Tuyển Chọn Và Khảo Sát Điều Kiện Nuôi Cấy Dõng Vi Khuẩn Hiếu Khí Có Khả Năng Thủy Phân Bã Mía

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC TIÊN TIẾN TUYỂN CHỌN VÀ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NI CẤY DÕNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ CĨ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN BÃ MÍA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ThS VÕ VĂN SONG TOÀN ThS DƢƠNG THỊ HƢƠNG GIANG Cần Thơ, Tháng 11/2010 SINH VIÊN THỰC HIỆN Nguyễn Thị Thanh Trúc MSSV: 3064492 LỚP: DA0666T1 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN ThS Võ Văn Song Toàn SINH VIÊN THỰC HIỆN Nguyễn Thị Thanh Trúc CÁN BỘ HƢỚNG DẪN ThS Dƣơng Thị Hƣơng Giang DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ……………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2010 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CẢM TẠ Để đề tài luận văn tốt nghiệp hoàn thành thật tốt, em xin chân thành gửi lời tri ân đến: Ths Võ Văn Song Toàn Ths Dương Thị Hương Giang BGĐ Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức dạy em suốt thời gian học tập thực luận văn tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn q thầy tận tình giảng dạy cung cấp kiến thức quý báu động viên, giúp đỡ em suốt trình học tập Em xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Thị Xuân Dung, cán Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ tận tình hỗ trợ, đóng góp ý kiến quý báu suốt trình làm luận văn Các anh chị cán phòng Vi sinh vật, phòng Sinh học phân tử, phòng thực phẩm tạo điều kiện cho em thực tốt luận văn Chân thành cảm ơn gia đình nơi cưu mang hỗ trợ em nhiều suốt thời gian dài làm luận văn Cám ơn bạn bè hỗ trợ, động viên cho em hoàn thành nhiệm vụ thời gian học tập thời gian thực đề tài Cuối cùng, em xin kính chúc q thầy dồi sức khỏe, thành công lãnh vực TÓM LƢỢC Đề tài “Tuyển chọn khảo sát điều kiện ni cấy dịng vi khuẩn hiếu khí có khả thuỷ phân bã mía” tiến hành xác định dịng vi khuẩn có khả thuỷ phân bã mía cho hoạt độ thuỷ phân cao nhất, từ tiến hành tối ưu hố điều kiện mơi trường ảnh hửơng lên khả sinh tổng hợp cellulase vi khuẩn Kết cho thấy 12 dòng vi khuẩn hiếu khí phân lập từ bã mía, có dịng vi khuẩn 22 có khả thuỷ phân bã mía cho hoạt độ thuỷ phân cao Kết khảo sát cho thấy rằng, dòng vi khuẩn sinh tổng hợp cellulase tốt điều kiện pH 5,0 7,0 nhiệt độ 350C 300C cho dòng vi khuẩn 22 Dòng vi khuẩn cho hoạt tính endoglucanase exogucanase tối ưu (0,0076 U/ml 0,0049 U/ml) sau 96 ủ lắc (120 vòng/phút), hoạt tính endoglucanse exoglucanase dịng vi khẩn 22 đạt cực đại sau 48 ủ lắc (120 vịng /phút) với hoạt tính thu 0,0268 U/ml 0,0235 U/ml Hàm lượng protein thu tương thích với thời gian tối ưu Mơi trường có bổ sung beef extract 0,2% (w/v) 0,5% (w/v) xem hiệu cho sinh tổng hợp cellulase dịng vi khuẩn 22 Từ khố: bã mía, cellulase, beef extract, endoglucanase, exoglucanase, i MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT LỜI CẢM TẠ TÓM LƢỢC i MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG v DANH SÁCH