Khảo sát và so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào và ký sinh tuyến trùng của một số chủng nấm purpureocillium lilacium phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở vũng tàu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT VÀ SO SÁNH KHẢ NĂNG TIẾT ENZYME NGOẠI BÀO VÀ KÝ SINH TUYẾN TRÙNG CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM Purpureocillium lilacinum PHÂN LẬP TỪ ĐẤT RỪNG VÀ ĐẤT CANH TÁC Ở VŨNG TÀU Ngành: Công nghệ sinh học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn : ThS Lê Thị Mai Châm Sinh viên thực MSSV: 1151110125 : Trần Thị Ngọc Hạnh Lớp: 11DSH01 TP Hồ Chí Minh, 2015 Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học thành phố HCM nói chung anh chị cơng tác phòng Vi sinh nói riêng, tạo điều kiện cho em tham gia làm đồ án tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Lê Thị Mai Châm, chị Nguyễn Thị Thùy Dương trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm trình làm đồ án tốt nghiệp em Trung tâm Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu Trường Đại Học Công Nghệ Tp.HCM quý thầy cô tận tình giảng dạy cung cấp kiến thức cần thiết, bổ ích để chúng em hồn thành tốt trình học tập Cuối em xin cảm ơn đến gia đình, bạn bè đồng hành ủng hộ em suốt trình Đồ án tốt nghiệp XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN TP.HCM, ngày 20 tháng năm 2015 S i n h v i ê n t h ự c h i ệ n T r ầ n T h ị N g ọ c H n h Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu cá nhân Các kết số liệu đồ án trung thực Người cam đoan Trần Thị Ngọc Hạnh Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tuyến trùng Meloidogyne spp 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Vòng đời 1.1.3 Cấu tạo trứng tuyến trùng .4 1.1.4 Cấu tạo thành thể tuyến trùng .5 1.2 Nấm Purpureocillium lilacinum 1.2.1 Phân loại 1.2.2 Điều kiện sống .6 1.2.3 Đặc điểm hình thái 1.2.4 Đặc điểm dinh dưỡng 1.2.5 Khả tiết enzyme ngoại bào 1.2.6 Độc tố P lilacinum .10 1.2.7 Quá trình kí sinh 11 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 12 2.2 Thiết bị, hóa chất, vật liệu nghiên cứu 12 2.2.1 Dụng cụ, thiết bị 12 2.2.2 Vật liệu, đối tượng nghiên cứu 12 2.2.3 Hóa chất 14 2.3 Nội dung nghiên cứu 16 2.4 Phương pháp nghiên cứu 16 2.4.1 Phương pháp định tính hệ enzyme ngoại bào protease, chitinase nấm P lilacinum 16 2.3.2 Phương pháp khảo sát khả xâm nhập trứng tuyến trùng Meloidogyne spp nấm P lilacinum 18 2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 19 i Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 3.1 Kết định tính hệ enzyme ngoại bào chủng nấm P lilacinum 20 3.1.1 Kết định tính hệ enzyme ngoại bào protease 20 3.1.2 Kết định tính hệ enzyme ngoại bào chitinase chủng nấm P lilacinum .26 3.2 Kết khảo sát khả ký sinh khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp chủng nấm P lilacinum .30 3.2.1 Kết khảo sát khả ký sinh trứng tuyến trùng Meloidogyne spp chủng nấm P lilacinum 31 3.2.2 Kết khảo sát khả ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp 36 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .39 4.1 Kết luận 39 4.2 Đề nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 ii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các chủng nấm P lilacinum phân lập từ đất rừng đất canh tác Vũng 12 Tàu Bảng 3.1 Vòng phân giải casein chủng nấm phân lập từ đất