Khảo Sát Hệ Enzyme Cellulase Thu Nhận Từ Cộng Đồng Vi Khuẩn Trong Dạ Cỏ Bò Để Phân Giải Rơm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HỆ ENZYME CELLULASE THU NHẬN TỪ CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN TRONG DẠ CỎ BÒ ĐỂ PHÂN GIẢI RƠM QUA XỬ LÝ Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS HOÀNG QUỐC KHÁNH CN.NGÔ ĐỨC DUY Sinh viên thực hiện: LƯU THÁI HỊA MSSV: 1051110075 Lớp: 10DSH02 TP Hồ Chí Minh, 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đồ án tốt nghiệp kết nghiên cứu riêng hướng dẫn TS Hoàng Quốc Khánh CN Ngô Đức Duy, không chép Nội dung luận văn có tham khảo sử dụng tài liệu, thông tin đăng tải tác phẩm, tạp chí trang web theo danh mục tài liệu đồ án Nếu sai xin chịu hoàn toàn trách nhiệm kỷ luật khoa nhà trường đề Sinh viên thực Lưu Thái Hòa LỜI CẢM ƠN Trong thời gian làm đồ án tốt nghiệp Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thủ Đức, hướng dẫn tận tình Thầy Cơ, anh chị bạn, em hồn thành tốt báo cáo Em xin cảm ơn chân thành đến: Thầy TS Hồng Quốc Khánh, trưởng phòng Vi Sinh ứng dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học Công Nghệ Việt Nam, Thầy tạo điều kiện cho em làm đồ án tốt nghiệp đây, nhiệt tình hướng dẫn hỗ trợ để em thực tốt đồ án tốt nghiệp Thầy Ngô Đức Duy phòng Vi Sinh ứng dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học Công Nghệ Việt Nam tận tình bảo giúp đỡ em suốt thời gian thực đồ án tốt nghiệp Ban giám hiệu Trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM tồn thể Thầy Cơ khoa Cơng Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường người tận tình dạy dỗ, tạo điều kiện để chúng em học tập tốt, tận tình giúp đỡ, quan tâm đến việc học tập chúng em suốt năm qua Các anh chị phòng Thí Nghiệm Vi Sinh Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học Công Nghệ Việt Nam cung cấp cho em số liệu mà em cần, em làm qui trình thực nghiệm Tất bạn lớp 10DSH02 thân yêu an ủi động viên hồn thành tốt khóa luận này, bạn quan tâm, giúp đỡ chia sẻ thứ với suốt thời sinh viên Và xin cám ơn Bố Mẹ, chị hai, em gái, người thân ln động viên con, giúp có nghị lực để hồn thành đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC BIỂU ĐỒ v DANH MỤC SƠ ĐỒ vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vi LỜI MỞ ĐẦU 1.Tính cấp thiết đề tài 2.Tình hình nghiên cứu .1 3.Mục đích nghiên cứu .2 4.Nhiệm vụ nghiên cứu .2 5.Phương pháp nghiên cứu .3 6.Các kết đạt đề tài .3 7.Kết cấu đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu cộng đồng vi khuẩn cỏ bò .4 1.1.1 Hệ vi sinh vật cỏ bò 1.1.2.Vi khuẩn phân giải cellulose cỏ bò 1.1.3 Điều kiện vật lý cỏ bò 1.2 Giới thiệu hệ enzym cellulase .10 1.2.1 Định nghĩa 10 1.2.2 Phân loại 10 1.2.3 Cấu tạo cellulase 11 1.2.4 Tính chất 11 1.2.5 Các chất ức chế 12 i 1.2.6 Cellulosome .12 1.3 Phân giải rơm qua xử lý 13 1.3.1 Thành phần rơm 13 1.3.2 Cấu trúc rơm tự nhiên 14 1.3.3 Các phương pháp tiền xử lý rơm rạ 15 1.3.4 Con đường phân giải rơm 17 1.4 Hiện trạng sử dụng rơm rạ Việt Nam nước giới 18 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Nguyên vật liệu 20 2.2 Thiết bị, hóa chất 21 2.2.1 Thiết bị .21 2.2.2 Hóa chất 21 2.3 Phương pháp nghiên cứu 24 2.3.1 Quy trình tăng sinh chọn lọc 25 2.3.2 Quy trình tăng sinh khảo sát nhiệt độ phát triển hệ vi sinh vật .26 2.3.3 