thời gian thực đồ án tốt nghiệp Ban giám hiệu Trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM tồn thể Thầy Cơ khoa Cơng Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường người tận tình dạy dỗ, tạo điều kiện để chúng em học tập tốt, tận tình giúp đỡ, quan tâm đến việc học tập chúng em suốt năm qua Các anh chị phòng Thí Nghiệm Vi Sinh Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học Công Nghệ Việt Nam cung cấp cho em số liệu mà em cần, em làm qui trình thực nghiệm Tất bạn lớp 10DSH02 thân yêu an ủi động viên hồn thành tốt khóa luận này, bạn quan tâm, giúp đỡ chia sẻ thứ với suốt thời sinh viên Và xin cám ơn Bố Mẹ, chị hai, em gái, người thân ln động viên con, giúp có nghị lực để hồn thành đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC iv TỪ DANH VIẾT MỤC CÁC TẮT BẢNG v DANH MỤC BIỂU ĐỒ v DANH MỤC SƠ ĐỒ vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vi LỜI MỞ ĐẦU 1.Tính cấp thiết đề tài 2.Tình hình nghiên cứu .1 3.Mục đích nghiên cứu .2 4.Nhiệm vụ nghiên cứu .2 5.Phương pháp nghiên cứu .3 6.Các kết đạt đề tài .3 7.Kết cấu đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu cộng đồng vi khuẩn cỏ bò .4 1.1.1 Hệ vi sinh vật cỏ bò 1.1.2.Vi khuẩn phân giải cellulose cỏ bò 1.1.3 Điều kiện vật lý cỏ bò 1.2 Giới thiệu hệ enzym cellulase .10 1.2.1 Định nghĩa 10 1.2.2 Phân loại 10 1.2.3 Cấu tạo cellulase 11 1.2.4 Tính chất 11 i 1.2.5 Các chất ức chế 12 i 1.2.6 Cellulosome .12 1.3 Phân giải rơm qua xử lý 13 1.3.1 Thành phần rơm 13 1.3.2 Cấu trúc rơm tự nhiên 14 1.3.3 Các phương pháp tiền xử lý rơm rạ 15 1.3.4 Con đường phân giải rơm 17 1.4 Hiện trạng sử dụng rơm rạ Việt Nam nước giới 18 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Nguyên vật liệu 20 2.2 Thiết bị, hóa chất 21 2.2.1 Thiết bị .21 2.2.2 Hóa chất 21 2.3 Phương pháp nghiên cứu 24 2.3.1 Quy trình tăng sinh chọn lọc 25 2.3.2 Quy trình tăng sinh khảo sát nhiệt độ phát triển hệ vi sinh vật .26 2.3.3 Quy trình tăng sinh khảo sát pH phát triển hệ vi sinh vật .27 2.4 Xác định hàm lượng, hoạt tính enzyme cellulase .28 2.4.1 Quy trình phát sinh tổng hợp enzyme endoglucanase thạch đĩa CMC .28 2.4.2 Định lượng hàm lượng protein tổng dịch nuôi cấy theo phương pháp Bradford 28 2.4.3 Định lượng hoạt tính cellulase tổng số theo phương pháp Filter Paper 30 2.5 Khảo sát nhiệt độ, pH thích hợp hệ enzyme cellulase 31 2.5.1 Ảnh hưởng pH lên hoạt tính cellulase 32 ii 2.5.2 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính cellulase .32 2.6 Khảo sát trình enzyme cellulase thủy phân cellulose từ rơm rạ 32 2.6.1 Định lượng đường khử phương pháp DNS 33 2.6.2 Khả phân giải rơm rạ .34 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 