rừng Vũng Tàu khoảng 20 thời gian khác Bảng 3.2 Vòng phân giải casein chủng nấm phân lập từ đất canh tác Vũng Tàu khoảng 22 thời gian khác Bảng 3.3 Mức độ tiết enzyme protease chủng P lilacinum phân lập từ đất rừng đất canh tác đất Vũng Tàu mốc thời gian khác 25 Bảng 3.4 Vòng phân giải chitin chủng nấm phân lập từ đất rừng Vũng Tàu theo khoảng 26 thời gian khác Bảng 3.5 Vòng phân giải chitin chủng nấm phân lập từ đất canh tác Vũng Tàu theo khoảng 27 thời gian khác Bảng 3.6 Mức độ tiết enzyme chitinase chủng P lilacinum phân lập từ đất rừng đất canh tác đất Vũng Tàu mốc thời gian khác 30 Bảng 3.7 Tỷ lệ ký sinh khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp chủng nấm P lilacinum phân lập từ đất rừng đất canh tác Vũng Tàu .32 Bảng 3.8 Mức độ ký sinh khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp chủng P lilacinum phân lập từ đất rừng đất canh tác đất Vũng Tàu mốc thời gian khác 35 Bảng 3.9 Tỷ lệ ký sinh Meloidogyne spp chủng nấm P lilacinum phân lập từ đất rừng đất canh tác Vũng Tàu .36 Bảng 3.10 Mức độ ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp chủng P lilacinum phân lập từ đất rừng đất canh tác đất Vũng Tàu mốc thời gian khác 38 Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Vòng phân giải casein trung bình chủng nấm P lilacinum phân lập từ đất rừng đất canh tác Vũng Tàu theo thời gian 24 Biểu đồ 3.2 Vòng phân giải chitin trung bình chủng nấm P lilacinum phân lập từ đất rừng đất canh tác Vũng Tàu theo thời gian 29 Biểu đồ 3.3 Tỷ lệ ký sinh khối trứng trung bình chủng nấm P lilacinum phân lập đất rừng đất canh tác khoảng thời gian khác 34 Biểu đồ 3.4 Tỷ lệ ký sinh Meloidogyne spp trung bình chủng nấm P lilacinum phân lập từ đất rừng đất canh tác khoảng thời gian khác .37 Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Vòng đời tuyến trùng ký sinh thực vật Hình 1.2 Hình thái tuyến trùng Meloidogyne sp Hình 1.3 Hình thái khuẩn lạc P lilacinum sau 15 ngày nuôi cấy môi trường PDA Hình 1.4 Hình thái quan mang bào tử bào tử nấm P lilacinum Hình 1.3 Cấu tạo hóa học độc tố paecilotoxin 11 Hình 3.1 Vòng phân giải casein chủng PB 2.10 khoảng thời gian 24 giờ; 48 72 21 Hình 3.2 Vòng phân giải casein chủng PB 1.1, PB 1.10, PB 3.1 48 21 Hình 3.3 Vòng phân giải casein chủng KL 5.3 KL 6.2 KL 5.2 72 24 Hình 3.4 Vòng phân giải casein chủng P lilacinum phân lập từ đất rừng đất canh tác sau 24 , 48 giờ, 72 25 Hình 3.5 Vòng phân giải chitin chủng PB 3.3 sau 24 , 48 , 72 27 Hình 3.6 Vòng phân giải chitin chủng HT 5.1 sau 24 , 48 giờ, 72 .29 Hình 3.7 Quá trình khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp bị nấm P lilacinum ký sinh hình dạng khối trứng ban đầu, nấm tiếp xúc khối trứng, khối trứng bị kí sinh .33 Hình 3.8 Quá trình tuyến trùng Meloidogyne spp bị nấm P lilacinum ký sinh hình dạng ban đầu, nấm bắt đầu ký sinh, bị kí sinh 37 Đồ án tốt nghiệp TÓM TẮT Khảo sát khả tiết enzyme ngoại bào 38 chủng nấm Purpureocillium lilacinum phương pháp đo vòng phân giải chất môi trường thạch Sau thử nghiệm, chọn lọc chủng nấm tiêu biểu có khả tiết enzyme ngoại bào protease chitinase mạnh để thử nghiệm khả ký sinh khối trứng Meloidogyne spp trực tiếp đĩa Petri Kết quả, tất chủng nấm Purpureocillium lilacinum có khả tiết enzyme ngoại bào khả tiết enzyme protease mạnh so với chitinase Đối với enzyme chitinase, đường kính vòng phân giải chất