Quy trình tăng sinh khảo sát pH phát triển hệ vi sinh vật .27 2.4 Xác định hàm lượng, hoạt tính enzyme cellulase .28 2.4.1 Quy trình phát sinh tổng hợp enzyme endoglucanase thạch đĩa CMC .28 2.4.2 Định lượng hàm lượng protein tổng dịch nuôi cấy theo phương pháp Bradford 28 2.4.3 Định lượng hoạt tính cellulase tổng số theo phương pháp Filter Paper 30 2.5 Khảo sát nhiệt độ, pH thích hợp hệ enzyme cellulase 31 2.5.1 Ảnh hưởng pH lên hoạt tính cellulase 32 ii 2.5.2 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính cellulase .32 2.6 Khảo sát trình enzyme cellulase thủy phân cellulose từ rơm rạ 32 2.6.1 Định lượng đường khử phương pháp DNS 33 2.6.2 Khả phân giải rơm rạ .34 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 35 3.1 Kết tăng sinh môi trường PCS 35 3.2 Kết khảo sát nhiệt độ phát triển hệ vi sinh vật 38 3.3 Kết khảo sát pH phát triển hệ vi sinh vật 39 3.4 Kết hàm lượng protein tổngtheo phương pháp Bradford 42 3.5 Kết đo hoạt tính cellulase tổng số theo phương pháp Filter Paper 43 3.5.1 Kết khảo sát ảnh hưởng pH lên hoạt tính cellulase 43 3.5.2 Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính cellulase 44 3.6 Kết đo lượng đường khử sau phân giải rơm theo phương pháp DNS 46 3.7 Kết phân giải rơm rạ 48 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49 4.1.Kết luận .49 4.2.Đề nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CMC carboxymethyl cellulose DNS Acid Dinitro – Salicylic FP phương pháp filter paper mg miligram ml mililiter iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Dung dịch đệm citrate 22 Bảng 2.2 Dung dịch đệm phosphate 22 Bảng 2.3 Thông số xây dựng đường chuẩn albumin 29 Bảng 2.4 Thông số xây dựng đường chuẩn glucose 30 Bảng 3.1 Kết kiểm tra ngày phân giải giấy lọc mơi trường PCS vòng phân giải đĩa thạch CMC 37℃, pH 7,0 35 Bảng 3.2 Kết khảo sát phân hủy giấy lọc CMC 37℃, pH 7,0 38 Bảng 3.3 Kết khảo sát phân hủy giấy lọc CMC 39℃, pH 7,0 38 Bảng 3.4 Kết khảo sát phân hủy giấy lọc CMC 41℃, pH 7,0 39 Bảng 3.5 Kết khảo sát phân hủy giấy lọc CMC pH khác 40 Bảng 3.6 Nồng độ protein tổng mẫu vi sinh vật cỏ bò 42 Bảng 3.7 Giá trị OD540nm mẫu khảo sát hoạt tính cellulase thay đổi pH từ 6,0 – 6,9 39℃ 43 Bảng 3.8 Giá trị OD540nm mẫu khảo sát hoạt tính cellulase thay đổi nhiệt độ 37℃, 39℃, 41℃ pH tối ưu 44 Bảng 3.9 Kết hoạt tính cellulase tổng số theo phương pháp FP 45 Bảng 3.10 Kết hàm lượng glucose dịch sau phân giải rơm mẫu enzyme cellulase 47 Bảng 3.11 Khả phân giải rơm mẫu enzyme cellulase 48 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Nồng độ protein tổng mẫu vi sinh vật cỏ bò 42 Biểu đồ 3.2 Hoạt tính cellulase tổng số mẫu enzyme cellulase 45 Biểu đồ 3.3 Hàm lượng glucose tạo thành dịch sau phân giải rơm mẫu enzyme cellulase 47 Biểu đồ 3.4 Khả phân giải rơm mẫu enzyme cellulase 48 v DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Quy trình thu nhận enzyme cellulase 20 Sơ đồ 2.2 Tóm tắt tồn thí nghiệm 24 Sơ đồ 2.3 Quy trình tăng sinh chọn lọc mẫu 25 Sơ đồ 2.4 Quy trình khảo sát nhiệt độ phát triển hệ vi sinh vật 26 Sơ đồ 2.5 Quy trình khảo sát pH phát triển hệ vi sinh vật 27 Sơ đồ 2.6 Quy trình phân giải rơm hệ enzyme cellulase 32 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hệ tiêu hóa trâu bò Hình 1.2.Protazoa với vi khuẩn bào tử nấm Hình 1.3.Ruminococcus