35 3.1 Kết tăng sinh môi trường PCS 35 3.2 Kết khảo sát nhiệt độ phát triển hệ vi sinh vật 38 3.3 Kết khảo sát pH phát triển hệ vi sinh vật 39 3.4 Kết hàm lượng protein tổngtheo phương pháp Bradford 42 3.5 Kết đo hoạt tính cellulase tổng số theo phương pháp Filter Paper 43 3.5.1 Kết khảo sát ảnh hưởng pH lên hoạt tính cellulase 43 3.5.2 Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính cellulase 44 3.6 Kết đo lượng đường khử sau phân giải rơm theo phương pháp DNS 46 3.7 Kết phân giải rơm rạ 48 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49 4.1.Kết luận .49 4.2.Đề nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CMC carboxymethyl cellulose DNS Acid Dinitro – Salicylic FP phương pháp filter paper mg miligram ml mililiter DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Dung dịch đệm citrate .22 Bảng 2.2 Dung dịch đệm phosphate 22 Bảng 2.3 Thông số xây dựng đường chuẩn albumin .29 Bảng 2.4 Thông số xây dựng đường chuẩn glucose 30 Bảng 3.1 Kết kiểm tra ngày phân giải giấy lọc môi trường PCS vòng phân giải đĩa thạch CMC 37℃, pH 7,0 35 Bảng 3.2 Kết khảo sát phân hủy giấy lọc CMC 37℃, pH 7,0 38 Bảng 3.3 Kết khảo sát phân hủy giấy lọc CMC 39℃, pH 7,0 38 Bảng 3.4 Kết khảo sát phân hủy giấy lọc CMC 41℃, pH 7,0 .39 Bảng 3.5 Kết khảo sát phân hủy giấy lọc CMC pH khác .40 Bảng 3.6 Nồng độ protein tổng mẫu vi sinh vật cỏ bò 42 Bảng 3.7 Giá trị OD540nm mẫu khảo sát hoạt tính cellulase thay đổi pH từ 6,0 – 6,9 39℃ 43 Bảng 3.8 Giá trị OD540nm mẫu khảo sát hoạt tính cellulase thay đổi nhiệt độ 37℃, 39℃, 41℃ pH tối ưu 44 Bảng 3.9 Kết hoạt tính cellulase tổng số theo phương pháp FP .45 Bảng 3.10 Kết hàm lượng glucose dịch sau phân giải rơm mẫu enzyme cellulase .47 Bảng 3.11 Khả phân giải rơm mẫu enzyme cellulase 48 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Nồng độ protein tổng mẫu vi sinh vật cỏ bò 42 Biểu đồ 3.2 Hoạt tính cellulase tổng số mẫu enzyme cellulase .45 Biểu đồ 3.3 Hàm lượng glucose tạo thành dịch sau phân giải rơm mẫu enzyme cellulase .47 Biểu đồ 3.4 Khả phân giải rơm mẫu enzyme cellulase 48 PHỤ LỤC 2: Một số hình ảnh kết kiểm tra ngày phân giải giấy lọc đường kính vòng phân giải CMC bước tăng sinh, chọn lọc 37°C, pH 7.0 ❖ Kết kiểm tra ngày phân giải giấy lọc bình tăng sinh môi trường PCS ➢ Sau ngày ❖ Kết kiểm tra đường kính vòng phân giải CMC đĩa thạch CMC ➢ Sau ngày ➢ Sau 10 ngày ➢ Sau 13 ngày ❖ mẫu cỏ bò 37°C, pH 7.0 chọn đầu tiên: 4, 5, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 22, 24 PHỤ LỤC 3: Một số hình ảnh kết kiểm tra ngày phân giải giấy lọc đường kính vòng phân giải CMC bước tối ưu nhiệt độ phát triển ❖ Tại 37℃, pH 7.0 (tham khảo phụ lục 2) ❖ Tại 39℃, pH 7.0 ➢ Sau ngày Kết kiểm tra ngày phân giải giấy lọc từ bình tăng sinh PCS Kết kiểm tra đường kính vòng phân giải CMC ➢ Sau 10 ngày Sau 13 ngày ❖ Tại 41°C, pH 7.0 ➢ Sau ngày Kết kiểm tra ngày phân giải giấy lọc từ bình tăng sinh PCS Kết kiểm tra đường kính vòng phân giải CMC ➢ Sau 10 ngày ➢ Sau 13 ngày PHỤ LỤC 4: Một số hình ảnh kết kiểm tra ngày phân giải giấy lọc đường kính vòng phân giải CMC bước tối ưu pH phát triển ➢ Sau ngày Mẫu ngày phân giải giấy lọc Đường kính vòng phân giải CMC M4 M5 M15 M16 M17 M19 M20 M22 M24 10 ➢ Sau 10 ngày Mẫu 10 ngày phân giải giấy lọc Đường kính vòng phân giải CMC M4 M5 M15 M16 11 M17 M19 M20 M22 M24 12 ➢ Sau 13 ngày 13 PHỤ LỤC 5: Tối ưu điều kiện mơi trường cho hoạt tính enzyme cellulase theo phương pháp FPA O O O M D D ẫ D u e g Ms 0 , 0 M 0 , 0 M 0 , M 0 , 0 M 0 , 0 M 0 , M 0 , 0 M 0 , 0 M 0 , 0 N ∆ n , 0O , , , , , , , , g0 0 1 ∆OD = ODsau phản ứng – ODenzyme+đệm – OD giấy lọc+đệm Từ phương trình đường chuẩn glucose ta suy ta hàm lượng đường X (mg/ml) Hàm lượng đường ml mẫu= (∆��+0.055)∗�∗ 0.74∗� Trong đó: n: độ pha lỗng enzyme (3 lần) V: thể tích mẫu đo OD (1 ml) m: khối lượng mẫu (0,5 ml) 14 PHỤ LỤC 6: Đo lượng đường khử sau phân giải rơm theo phương pháp DNS Từ phương trình đường chuẩn glucose ta suy ta hàm lượng đường X (mg/ml) Hàm lượng đường ml mẫu= ( �� + 0.055) ∗ �∗ � 0.74∗ � Trong đó: n: độ pha lỗng enzyme (9,09lần) V: thể tích mẫu đo OD (1ml) m: khối lượng mẫu (1ml) • Giá trị OD 540nm sau 2, 3, ngày enzyme phân giải rơm qua xử lý M M M M , , , , , , , , , , , , , , , PHỤ LỤC 7: Khả sử dụng rơm rạ % Rơm thủy phân= � ơ� � ị � ℎủ ��ℎ â � ��ơ� ��� đầ� GR R R R i ơ ơ M ấm m ẫ ( (23m m (( u ) M 0 , , , , M 0 , , , , M 0 , , , , ∗ 100 PHỤ LỤC 8: Dựng đường chuẩn Bradford Glucose ➢ Đường chuẩn glucose N n 0 0 Đường chuẩn glucose 0.3 y = 0.74x - 0.055 R² = 0.9993 0.25 OD 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0.1 0.2 0.3 Nồng độ glucose 0.4 0.5 ➢ Đường chuẩn albumin N n g Đường Chuẩn Bradford 0.12 y = R 0.1 OD 0.08 0.06 0.04 0.02 0 10 20 30 40 Nồng Độ Protein 50 60 ... CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu cộng đồng vi khuẩn cỏ bò .4 1.1.1 Hệ vi sinh vật cỏ bò 1.1.2 .Vi khuẩn phân giải cellulose cỏ bò 1.1.3 Điều kiện vật lý cỏ bò ... triển cộng đồng vi sinh cỏ bò có khả sinh hệ enzyme cellulase Thu nhận tối ưu hóa điều kiện môi trường ảnh hưởng lên hoạt tính enzyme hệ enzyme cellulase có khả phân giải cellulose Thu nhận hệ enzyme. .. 4.Nhiệm vụ nghiên cứu Chọn lọc cộng đồng vi khuẩn sinh hệ enzyme cellulase từ cỏ bò Tối ưu hóa điều kiện phát triển cộng đồng vi khuẩn cỏ bò Chọn lọc hệ enzyme cellulase tiềm Tối ưu hóa nhiệt