HÌNH vi CHƢƠNG I GIỚI THIỆU CHƢƠNG II LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan bã mía thành phần bã mía .3 2.1.1 Bã mía .3 2.1.2 Các thành phần bã mía 2.1.2.1 Cellulose 2.1.2.2 Hemicellulose 2.1.2.3 Lignin 2.2 Cellulase chế thuỷ phân cellulose 2.2.1 Cơ chế thuỷ phân cellulose 2.2.2 Cellulase 2.2.2.1 Sơ lược vi sinh vật phân huỷ cellulose .8 2.2.2.2 Một số ứng dụng cellulase 10 2.3 Ảnh hƣởng điều kiện môi trƣờng lên khả sinh tổng hợp cellulase12 2.3.1 Nguồn carbon 13 2.3.2 Nguồn nitrogen .13 2.3.3 Nhiệt độ nuôi cấy 14 2.3.4 pH môi trường 14 2.4 Sơ lƣợc số phƣơng pháp nghiên cứu 15 2.4.1 Các phương pháp vi sinh 15 ii 2.4.1.1 Phương pháp pha loãng vi sinh vật .15 2.4.1.2 Phương pháp đếm mật số VSV phương pháp đếm sống 15 2.4.1.3 Phương pháp đo đường kính thuỷ phân 15 2.4.2 Các phương pháp sinh hóa phân tích .15 2.4.2.1 Phương pháp định lượng cellulose 15 2.4.2.2 Phương pháp đinh lượng protein phương pháp Bradford (1976) 16 2.4.2.3 Xác định hoạt tính enzyme phương pháp Nelson-Somogyi (1944) 16 2.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƢỚC 16 CHƢƠNG III PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .19 3.1 PHƢƠNG TIỆN 19 3.1.1 Thời gian địa điểm .19 3.1.2 Nguyên liệu 19 3.1.3 Thiết bị hóa chất 19 3.1.3.1 Thiết bi 19 3.1.3.2 Hoá chất .20 3.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1 Mục đích thí nghiệm .20 3.2.2 Nguyên vật liệu 20 3.2.2.1 Nguồn vi khuẩn 20 3.2.2.2 Bã mía 20 3.2.2.3 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn .20 3.2.3 Phương pháp thí nghiệm 21 3.2.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát thành phần cellulose bã mía 21 3.2.3.2 Thí nghiệm 2: Phân lập tuyển chọn số dòng vi khuẩn hiếu có khả sinh tổng hợp cellulase cao 22 3.2.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng tương tác nhiệt độ pH đến sinh tổng hợp cellulase vi khuẩn 23 iii 3.2.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến q trình thủy phân bã mía dịng vi khuẩn hiếu khí 24 3.2.3.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitơ lên q trình thuỷ phân bã mía vi khuẩn hiếu khí 24 3.2.3.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ nitơ lên sinh tổng hợp cellulase vi khuẩn 25 CHƢƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Khảo sát hàm lượng cellulose chất bã mía .26 4.2 Phân lập tuyển chọn số dịng vi khuẩn hiếu khí có khả thủy phân bã mía cao 27 4.2.1 Phân lập sơ số dòng vi khuẩn hiếu khí có khả thủy phân bã mía 27 4.2.2 Tuyển chọn dòng vi khuẩn hiếu khí có khả thủy phân bã mía mạnh 29 4.3 Ảnh hưởng tương tác nhiệt độ pH đến khả sinh tổng hợp cellulase vi khuẩn 32 4.4 Ảnh hưởng thời gian lên khả sinh tổng hợp cellulase vi khuẩn .34 4.5 Ảnh hưởng nitrogen lên khả sinh tổng hợp cellulase vi khuẩn 38 4.6 Ảnh hưởng nồng độ beef extract lên khả sinh tổng hợp cellulase vi khuẩn 39 CHƢƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .41 TÀI LIỆU THAM KHẢO iv DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Thành phần hóa học bã mía Bảng 2: Thành phần môi trường 21 Bảng 