tối ưu đạt sau 48 Các chủng có khả phân hủy chitin mạnh PB 3.3, HT 5.1, KL 6.2 KL 5.3 Đối với enzyme protease chủng nấm khảo sát có khả tiết mạnh sau 72 Các chủng có khả phân hủy casein mạnh PB 2.10, PB 1.3, KL 5.3 KL 6.2 Khơng có khác biệt mặt thống kê khả tiết enzyme ngoại bào chủng nấm phân lập từ đất rừng đất canh tác Kết thử nghiệm ký sinh tuyến trùng cho thấy, tất chủng nấm khảo sát PB 1.1, PB 1.3, PB 1.10, PB 2.10, PB 3.3 ký sinh Meloidogyne spp nhanh mạnh so với khối trứng D 3.957 Ngày 10 Class Level Information Class Levels T 27 Number of Observations Used 27 0.601380 DF 61.63771251 123456789 Number of Observations Read R-Square Source Values Coeff Var Root MSE N Mean 22.93560 1.506581 6.568742 Anova SS Mean Square 7.70471406 3.39 F Value Pr > F T 0.0149 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 18 2.269785 Critical Value of t 2.10092 Least Significant Difference 2.5844 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N T A 8.594 A 8.488 A 8.488 A A A B B A 6.674 3 A 6.017 5.786 A B B B B B 5.563 B 5.279 B B B 4.229 Ngày 11 Class Level Information Class Levels T 27 Number of Observations Used 27 0.598860 DF Anova SS 56.65271159 123456789 Number of Observations Read R-Square Source Values Coeff Var Root MSE N Mean 21.12193 1.451977 6.874265 Mean Square 7.08158895 3.36 F Value Pr > F T 0.0156 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 18 2.108238 Critical Value of t 2.10092 Least Significant Difference 2.4907 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N T A 8.768 A 8.755 8.724 C 6.968 3 C 6.240 A A B B A A B B A C B C C C 6.190 C 5.957 5.662 4.605 C C C C Ngày 12 Class Level Information Source DF 53.97176831 Class Levels T Values 123456789 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.590240 20.43370 1.442771 7.060741 Anova SS Mean Square 6.74647104 3.24 F Value Pr > F T 0.0182 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 18 2.081588 Critical Value of t 2.10092 Least Significant Difference 2.4749 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N T A 8.910 A 8.880 A 8.866 A A A B B 3 A 6.563 A 6.468 A B B 7.068 A B B A B 6.150 5.830 4.812 B B B B Ngày 13 Class Level Information Class Levels T Source DF 52.68881498 Values 123456789 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.578880 20.27613 1.459256 7.196917 Anova SS Mean Square 6.58610187 3.09 F Value Pr > F T 0.0222 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 18 2.129428 Critical Value of t 2.10092 Least Significant Difference 2.5032 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N T A 9.059 A 8.978 A 8.922 A A A B B 3 A 6.835 A 6.655 A B B 7.147 A B B A B 6.285 B 5.968 B B B 4.922 Ngày 14 Class Level Information Class Levels T Values 123456789 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.575967 19.56663 1.429798 7.307326 Source DF Anova SS 49.98272883 Mean Square 6.24784110 3.06 Alpha F Value 0.0233 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 18 2.044321 Critical Value of t 2.10092 Least Significant Difference 2.4527 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N T A 9.150 A 9.008 A 8.978 A 7.264 3 A 6.962 A 6.780 A A A B B A B B A B B Pr > F T B 6.442 6.113 5.070 B B B B Phụ lục B.2: Khả ký sinh chủng nấm P lilacinum Bảng số liệu thô tỷ lệ ký sinh(%) TỶ LỆ KÝ SINH TRÊN CON CÁI (%) Chủng Ngày