Khảo Sát Hệ Enzyme Ngoại Bào Và Khả Năng Ký Sinh Tuyến Trùng Meloidogyne Spp.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HỆ ENZYME NGOẠI BÀO VÀ KHẢ NĂNG KÝ SINH TUYẾN TRÙNG Meloidogyne spp CỦA CÁC CHỦNG NẤM Purpureocillium lilacinum PHÂN LẬP TỪ ĐẤT TRỒNG TIÊU Ở VŨNG TÀU Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : Th.S LÊ THỊ MAI CHÂM Sinh viên thực MSSV: 1151110383 : NGUYỄN THỊ NGỌC TRINH Lớp: 11DSH01 TP Hồ Chí Minh, 2015 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thân, xuất phát từ yêu cầu cơng việc để hình thành hướng nghiên cứu Các số liệu có nguồn gốc rõ ràng, tuân thủ nguyên tắc kết trình bày đồ án thu hoạch trình nghiên cứu trung thực chưa công bố trước Tp.HCM, ngày tháng năm 2015 Sinh viên thực Nguyễn Thị Ngọc Trinh ii LỜI CẢM ƠN Mọi nỗ lực đền đáp thành tốt đẹp trái bàn tay người vun xới Để đạt kết ngày hôm nay, em biết ơn vô xin tỏ lòng biết ơn lời cầu chúc tốt đẹp lời cảm ơn sâu sắc đến: Xin gửi đến BGH Trường Đại học Cơng Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh tồn thể quý thầy cô Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường truyền dạy cho em kiến thức học kinh nghiệm vô quý giá Xin gửi đến Ban Giám Đốc Trung tâm Cơng Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh nói chung anh chị Phòng Cơng nghệ vi sinh nói riêng Đã tạo điều kiện thuận lợi trang thiết bị vật chất quan tâm giúp đỡ, giúp em hoàn thành tốt luận Không thể không nhớ bày tỏ lời cảm ơn chân thành, sâu sắc đến Th.s Lê Thị Mai Châm kỹ sư Nguyễn Thùy Dương, người tận tình hướng dẫn trình tiến hành bước giúp em hoàn thiện thân học kinh nghiệm quan trọng bước đường tương lai Nhờ động viên dìu dắt thạc sĩ tạo động lực cho em suốt trình thực Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, bạn bè ln cổ vũ tạo điều kiện tốt Chính kết trang học quý giá với em suốt quãng đường phía trước Tp.HCM ngày … tháng… năm 2015 Sinh viên thực Nguyễn Thị Ngọc Trinh iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài .2 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược đặc điểm rễ hồ tiêu 1.2 Giới thiệu chung tuyến trùng thực vật Phân loại .4 Hình thức ký sinh thực vật 1.2.1 Tuyến trùng Meloidogyne spp Đặc điểm tuyến trùng Meloidogyne spp Vòng đời tuyến trùng M incognita Cấu tạo thành thể vỏ trứng Meloidogyne spp Đặc điểm gây hại .8 Các biện pháp phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne spp 1.3 Tổng quan nấm Purpureocillium lilacinum 1.3.1 Hệ thống phân loại 1.3.2 Phân bố 10 1.3.3 Đặc điểm hình thái 11 Hình thái đại thể 11 Hình thái vi thể 11 1.3.4 Đặc điểm sinh hóa .12 Sơ lược hệ enzyme ngoại bào 12 Enzyme protease 12 Chitinase 14 1.3.5 Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng P liacinum 15 Nhiệt độ 15 pH 16 iv Nguồn dinh dưỡng 16 1.3.6 Khả kiểm soát ký sinh nấm P lilacinum tuyến trùng 17 Cơ chế trình xâm nhập kí sinh tuyến trùng 18 CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Thời gian địa điểm thực 19 2.2 Đối tượng nghiên cứu 19 2.3 Vật liệu, dụng cụ, hóa chất, thiết bị dùng thí nghiệm 19 Vật liệu .19 Dụng cụ 19 Thiết bị .19 Các môi trường thuốc thử sử dụng 20 2.4 Nội dung nghiên cứu 23 2.5 Phương pháp nghiên cứu 23 2.5.1 Phương pháp định tính hệ enzyme ngoại bào nấm P lilacinum Phương pháp đo vòng phân giải chất môi trường thạch 23 2.5.2 Phương pháp khảo sát khả ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp nấm P lilacinum .24 2.5.3 Bố trí thí nghiệm xử lý số liệu .25 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Kết định tính hệ enzyme ngoại bào chủng nấm P lilacinum 27 3.1.1 Kết định tính hệ enzyme ngoại bào protease chủng nấm P lilacinum .27 3.1.2 Kết định tính hệ enzym ngoại bào chitinase chủng nấm P lilacinum .32 3.2 Kết khảo sát khả ký sinh nấm P lilacinum tuyến trùng Meloidogyne spp .38 3.2.1 Khảo sát, so sánh khả ký sinh nấm P lilacinum Meloidogyne spp .38 v 3.2.2 Khảo sát, so sánh khả ký sinh P lilacinum khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp 41 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .45 4.1 Kết luận 45 4.2 Kiến nghị .45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHỤ LỤC vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT BR – VT : Bà Rịa – Vũng Tàu BVTV : Bảo vệ thực vật IJ2 : Infective Juvenile M : Meloidogyne MT : Môi trường NN-PTNT : Nông nghiệp- phát triển nông thôn PDA : Potato Dextrose Agar P : Purpureocillium TCA : Trichloroacetic WA : Water Agar CTV : cộng tác viên vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Danh sách chủng nấm P lilacinum phân lập từ đất vùng rễ tiêu Vũng Tàu 22 Bảng 3.1 Đường kính vòng phân giải casein chủng nấm P lilacinum phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe mạnh .27 Bảng 3.2 Đường kính vòng phân giải casein chủng nấm P lilacinum phân lập từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh 30 Bảng 3.3 Tỷ lệ phần trăm mức độ tiết enzyme protease theo thời gian chủng P lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất khác 31 Bảng 3.4 Vòng phân giải chitin chủng nấm P lilacinum phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe mạnh .33 Bảng 3.5 Đường kính vòng phân giải chitin chủng nấm P lilacinum phân lập từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh 35 Bảng 3.6 Tỷ lệ phần trăm mức độ tiết enzyme chtinase theo thời gian chủng P lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất khác 37 Bảng 3.7 Tỷ lệ ký sinh nấm P lilacinum Meloidogyne spp theo thời gian .38 Bảng 3.8 Tỷ lệ phần trăm mức độ ký sinh Meloidogyne spp chủng nấm P lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất khác theo thời gian 40 Bảng 3.9 Tỷ lệ ký sinh nấm P lilacinum khối trứng Meloidogyne spp theo thời gian .41 Bảng 3.10 Tỷ lệ phần trăm mức độ ký sinh khối trứng Meloidogyne spp chủng P lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất khác theo thời gian 44 viii DANH MỤC BIỂU ĐỒ, HÌNH ẢNH Biểu đồ 3.1 Đường kính vòng phân giải casein trung bình chủng nấm P lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất trồng tiêu theo thời gian 31 Biểu đồ 3.2 Đường kính vòng phân giải chitin chủng nấm P lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất trồng tiêu theo thời gian .36 Biểu đồ 3.3 Tỷ lệ ký sinh Meloidogyne spp trung bình nấm P lilacinum phân lập từ hai sinh thái đất khác theo thời gian .40 Biểu đồ 3.4 Tỷ lệ ký sinh khối trứng Meloidogyne spp trung bình nấm P lilacinum phân lập từ hai sinh thái đất khác theo thời gian 43 Hình1.1 Khối trứng tuyến trùng Meloidogyne sp .8 Hình 1.2 Khuẩn lạc P lilacinum môi trường PDA sau 15 ngày ni cấy 250C 11 Hình1.3 Cơ quan mang bào tử bào tử nấm 12 Hình 3.1 Đường kính vòng phân giải casein sau 72h chủng nấm phân