3: Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitơ lên trình sinh tổng hợp cellulase vi khuẩn 25 Bảng 4: Kết phân tích hàm lượng cellulose bã mía .26 Bảng 5: Phần trăm thành phần bã mía 27 Bảng Hình dạng đặc tính vi khuẩn khuẩn lạc 12 dịng vi khuẩn hiếu khí .27 Bảng 7: Đường trịn đường kính thủy phân (Dhalo) 12 dịng vi khuẩn hiếu khí 30 Bảng 8: Bảng tóm tắt kết xác định hoạt tính endoglucanase exoglucanase dịng vi khuẩn 22 .37 v DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Cấu trúc phân tử cellulose .4 Hình 2: Cấu trúc liên kết hydro bên bên chuỗi phân tử cellulose Hình 3: Cấu trúc phân tử lignin Hình 4: Sơ đồ chế thủy phân cellulose phức hệ enzyme cellulase Hình 5: Một số thiết bị thí nghiệm 19 Hình 6: Sơ đồ chuẩn bị bột bã mía 20 Hình 7: Sơ đồ xác định hàm lượng cellulose bã mía 22 Hình 8: Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn .29 Hình 9: Hình dạng vi khuẩn .29 Hình 10: Hình gram âm vi khuẩn 29 Hình 11 : Dịng vi khuẩn có hoạt tính khơng có hoạt tính cellulase .30 Hình 12: Tương tác pH nhiệt độ dòng vi khuẩn 32 Hình 13: Tương tác pH nhiệt độ dòng vi khuẩn 22 34 Hình 14: Hoạt tính endoglucanase exoglucanase theo thời gian dòng vi khuẩn 35 Hinh 15: Hoạt tính endoglucanase exoglucanase theo thời gian dòng vi khuẩn 22 35 Hình 16: Hàm lượng protein theo thời gian dịng vi khuẩn 22 .36 Hình 17: Ảnh hưởng nguồn nitrogen khác lên khả sinh tổng hợp cellulase dòng vi khuẩn .38 Hình 18: Ảnh hưởng nồng độ beef extract lên trình sinh tổng hợp cellulase dịng vi khuẩn 22 .40 vi PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: PHƢƠNG PHÁP VI SINH Phương pháp ni cấy vi khuẩn hiếu khí Các bước chuẩn bị môi trường nuôi cấy Phương pháp pha loãng Phương pháp đếm mật số vi khuẩn cách đếm sống Phương pháp nhuộm gram Phương pháp kiểm tra hoạt tính cellulose đường kính đường trịn thủy phân PHỤ LỤC 2: PHƢƠNG PHÁP SINH HÓA Phương pháp phân tích cellulose Xác định hàm lượng protein phương pháp Bradford (1976) Phương pháp xác định hoạt tính enzyme (Nelson-Somogyi, 1944) PHỤ LỤC 3: HÌNH MINH HOẠ PHỤ LỤC 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU PHỤ LỤC 5: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ vii Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Cho vào ống 250 l CMC 0.5% (hoặc Avicel 0.5%) + 300 l enzyme + 250 l đệm acetate Ủ 30 phút 40oC Cho 150 l thuốc thử Đồng vào Đối chứng: lấy ống eppendorf khác, dùng enzyme bất hoạt (đun nóng 100oC 30 phút) (bố trí song song với thí nghiệm có enzyme chưa bất hoạt) Xác định hàm lượng đường khử sinh mẫu theo đường chuẩn Tính tốn kết quả: Đơn vị hoạt tính enzyme 1ml enzyme tính theo cơng thức: U= * K’ Trong đó: U: hoạt tính enzyme (U/ml) X: Hàm lượng glucose dung dịch đo T: thời gian phản ứng (30 phút) VE: Thể tích enzyme (150 l) K’: hệ số pha lỗng Đơn vị hoạt tính riêng enzyme (hoạt tính đặc hiệu) số đơn vị hoạt tính 1mg protein U/mg Chun ngành cơng nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT PHỤ LỤC 3: HÌNH MINH HOẠ Hình 23: Hoạt độ thuỷ phân dòng vi khuẩn pH 7, 300C Hình 25: Hoạt độ thuỷ phân dịng vi khuẩn với hàm lƣợng nitrogen 0.5% Hình 27: Hoạt độ thuỷ phân dòng vi khuẩn với nồng độ beef extract 0.5% Chuyên ngành công nghệ sinh học Hình 24: Hoạt độ thuỷ phân dịng vi khuẩn 22 pH 5, 350C Hình 26: Hoạt độ thuỷ phân dòng vi khuẩn 22 với hàm lƣợng nitrogen 0.5% Hình 28: Hoạt độ thuỷ phân dịng vi khuẩn 22 với nồng độ beef extract 0.2% Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT PHỤ LỤC 4: KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Kết thí nghiệm Bảng 12: Kết khảo sát đƣờng kính đƣờng trịn thuỷ phân bã mía 12 dịng vi khuẩn hiếu khí Dịng 10 14 14c 21 22 24 25 28 Lặp lần 0 0 0 Lặp lần 0 0 Lặp lần 0 0 0 TB 4.67 0.67 2.00 0.00 0.00 1.00 0.00 0.00 5.00 2.00 0.00 0.33 Bảng 13: Kết mật số vi khuẩn khảo sát đƣờng trịn đƣờng kính thuỷ phân bã mía 12 dịng vi khuẩn hiếu khí Dòng 10 14 14c 21 22 24 25 28 Lặp lần 1 15 1 Chuyên ngành công nghệ sinh học Lặp lần 0 0 14 3 Lặp lần 10 0 0 13 TB 8.33 0.33 0.00 4.00 3.33 0.33 0.33 0.67 14.00 4.33 0.33 1.67 CFU/ml 1.67 0.07 0.00 0.80 0.67 0.07 0.07 0.13 2.80 0.87 0.07 0.33 Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Kết thí nghiệm Bảng 14: Khảo sát tƣơng tác pH nhiệt độ lên khả sinh tổng hợp cellulase dòng vi khuẩn Nhiệt độ/ pH 25 lặp lần lặp lần lặp lần Trung bình 30 lặp lần lặp lần lặp lần Trung bình 35 lặp lần lặp lần lặp lần Trung bình 40 lặp lần lặp lần lặp lần Trung bình 45 lặp lần lặp lần lặp lần Trung bình 50 lặp lần lặp lần lặp lần Trung bình 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 4.67 0 0 3 2.67 0 0 0 0 6 5.33 8 7.00 5.33 5 5.33 6 5.67 0 0 7 7.67 9 8.67 8 8.00 7.00 6 6.33 0 0 0 0 0 0 4 3.33 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 11 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Bảng 15: Khảo sát tƣơng tác pH nhiệt độ lên khả sinh tổng hợp cellulase dòng vi khuẩn 22 Nhiệt độ/ pH 25 lặp lần lặp lần lặp lần Trung bình 30 lặp lần lặp lần lặp lần Trung bình 35 lặp lần 0 0 0 0 Chuyên ngành công nghệ sinh học 4 3.67 6 5.33 6 2 2.33 3 2.67 0 0.00 2.33 0 0 0 0 0 0 0 0 10 0 0 0 0 11 0 0 0 0 Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 lặp lần lặp lần Trung bình 40 lặp lần lặp lần lặp lần Trung bình 45 lặp lần lặp lần lặp lần Trung bình 50 lặp lần lặp lần lặp lần Trung bình 0 0 0 0 0 0 0 Trường ĐHCT 6 6.00 3 3.67 0 0.00 0 0 5.00 4 3.67 1.00 1 4.33 0 0.00 0 0.00 0 0 0 0.00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Kết thí nghiệm 4: Bảng 16: số liệu OD hàm lƣợng protein dòng vi khuẩn Giờ số lần lặp 24 lặp lại 0.065 0.079 0.086 0.077 lặp lại 0.068 0.076 0.071 0.072 lặp lại 0.07 0.071 0.074 0.072 lặp lại 0.096 0.138 0.133 0.122 lặp lại 0.106 0.108 0.106 0.107 lặp lại 0.108 0.108 0.105 0.107 lặp lại 0.119 0.112 0.118 0.116 lặp lại 0.134 0.133 0.138 0.135 lặp lại 0.134 0.116 0.113 0.121 lặp lại 0.126 0.168 0.117 0.137 lặp lại 0.119 0.135 0.123 0.126 lặp lại 0.156 0.165 0.139 0.153 lặp lại 0.039 0.035 0.045 0.040 lặp lại 0.048 0.06 0.039 0.049 lặp lại 0.054 0.045 0.063 0.054 48 72 96 120 TB lặp OD595nm Chuyên ngành công nghệ sinh học TB OD595nm Hàm