Khảo sát hệ enzyme ngoại bào và khả năng ký sinh tuyến trùng meloidogyne spp của các chủng nấm purpureocillium lilacinum phân lập từ đất trồng tiêu ở vũng tàu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HỆ ENZYME NGOẠI BÀO VÀ KHẢ NĂNG KÝ SINH TUYẾN TRÙNG Meloidogyne spp CỦA CÁC CHỦNG NẤM Purpureocillium lilacinum PHÂN LẬP TỪ ĐẤT TRỒNG TIÊU Ở VŨNG TÀU Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : Th.S LÊ THỊ MAI CHÂM Sinh viên thực MSSV: 1151110383 : NGUYỄN THỊ NGỌC TRINH Lớp: 11DSH01 TP Hồ Chí Minh, 2015 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thân, xuất phát từ yêu cầu cơng việc để hình thành hướng nghiên cứu Các số liệu có nguồn gốc rõ ràng, tuân thủ nguyên tắc kết trình bày đồ án thu hoạch trình nghiên cứu trung thực chưa công bố trước Tp.HCM, ngày tháng năm 2015 Sinh viên thực Nguyễn Thị Ngọc Trinh ii LỜI CẢM ƠN Mọi nỗ lực đền đáp thành tốt đẹp trái bàn tay người vun xới Để đạt kết ngày hôm nay, em biết ơn vô xin tỏ lòng biết ơn lời cầu chúc tốt đẹp lời cảm ơn sâu sắc đến: Xin gửi đến BGH Trường Đại học Cơng Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh tồn thể quý thầy cô Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường truyền dạy cho em kiến thức học kinh nghiệm vô quý giá Xin gửi đến Ban Giám Đốc Trung tâm Cơng Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh nói chung anh chị Phòng Cơng nghệ vi sinh nói riêng Đã tạo điều kiện thuận lợi trang thiết bị vật chất quan tâm giúp đỡ, giúp em hoàn thành tốt luận Không thể không nhớ bày tỏ lời cảm ơn chân thành, sâu sắc đến Th.s Lê Thị Mai Châm kỹ sư Nguyễn Thùy Dương, người tận tình hướng dẫn trình tiến hành bước giúp em hoàn thiện thân học kinh nghiệm quan trọng bước đường tương lai Nhờ động viên dìu dắt thạc sĩ tạo động lực cho em suốt trình thực Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, bạn bè ln cổ vũ tạo điều kiện tốt Chính kết trang học quý giá với em suốt quãng đường phía trước Tp.HCM ngày … tháng… năm 2015 Sinh viên thực Nguyễn Thị Ngọc Trinh MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài .2 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược đặc điểm rễ hồ tiêu 1.2 Giới thiệu chung tuyến trùng thực vật Phân loại .4 Hình thức ký sinh thực vật 1.2.1 Tuyến trùng Meloidogyne spp Đặc điểm tuyến trùng Meloidogyne spp Vòng đời tuyến trùng M incognita Cấu tạo thành thể vỏ trứng Meloidogyne spp Đặc điểm gây hại .8 Các biện pháp phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne spp 1.3 Tổng quan nấm Purpureocillium lilacinum 1.3.1 Hệ thống phân loại 1.3.2 Phân bố 10 1.3.3 Đặc điểm hình thái 11 Hình thái đại thể 11 Hình thái vi thể 11 1.3.4 Đặc điểm sinh hóa .12 Sơ lược hệ enzyme ngoại bào 12 Enzyme protease 12 Chitinase 14 1.3.5 Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng P liacinum 15 Nhiệt độ 15 pH 16 Nguồn dinh dưỡng 16 1.3.6 Khả kiểm soát ký sinh nấm P lilacinum tuyến trùng 17 Cơ chế trình xâm nhập kí sinh tuyến trùng 18 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Thời gian địa điểm thực 19 2.2 Đối tượng nghiên cứu 19 2.3 Vật liệu, dụng cụ, hóa chất, thiết bị dùng thí nghiệm 19 Vật liệu .19 Dụng cụ 19 Thiết bị .19 Các môi trường thuốc thử sử dụng 20 2.4 Nội dung nghiên cứu 23 2.5 Phương pháp nghiên cứu 23 2.5.1 Phương pháp định tính hệ enzyme ngoại bào nấm P lilacinum Phương pháp đo vòng phân giải chất môi trường thạch 23 2.5.2 Phương pháp khảo sát khả ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp nấm P lilacinum .24 2.5.3 Bố trí thí nghiệm xử lý số liệu .25 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Kết định tính hệ enzyme ngoại bào chủng nấm P lilacinum 27 3.1.1 Kết định tính hệ enzyme ngoại bào protease chủng nấm P lilacinum .27 3.1.2 Kết định tính hệ enzym ngoại bào chitinase chủng nấm P lilacinum .32 3.2 Kết khảo sát khả ký sinh nấm P lilacinum tuyến trùng Meloidogyne spp .38 3.2.1 Khảo sát, so sánh khả ký sinh nấm P lilacinum Meloidogyne spp .38 3.2.2 Khảo sát, so sánh khả ký sinh P lilacinum khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp 41 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .45 4.1 Kết luận 45 4.2 Kiến nghị .45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT BR – VT : Bà Rịa – Vũng Tàu BVTV : Bảo vệ thực vật IJ2 : Infective Juvenile M : Meloidogyne MT : Môi trường NN-PTNT : Nông nghiệp- phát triển nông thôn PDA : Potato Dextrose Agar P : Purpureocillium TCA : Trichloroacetic WA : Water Agar CTV : cộng tác viên vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Danh sách chủng nấm P lilacinum phân lập từ đất vùng rễ tiêu Vũng Tàu 22 Bảng 3.1 Đường kính vòng phân giải casein chủng nấm P lilacinum phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe mạnh .27 Bảng 3.2 Đường kính vòng phân giải casein chủng nấm P lilacinum phân lập từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh 30 Bảng 3.3 Tỷ lệ phần trăm mức độ tiết enzyme protease theo thời gian chủng P lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất khác 31 Bảng 3.4 Vòng phân giải chitin chủng nấm P lilacinum phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe mạnh .33 Bảng 3.5 Đường kính vòng phân giải chitin chủng nấm P lilacinum phân lập từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh 35 Bảng 3.6 Tỷ lệ phần trăm mức độ tiết enzyme chtinase theo thời gian chủng P lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất khác 37 Bảng 3.7 Tỷ lệ ký sinh nấm P lilacinum Meloidogyne spp theo thời gian 38 Bảng 3.8 Tỷ lệ phần trăm mức độ ký sinh Meloidogyne spp chủng nấm P lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất khác theo thời gian 40 Bảng 3.9 Tỷ lệ ký sinh nấm P lilacinum khối trứng Meloidogyne spp theo thời gian 41 Bảng 3.10 Tỷ lệ phần trăm mức độ ký sinh khối trứng Meloidogyne spp chủng P lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất khác theo thời gian 44 DANH MỤC BIỂU ĐỒ, HÌNH ẢNH Biểu đồ 3.1 Đường kính vòng phân giải casein trung bình chủng nấm P lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất trồng tiêu theo thời gian 31 Biểu đồ 3.2 Đường kính vòng phân giải chitin chủng nấm P lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất trồng tiêu theo thời gian .36 Biểu đồ 3.3 Tỷ lệ ký sinh Meloidogyne spp trung bình nấm P lilacinum phân lập từ hai sinh thái đất khác theo thời gian .40 Biểu đồ 3.4 Tỷ lệ ký sinh khối trứng Meloidogyne spp trung bình nấm P lilacinum phân lập từ hai sinh thái đất khác theo thời gian 43 Hình1.1 Khối trứng tuyến trùng Meloidogyne sp .8 Hình 1.2 Khuẩn lạc P lilacinum môi trường PDA sau 15 ngày ni cấy 25 C 11 Hình1.3 Cơ quan mang 12 bào tử bào tử nấm Hình 3.1 Đường kính vòng phân giải casein sau 72h chủng nấm phân lập từ vùng rễ tiêu khỏe Nhóm 1(A), nhóm (B), nhóm (C), nhóm (D) 28 Hình 3.2 Đường kính vòng phân giải casein sau 72h chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu bệnh Chủng nấm nhóm (A), nhóm (B) nhóm (C) 30 Hình 3.3 Đường kính vòng phân giải chitin sau 72h chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe Chủng nấm nhóm (A) nhóm (B) 34 Hình 3.4 Đường kính vòng phân giải chitin chủng nấm HT1.1 sau 48h (A) 72h (B) .36 Hình 3.5 Con Meloidogyne spp bị nấm P lilacinum ký sinh chụp kính soi độ phóng đại 4X Con chưa bị ký sinh (A), nấm bắt đầu xâm nhập ký sinh (B) bị nấm ký sinh hoàn toàn (C) 39 Hình 3.6 Khối trứng Meloidogyne spp bị nấm ký sinh Khối trứng bắt đầu bị nấm tiếp xúc (A), sợi nấm bao phủ xung quanh khối trứng sau ngày (B), khối trứng bị nấm ký sinh sau 14 42 ngày (C) Đồ án tốt nghiệp E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E O E O O O O O O O O P O P O P O P O P O P O P O P O P O P O P O P O P O P O P O P O P O P O P O P O P O P O P O P O P O P O O O O P P P P B B B B B B B B B B B A C 9.3433 A6B2 A C A C F 9.1467 A16B2 A C F A G C F 8.9300 A3B3 A G C F H A G C F 8.7700 A5B3 H G C F H I G C F 8.6333 A15B3 H I G C F J H I G C F 8.5533 A14B1 J H I G C F K J H I G C F 8.3733 A12B1 K J H I G F K J H I G L F 8.2133 A4B3 K J H I G L F K J H I G L F 8.1733 A1B3 K J H I G L F K J H I G L F 8.0933 A7B2 K J H I G L F K J M H I G L F 8.0000 A5B1 K J M H I G L F K J M H I G L F 7.9933 A9B1 K J M H I G L F K J M H I G L F 7.9167 A1B2 K J M H I G L F N K J M H I G L F 7.8300 A8B3 N K J M H I G L F N K J M H I G L F 7.8067 A15B2 N K J M H I G L F N K J M H I G L F 7.7667 A16B1 N K J M H I G L F N K J M H I G L F 7.6867 A10B1 N K J M H I G L F N K