Ngày Ngày 75 88 90 PB 1.1 72 81 85 PB 1.3 79 86 89 PB 1.10 76 84 87 PB 2.10 75 83 88 PB 3.3 77 82 86 KL 5.3 86 91 95 KL 6.2 87 95 98 HT 3.3 82 89 90 HT 5.1 STT T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 Kết xử lý thống kê tỷ lệ ký sinh theo ngày T: Tên chủng Ngày Class Level Information Class Levels T T Number of Observations Used 27 Anova SS 697.3333333 123456789 27 0.570649 DF Number of Observations Read R-Square Source Values Coeff Var Root MSE 11.09364 Mean Square N Mean 5.398902 F Value 87.1666667 2.99 Pr > F 0.0255 Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square 48.66667 0.05 18 29.14815 Ngày 91 87 91 90 90 89 97 100 91 Critical Value of t 2.10092 Least Significant Difference 9.2613 Means with the same letter are not significantly different t Grouping A Mean N 54.333 53.000 A A A B A B A B A B A B A B A B A B A B A C B C B C 52.333 51.333 50.667 3 49.333 46.000 43.333 C 3 T C 37.667 Ngày Class Level Information Class Levels T 123456789 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 R-Square 0.551855 Source Values Coeff Var Root MSE N Mean 5.294351 4.176655 78.88889 DF 386.6666667 Anova SS Mean Square 48.3333333 Alpha 0.0346 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 2.77 F Value 18 17.44444 Pr > F T Critical Value of t 2.10092 Least Significant Difference 7.1646 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean A N 83.000 T A B A B A B A B A B A B A B A C B A C B D A B D C B D C D 82.000 82.000 81.333 C 76.667 75.667 D D 82.333 3 3 C C 74.333 D 72.667 Ngày Class Level Information Source DF 262.5185185 Class Levels T Values 123456789 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.410708 5.273746 4.574486 86.74074 Anova SS Mean Square 32.8148148 1.57 F Value Pr > F T 0.2033 Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.05 18 20.92593 Critical Value of t 2.10092 Least Significant Difference 7.8471 Means with the same letter are not significantly different t Grouping A Mean N T 90.667 A B A 89.667 B A B A C B A C B A C B A C B A C B A C B A C B A C B A C B C B C 88.333 88.333 3 88.000 87.667 84.667 82.000 C 3 C 81.333 Ngày Class Level Information Class Levels T 27 Number of Observations Used 27 0.367475 DF 199.8518519 123456789 Number of Observations Read R-Square Source Values Anova SS Coeff Var Root MSE N Mean 4.853367 4.371626 90.07407 Mean Square 24.9814815 1.31 F Value 0.3010 Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square Pr > F T 0.05 18 19.11111 Critical Value of t 2.10092 Least Significant Difference 7.4991 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean A N 93.333 T A B B 92.000 A 91.333 A 91.000 A 91.000 3 A 87.667 A 86.333 85.333 A B B A A B B A B B A B B 92.667 A B B A A B B B ... sánh khả tiết enzyme ngoại bào ký sinh tuyến trùng số chủng nấm Purpureocillium lilacium phân lập từ đất rừng đất canh tác Vũng Tàu Mục tiêu nghiên cứu: So sánh khả tiết enzyme ngoại bào, xâm nhập... cứu - Khảo sát so sánh khả tiết enzyme ngoại bào protease chitinase chủng nấm P lilacinum phân lập từ đất rừng đất canh tác Vũng Tàu - So sánh khả xâm nhập khối trứng Meloidogyne spp chủng nấm. .. thống kê khả tiết enzyme ngoại bào chủng nấm phân lập từ đất rừng đất canh tác Kết thử nghiệm ký sinh tuyến trùng cho thấy, tất chủng nấm khảo sát PB 1.1, PB 1.3, PB 1.10, PB 2.10, PB 3.3 ký sinh