lượng protein (µg/ml) 0.073333 28.17 0.112 47.50 0.124111 53.56 0.138667 60.83 0.047556 15.28 Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Bảng 17: Số liệu hoạt tính endoglucanase dòng vi khuẩn endoglucanase Giờ 24 48 72 96 120 số lần lặp lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại OD ĐC 0.113 0.123 0.118 0.114 0.114 0.108 0.124 0.119 0.115 0.172 0.182 0.16 0.109 0.108 0.112 0.115 0.124 0.118 0.114 0.105 0.119 0.123 0.113 0.116 0.166 0.2 0.168 0.114 0.108 0.107 Giờ OD1 OD2 OD3 OD TB Đường khử (µg/ml) Hoạt tính endoglucanase (U/ml) 0.114 0.121 0.118 0.124 0.117 0.111 0.125 0.118 0.118 0.179 0.205 0.174 0.104 0.105 0.112 TB đối chứng 0.114 0.123 0.118 0.117 0.112 0.113 0.124 0.117 0.116 0.172 0.196 0.167 0.109 0.107 0.110 OD mẫu thật 0.282 0.135 0.133 0.138 0.141 0.14 0.138 0.15 0.159 0.241 0.201 0.242 0.172 0.106 0.113 0.131 0.131 0.133 0.139 0.162 0.15 0.157 0.143 0.165 0.224 0.193 0.315 0.163 0.111 0.108 0.129 0.136 0.143 0.153 0.158 0.143 0.2 0.144 0.17 0.249 0.205 0.277 0.167 0.109 0.122 24 0.067 0.011 0.018 0.026 0.008 48 0.026 0.042 0.032 0.033 0.013 72 0.041 0.029 0.048 0.039 0.018 96 0.066 0.004 0.111 0.060 0.034 120 0.058 0.002 0.004 0.021 0.004 0.0009 0.0015 0.0020 0.0038 0.0005 TB mẫu thật 0.181 0.134 0.136 0.143 0.154 0.144 0.165 0.146 0.165 0.238 0.200 0.278 0.167 0.109 0.114 Hiệu TB 0.067 0.011 0.018 0.026 0.042 0.032 0.041 0.029 0.048 0.066 0.004 0.111 0.058 0.002 0.004 Bảng 18: Số liệu hoạt tính exoglucanase dịng vi khuẩn Giờ 24 48 72 96 exoglucanase số lần lặp lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại TB đối chứng OD ĐC 0.128 0.124 0.138 0.11 0.112 0.119 0.138 0.132 0.13 0.133 Chuyên ngành công nghệ sinh học 0.129 0.124 0.136 0.11 0.117 0.117 0.137 0.133 0.136 0.132 0.129 0.138 0.139 0.111 0.12 0.12 0.131 0.131 0.13 0.139 0.129 0.129 0.138 0.110 0.116 0.119 0.135 0.132 0.132 0.135 OD mẫu thật 0.145 0.16 0.154 0.132 0.165 0.134 0.158 0.132 0.18 0.141 0.142 0.159 0.152 0.134 0.13 0.141 0.151 0.162 0.174 0.174 0.156 0.158 0.151 0.131 0.136 0.18 0.167 0.183 0.175 0.142 TB mẫu thật 0.148 0.159 0.152 0.132 0.144 0.152 0.159 0.159 0.176 0.152 Hiệu TB 0.019 0.030 0.015 0.022 0.027 0.033 0.023 0.027 0.044 0.018 Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 120 lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại 0.138 0.132 0.114 0.108 0.111 0.139 0.138 0.109 0.106 0.116 Giờ OD1 OD2 OD3 OD TB Đường khử (µg/ml) Hoạt tính exoglucanase (U/ml) Trường ĐHCT 0.136 0.131 0.11 0.112 0.114 0.138 0.134 0.111 0.109 0.114 0.148 0.259 0.144 0.119 0.121 0.145 0.297 0.122 0.117 0.126 0.147 0.166 0.145 0.114 0.247 24 0.019 0.030 0.015 0.021 0.004 48 0.022 0.027 0.033 0.027 0.009 72 0.023 0.027 0.044 0.032 0.012 96 0.018 0.009 0.107 0.045 0.022 120 0.026 0.008 0.051 0.028 0.010 0.0005 0.0010 0.0013 0.0025 0.0011 0.147 0.241 0.137 0.117 0.165 0.009 0.107 0.026 0.008 0.051 Bảng 19: Số liệu OD hàm lƣợng protein dòng vi khuẩn 22 Giờ số lần lặp lặp lại 0.29 0.277 0.297 0.288 lặp lại 0.474 0.443 0.427 0.448 lặp lại 0.429 0.408 0.427 0.421 