flavefaciens Hình 1.4 Thành phần lignocellulose 13 Hình 1.5 Cấu trúc hiển vi lignocellulose 14 Hình 1.6 Cấu trúc lignocellulose 15 Hình 1.7 Cơ chế hoạt động enzyme cellulase theo Erikson 17 Hình 3.1 Chín mẫu cỏ bò tăng sinh 37℃, pH 7,0 36 Hình 3.2.Vòng phân giải đĩa thạch CMC mẫu cò bò 37℃, pH 7,0 sau 07 ngày tăng sinh môi trường PCS 37 Hình 3.3.Vòng phân giải đĩa thạch CMC mẫu cò bò 37℃, pH 7,0 sau 10 ngày tăng sinh môi trường PCS 37 Hình 3.4.Vòng phân giải đĩa thạch CMC mẫu cò bò 37℃, pH 7,0 sau 13 ngày tăng sinh môi trường PCS 37 vi Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU 1.Tính cấp thiết đề tài Hiện nguồn phế thải hữu nhà máy công nghiệp chế biến thực phẩm thải lớn như: rơm rạ, trấu, bã mía, cám mì, agar…Các phế thải có thành phần cellulose Cellulose có thể bị thủy phân môi trường kiềm hoặc axit.Tuy nhiên việc phân hủy cellulose phương pháp vật lý hóa học phức tạp, tốn gây độc hại cho môi trường Trong đó, việc xử lý chất thải hữu chứa cellulose công nghệ sinh học, đặc biệt sử dụng enzyme cellulase ngoại bào từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm mặt kỹ thuật, kinh tế mơi trường Số lượng lồi vi sinh vật tham gia sinh tổng hợp enzyme cellulase có điều kiện tự nhiên phong phú Trên giới đã có nhiều nghiên cứu thành công từ việc thu nhận dịch cỏ động vật nhai lại ứng dụng để tạo chế phẩm cellulase công nghiệp Ở Việt Nam, nghiên cứu cộng đồng hệ enzyme cellulase chưa quan tâm nhiều, đa phần chủ yếu nghiên cứu tính đơn lẻ phức hệ enzyme cellulase Và hướng nghiên cứu cộng đồng hệ enzyme cellulase nhằm đáp ứng phần nghiên cứu phân giải cellulose từ biomasss định hướng cho phát triển nguồn nhiên liệu sinh học tương lai Do vậy, đề tài: “ Khảo sát hệ enzyme cellulase thu nhận từ cộng đồng vi khuẩn cỏ bò để phân giải rơm qua xử lý” góp phần vào nghiên cứu ứng dụng sản xuất công nghiệp cho tương lai 2.Tình hình nghiên cứu 2.1 Thế giới Trên giới đã có nhiều nghiên cứu sử dụng hệ vi sinh vật từ cỏ lồi nhai lại có khả sinh enzyme celulase để phân giải rơm rạ, xử lý chất thải công nghiệp biomass Đó nghiên cứu Oyeleke.et.al (2008)[21], Faridha Begum.I.er.al (2013) [22]… Nghiên cứu để sản xuất nhiên liệu sạch, thân thiện với môi trường từ biomass đặc biệt thay nguồn lượng hóa thạch Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC 2: Một số hình ảnh kết kiểm tra ngày phân giải giấy lọc đường kính vòng phân giải CMC bước tăng sinh, chọn lọc 37°C, pH 7.0 ❖ Kết kiểm tra ngày phân giải giấy lọc bình tăng sinh mơi trường PCS ➢ Sau ngày ❖ Kết kiểm tra đường kính vòng phân giải CMC đĩa thạch CMC Đồ án tốt nghiệp ➢ Sau ngày ➢ Sau 10 ngày Đồ án tốt nghiệp ➢ Sau 13 ngày ❖ mẫu cỏ bò 37°C, pH 7.0 chọn đầu tiên: 4, 5, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 22, 24 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC 3: Một số hình ảnh kết kiểm tra ngày phân giải giấy lọc đường kính vòng phân giải CMC bước tối ưu nhiệt độ phát triển ❖ Tại 37℃, pH 7.0 (tham khảo phụ lục 2) ❖ Tại 39℃, pH 7.0 ➢ Sau ngày Kết kiểm tra ngày phân giải giấy lọc từ bình tăng sinh PCS Kết kiểm tra đường kính vòng phân giải CMC ➢ Sau 10 ngày Đồ án tốt nghiệp Sau 13 ngày ❖ Tại 41°C, pH 7.0 ➢ Sau ngày Kết kiểm tra ngày phân giải giấy lọc từ bình tăng sinh PCS Kết kiểm tra đường kính vòng phân giải CMC Đồ án tốt nghiệp ➢ Sau 10 ngày ➢ Sau 13 ngày Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC 4: Một số hình ảnh kết kiểm tra ngày phân giải giấy lọc đường kính vòng phân giải CMC bước tối ưu pH phát triển ➢ Sau ngày Mẫu Đường kính vòng phân giải CMC ngày phân giải giấy lọc M4 M5 M15 M16 Đồ án tốt nghiệp M17 M19 M20 M22 M24 10 Đồ án tốt nghiệp ➢ Sau 10 ngày Mẫu Đường kính vòng phân giải CMC 10 ngày phân giải giấy lọc M4 M5 M15 M16 11 Đồ án tốt nghiệp M17 M19 M20 M22 M24 12 Đồ án tốt nghiệp ➢ Sau 13 ngày 13 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC 5: Tối ưu điều kiện môi trường cho hoạt tính enzyme cellulase theo phương pháp FPA Nồng độ OD sau OD enzyme OD giấy lọc phản ứng đệm đệm M4 0,087 0,038 0,010 0,039 0,762 M5 0,093 0,045 0,010 0,038 0,754 M15 0,175 0,102 0,010 0,063 0,957 M16 0,125 0,042 0,010 0,073 1,038 M17 0,114 0,074 0,010 0,030 0,689 M19 0,207 0,100 0,010 0,097 1,232 M20 0,120 0,064 0,010 0,046 0,819 M22 0,211 0,040 0,010 0,161 1,751 M24 0,124 0,051 0,010 0,063 0,957 Mẫu ∆OD Gluocose (mg/ml) ∆OD = ODsau phản ứng – ODenzyme+đệm – OD giấy lọc+đệm Từ phương trình đường chuẩn glucose ta suy ta hàm lượng đường X (mg/ml) Hàm lượng đường ml mẫu= (∆𝑂𝐷+0.055)∗𝑛∗𝑉 0.74∗𝑚 Trong đó: n: độ pha lỗng enzyme (3 lần) V: thể tích mẫu đo OD (1 ml) m: khối lượng mẫu (0,5 ml) 14 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC 6: Đo lượng đường khử sau phân giải rơm theo phương pháp DNS Từ phương trình đường chuẩn glucose ta suy ta hàm lượng đường X (mg/ml) Hàm lượng đường ml mẫu= (𝑂𝐷+0.055)∗𝑛∗𝑉 0.74∗𝑚 Trong đó: n: độ pha lỗng enzyme (9,09lần) V: thể tích mẫu đo OD (1ml) m: khối lượng mẫu (1ml) • Giá trị OD 540nm sau 2, 3, ngày enzyme phân giải rơm qua xử lý Mẫu ngày M15 0,090 0,100 0,116 0,127 0,120 M19 0,080 0,094 0,152 0,168 0,173 M24 0,115 0,120 0,124 0,146 0,140 PHỤ LỤC 7: Khả sử dụng rơm rạ % Rơm thủy phân= 𝑟ơ𝑚 𝑏ị 𝑡ℎủ𝑦 𝑝ℎâ𝑛 𝑟ơ𝑚 𝑏𝑎𝑛 đầ𝑢 ∗ 100 Giấy lọc Rơm lại + Rơm Rơm ban Rơm bị thủy khơ (g) giấy lọc (g) lại (g) đầu (g) phân (g) (1) (2) (3)=(2)-(1) (4) (5)=(4)-(3) M15 0,7823 1,1975 0,4512 0,5000 0,0848 M19 0,7590 1,1546 0,3956 0,5008 0,1052 M24 0,7830 1,1134 0,3304 0,4006 0,0702 Mẫu 15 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC 8: Dựng đường chuẩn Bradford Glucose ➢ Đường chuẩn glucose Nồng độ glucose OD (mg/ml) 0.1 0,020 0.2 0,090 0.3 0,170 0.4 0,240 Đường chuẩn glucose 0.3 y = 0.74x - 0.055 R² = 0.9993 0.25 OD 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0.1 0.2 0.3 Nồng độ glucose 16 0.4 0.5 Đồ án tốt nghiệp ➢ Đường chuẩn albumin Nồng độ protein OD (𝜇g/ml) 10 0,010 20 0,032 30 0,059 40 0,079 50 0,099 Đường Chuẩn Bradford 0.12 y = 0.0023x - 0.0117 R² = 0.9968 0.1 OD 0.08 0.06 0.04 0.02 0 10 20 30 40 Nồng Độ Protein 17 50 60 ... Giới thiệu cộng đồng vi khuẩn cỏ bò .4 1.1.1 Hệ vi sinh vật cỏ bò 1.1.2 .Vi khuẩn phân giải cellulose cỏ bò 1.1.3 Điều kiện vật lý cỏ bò 1.2 Giới thiệu hệ enzym cellulase. .. triển cộng đồng vi sinh cỏ bò có khả sinh hệ enzyme cellulase Thu nhận tối ưu hóa điều kiện mơi trường ảnh hưởng lên hoạt tính enzyme hệ enzyme cellulase có khả phân giải cellulose Thu nhận hệ enzyme. .. 4.Nhiệm vụ nghiên cứu Chọn lọc cộng đồng vi khuẩn sinh hệ enzyme cellulase từ cỏ bò Tối ưu hóa điều kiện phát triển cộng đồng vi khuẩn cỏ bò Chọn lọc hệ enzyme cellulase tiềm Tối ưu hóa nhiệt