lập từ vùng rễ tiêu khỏe Nhóm 1(A), nhóm (B), nhóm (C), nhóm (D) 28 Hình 3.2 Đường kính vòng phân giải casein sau 72h chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu bệnh Chủng nấm nhóm (A), nhóm (B) nhóm (C) 30 Hình 3.3 Đường kính vòng phân giải chitin sau 72h chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe Chủng nấm nhóm (A) nhóm (B) 34 Hình 3.4 Đường kính vòng phân giải chitin chủng nấm HT1.1 sau 48h (A) 72h (B) .36 Hình 3.5 Con Meloidogyne spp bị nấm P lilacinum ký sinh chụp kính soi độ phóng đại 4X Con chưa bị ký sinh (A), nấm bắt đầu xâm nhập ký sinh (B) bị nấm ký sinh hoàn toàn (C) 39 Hình 3.6 Khối trứng Meloidogyne spp bị nấm ký sinh Khối trứng bắt đầu bị nấm tiếp xúc (A), sợi nấm bao phủ xung quanh khối trứng sau ngày (B), khối trứng bị nấm ký sinh sau 14 ngày (C) 42 ix Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Theo báo cáo thống kê tháng đầu năm Bộ NN- PTNT Việt Nam năm 2014 sản lượng tiêu xuất đạt 111.000 tăng 36% lượng 48% giá trị Có thể nói, hồ tiêu xem trồng chủ lực đẩy mạnh phát triển kinh tế địa phương, góp phần ổn định đời sống kinh tế đất nước Cây hồ tiêu phát triển với quy mô tốc độ lớn tỉnh miền Trung Khu vực Đông Nam Bộ Đặc biệt Bà Rịa- Vũng Tàu, theo thống kê Sở NNPTNT năm 2013, BR-VT đứng thứ nước diện tích trồng tiêu với tổng diện tích trồng gần 8.000ha đạt sản lượng 12000 tấn, đứng thứ nước (Hiệp hội hồ tiêu Việt Nam) Tuy nhiên, việc sản xuất hồ tiêu năm qua bị tổn thất đáng kể thường bị bệnh với dấu hiệu như: rễ có nhiều nốt sưng, vàng, khô chết dần mà nguyên nhân tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp (Phạm Văn Biên, 1989 Nguyễn Ngọc Châu, 1990) Đây coi nhóm tuyến trùng ký sinh quan trọng nơng nghiệp Nhóm tuyến trùng phân bố rộng khắp ký sinh hầu hết loại trồng vùng khí hậu khác Hiện nay, khoảng 80 loài ký sinh thuộc giống này, có lồi ký sinh gây hại phổ biến là: M incognita, M arenaria, M javanica M hapla (Vũ Triệu Mân, 2007) Biện pháp phòng trừ tuyến trùng chủ yếu sử dụng thuốc hóa học chưa tiêu diệt triệt để Bên cạnh đó, việc sử dụng thuốc đem lại lo ngại: tồn dư thuốc nông sản, làm cân hệ vi sinh vật, ảnh hưởng đến môi trường sinh thái, tượng kháng thuốc gây phát sinh dịch bệnh khác nghiêm trọng hơn…Còn nhiều mối nguy hại khơng thể kể hết Trong đó, việc áp dụng tiến công nghệ sinh học ứng dụng cơng nghệ vi sinh hạn chế, lo ngại tâm lý sử dụng sản phẩm vi sinh lại hoàn toàn lạ mơ hồ với người nơng dân Trong tình hình đó, việc nghiên cứu chọn lọc vi sinh vật địa có khả ký sinh tuyến trùng gây hại vấn đề đáng quan tâm mở cánh cửa Đồ án tốt nghiệp J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J I I I I I I I G G G G G G G L I G L I G L I G L I L I M L I M L I M L I M L I M L I M L I M L I M L I M L M L M L M L M L M L M L M L M L M L M M M H H H H H H H H H H H H H H H H K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K 6.967 A6B3 6.927 A11B1 6.910 A1B1 6.713 A9B1 6.680 A7B1 6.637 A1B2 6.583 A2B3 6.520 A8B3 6.470 A12B2 6.447 A12B1 6.343 A13B1 6.197 A5B1 5.860 A9B3 5.553 A10B1 4.760 4.547 A4B3 A9B2 Kết phân tích ANOVA phần mềm SAS 9.0 khả tiết enzyme protease chủng phân lập từ đất vùng rễ tiêu bệnh R-Square Coeff Var Root MSE 0.721773 14.93281 1.139840 Source DF A B A*B Type III SS Y Mean 7.633125 Mean Square F Value Pr > F 15 170.2772937 11.3518196 8.74