lặp lại 0.457 0.527 0.45 0.478 lặp lại 0.481 0.451 0.491 0.474 lặp lại 0.527 0.516 0.462 0.502 lặp lại 0.439 0.45 0.473 0.454 lặp lại 0.429 0.43 0.437 0.432 lặp lại 0.403 0.405 0.393 0.400 lặp lại 0.307 0.328 0.311 0.315 lặp lại 0.352 0.362 0.344 0.353 lặp lại 0.398 0.343 0.338 0.360 lặp lại 0.323 0.303 0.307 0.311 lặp lại 0.326 0.329 0.323 0.326 lặp lại 0.334 0.318 0.326 0.326 48 72 96 120 TB OD595nm OD lặp Hàm lượng protein (µg/ml) OD595nm Chuyên ngành công nghệ sinh học 0.218 100.39 0.317 149.83 0.261 121.89 0.175 78.78 0.153 68.00 Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Bảng 20: Số liệu hoạt tính endoglucanase dịng vi khuẩn 22 endoglucanase ngày số lần lặp 24 lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại 48 72 96 120 TB đối chứng OD ĐC 0.16 0.151 0.199 0.182 0.192 0.236 0.165 0.176 0.162 0.168 0.161 0.168 0.19 0.231 0.187 0.131 0.158 0.131 0.162 0.194 0.236 0.171 0.168 0.146 0.167 0.172 0.171 0.191 0.211 0.161 Giờ OD1 OD2 OD3 OD TB Đường khử (µg/ml) Hoạt tính endoglucanase(U/ml) 0.147 0.144 0.135 0.17 0.201 0.227 0.198 0.171 0.135 0.192 0.167 0.186 0.185 0.165 0.203 24 0.100 0.091 0.113 0.091 0.059 0.146 0.151 0.155 0.171 0.196 0.233 0.178 0.172 0.148 0.176 0.167 0.175 0.189 0.202 0.184 OD mẫu thật 0.209 0.26 0.322 0.384 0.477 0.344 0.341 0.317 0.312 0.273 0.302 0.429 0.25 0.322 0.311 0.257 0.233 0.236 0.345 0.351 0.364 0.349 0.31 0.316 0.266 0.295 0.358 0.22 0.254 0.324 0.272 0.234 0.245 0.365 0.429 0.369 0.382 0.314 0.318 0.295 0.305 0.344 0.245 0.299 0.318 48 0.193 0.223 0.126 0.171 0.121 72 0.179 0.142 0.168 0.153 0.107 96 0.102 0.134 0.202 0.136 0.093 120 0.050 0.089 0.134 0.081 0.051 0.0065 0.0134 0.0118 0.0104 0.0056 Hiệu TB TB mẫu thật 0.246 0.242 0.268 0.365 0.419 0.359 0.357 0.314 0.315 0.278 0.301 0.377 0.238 0.292 0.318 0.100 0.091 0.113 0.193 0.223 0.126 0.179 0.142 0.168 0.102 0.134 0.202 0.050 0.089 0.134 Bảng 21: Số liệu hoạt tính exoglucanase dịng vi khuẩn 22 Giờ 24 48 72 96 số lần lặp lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại ĐC 0.203 0.186 0.203 0.154 0.161 0.17 0.199 0.19 0.184 0.151 Chuyên ngành công nghệ sinh học 0.199 0.237 0.239 0.173 0.158 0.161 0.189 0.206 0.173 0.191 0.232 0.26 0.178 0.189 0.178 0.167 0.208 0.223 0.218 0.198 exoglucanase TB Mẫu thật OD 0.211 0.243 0.265 0.228 0.296 0.268 0.207 0.252 0.254 0.172 0.344 0.336 0.166 0.316 0.4 0.166 0.33 0.341 0.199 0.337 0.338 0.206 0.344 0.391 0.192 0.319 0.345 0.180 0.324 0.313 0.324 0.34 0.258 0.339 0.317 0.307 0.311 0.406 0.364 0.335 TB OD 0.277 0.301 0.255 0.340 0.344 0.326 0.329 0.380 0.343 0.324 Hiệu TB 0.066 0.074 0.048 0.168 0.179 0.160 0.130 0.174 0.151 0.144 Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 120 lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại lặp lại 0.162 0.161 0.178 0.154 0.153 Trường ĐHCT 0.188 0.154 0.184 0.161 0.185 Giờ OD1 OD2 OD3 OD TB Đường khử (µg/ml) Hoạt tính exoglucanase (U/ml) 0.151 0.183 0.172 0.165 0.175 0.167 0.166 0.178 0.160 0.171 0.304 0.29 0.246 0.229 0.23 0.322 0.29 0.247 0.267 0.223 0.315 