J M H I G L F 7.3500 A9B3 N K J M H I G L F N K J M H I G L F 7.3333 A10B3 N K J M H I G L N K J M H I G L 7.2467 A5B2 N K J M H I G L N K J M H I G L 7.2233 A12B2 N K J M H I L N K J M H I L Q 6.9533 A6B1 N K J M H I L Q N K J M H I L Q 6.9500 A14B3 N K J M H I L Q N K J M H I L Q 6.9433 A13B1 N K J M H I L Q N K J M H I L Q 6.9400 A1B1 N K J M I L Q N K J M I L Q 6.8833 A4B1 N K J M I L Q N K J M I R L Q 6.8467 A13B3 N K J M I R L Q N K J M I R L Q 6.7900 A11B3 N K J M R L Q N K J M R L Q 6.7533 A3B2 N K J M R L Q N K J M R L Q 6.7300 A8B1 N K M R L Q N K M R L Q 6.6800 A2B3 N K M R L Q N K M R L Q 6.6433 A3B1 N M R L Q R L Q 6.4433 A15B1 N M N M R Q N N N D D D D D D D D D D D D D D D D D M R R S R S R Q Q Q Q 6.2267 6.0667 3 A6B3 A11B2 O P P P S R S R S R S R S R S R S R S R S R S S Q Q Q Q Q Q Q 5.8933 A4B2 5.3967 A2B2 5.3700 A11B1 5.1300 A8B2 5.0167 4.3233 3 A2B1 A13B2 Phụ lục 1.2 Khả tiết enzyme ngoại bào chitinase Bảng số liệu đường kính vòng phân giải chất casein 29 chủng khảo sát STT Đường kính vòng phân giải chitin D-d 24h 48h LL1 LL2 LL3 LL1 LL2 LL3 2.49 2.44 2.68 5.55 5.09 2.18 2.9 2.26 4.71 4.73 1.7 1.6 1.74 3.75 3.96 3.76 4.4 2.62 6.47 5.58 2.34 2.58 2.75 4.11 5.31 2.03 2.46 2.49 3.15 4.92 2.75 2.26 2.57 4.02 4.85 2.98 4.63 4.02 7.19 6.23 1.49 2.37 5.63 5.66 2.75 2.3 2.75 7.69 5.98 2.57 2.5 2.96 5.94 4.2 3.12 3.41 3.47 8.03 6.82 3.32 2.84 2.69 7.49 5.98 2.02 2.74 4.25 4.86 4.76 3.05 3.23 4.6 5.82 5.48 2.78 3.12 2.63 6.27 7.52 3.42 4.35 3.9 5.39 5.43 3.17 3.55 3.39 8.23 7.22 3.51 3.19 3.01 4.61 4.82 2.98 2.76 2.34 5.46 4.56 3.11 3.05 3.18 7.52 6.3 2.62 3.95 2.95 7.17 5.87 3.1 3.39 3.3 5.98 6.41 6.22 6.25 6.43 6.86 6.94 2.09 1.93 2.3 5.52 4.99 4.17 3.82 3.79 5.1 6.31 2.85 3.34 2.89 7.51 7.05 2.06 2.02 2.89 3.82 4.64 1.81 2.46 2.52 5.04 5.27 Chủng KL 1.2 KL 1.3 KL 1.4 KL 3.1 KL 4.1 KL 5.1 KL 5.2 KL 5.3 KL 6.1 10 KL 6.2 11 KL 8.2 12 HT 1.1 13 HT 1.2 14 HT 1.3 15 HT 2.1 16 HT 2.2 17 HT 2.3 18 HT 3.1 19 HT 3.2 20 HT 3.3 21 HT 4.1 22 HT 4.2 23 HT 4.3 24 HT 5.1 25 HT 5.2 26 HT 6.1 27 HT 6.3 28 HT 7.2 29 HT 7.3 LL1 5.24 6.64 3.73 6.24 4.37 2.3 5.58 7.3 5.04 5.4 4.91 9.79 7.18 4.51 7.21 7.14 5.17 6.1 5.64 6.71 5.91 6.2 6.52 7.01 5.93 3.92 7.57 5.1 4.81 72h LL2 LL3 1.94 1.84 0.14 0.73 0.97 1.11 0.84 1.07 2.65 3.78 3.36 1.94 0.32 0.22 4.43 3.67 1.13 0.51 1.87 1.35 1.89 2.48 2.13 2.43 3.19 1.8 2.41 3.47 3.32 5.21 6.72 2.42 4.16 2.29 0.87 1.74 0.66 1.27 0.96 1.96 1.82 3.21 2.12 2.83 2.03 8.82 8.54 1.02 1.31 1.09 2.81 2.16 3.12 5.15 4.92 1.95 2.7 Kết phân tích ANOVA phần mềm SAS 9.0 khả tiết enzyme chitiase chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe Source A B A*B R-Square Coeff Var Root MSE 0.956405 13.23689 0.546785 DF Type III SS Y Mean 4.130769 Mean Square F Value Pr > F 12 184.2286085 15.3523840 51.35