0.261 0.263 0.277 0.262 24 0.066 0.074 0.048 0.045 0.022 48 0.168 0.179 0.160 0.151 0.105 72 0.130 0.174 0.151 0.134 0.092 96 0.144 0.147 0.114 0.117 0.079 120 0.074 0.098 0.067 0.062 0.036 0.0025 0.0117 0.0102 0.0087 0.0039 0.314 0.280 0.252 0.258 0.238 0.147 0.114 0.074 0.098 0.067 Kết thí nghiệm 5: Bảng 22: Kết khảo sát nguồn nitơ lên khả thuỷ phân bã mía dịng vi khuẩn dịng Nguồn nitơ Đường kính thuỷ phân (mm) Giá trị TB Beef extract 6 6 Peptone 0 0.666667 NH4NO3 0 0 NH4H2PO4 0 0 (NH4)2SO4 0 0 urea 0 0.333333 Bảng 23: Kết khảo sát nguồn nitơ lên khả thuỷ phân bã mía dịng vi khuẩn dịng 22 Nguồn nitơ Đường kính thuỷ phân (mm) Giá trị TB Beef extract 4 4 Peptone 1 1.33333 NH4NO3 0 0.33333 NH4H2PO4 0 0 (NH4)2SO4 0 0 urea 1 1.33333 Chuyên ngành công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Kết thí nghiệm 6: Bảng 24: Kết khảo sát nguồn nitơ lên khả thuỷ phân bã mía dịng vi khuẩn dịng Nồng độ beef extract (%) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0 2 5 Đường kính thuỷ phân (mm) 0 4 5 0 4 4 Giá trị TB 0 1.666667 6.666667 3.333333 4.333333 4.666667 Bảng 25: Kết khảo sát nguồn nitơ lên khả thuỷ phân bã mía dịng vi khuẩn dòng 22 Nồng độ beef extract (%) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 Chuyên ngành công nghệ sinh học 14 16 14 13 Đường kính thuỷ phân (mm) 14 16 12 14 12 5 14 14 12 14 14 5 Giá trị TB 14 15.33333 12.66667 13.66667 11.66667 5.333333 5.333333 7.666667 Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT PHỤ LỤC 5: PHÂN TÍCH THỐNG KÊ Thống kê thí nghiệm 2: Tuyển chọn dịng vi khuẩn có khả thuỷ phân bã mía Bảng 26: Thống kê đƣờng kính đƣờng trịn thuỷ phân 12 dịng vi khuẩn hiếu khí Bảng 27: Thống kê mật số vi khuẩn 12 dịng vi khuẩn hiếu khí 2.Thống kế thí nghiệm 3: Tƣơng tác pH nhiệt độ dịng vi khuẩn hiếu khí đƣợc chọn Chuyên ngành công nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Bảng 28: Thống kê tƣơng tác pH nhiệt độ dòng vi khuẩn Bảng 29: Thống kê tƣơng tác pH nhiệt độ dịng vi khuẩn 22 Chun ngành cơng nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Thống kê thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng thời gian lên khả sinh tổng hợp cellulase vi khuẩn Bảng 30: Thống kê khác biệt hàm lƣợng protein, hoạt tính endoglucanse exoglucanase heo thời gian dòng vi khuẩn Bảng 31: Thống kê khác biệt hoạt tính hàm lƣợng protein, endoglucanase exoglucanase theo thời gian dịng vi khuẩn 22 Chun ngành cơng nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Thống kê thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng nguồn nitơ lên khả sinh cellulase vi khuẩn Bảng 32: Thống kê khác biệt nguồn nitơ - dòng vi khuẩn Bảng 33: Thống kê khác biệt nguồn nitơ - dịng vi khuẩn 22 Chú thích: 1: Beef extract 2: Peptone 3: NH4NO3 Chuyên ngành công nghệ sinh học 4: NH4H2PO4 5: (NH4)2SO4 6: Urea Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Thống kê thí nghiệm 6: Ảnh hƣởng nồng độ beef extract lên khả thuỷ phân vi khuẩn Bảng 34: Thống kê khác biệt nồng độ beef extract – dòng vi khuẩn Bảng 35: Thống kê khác biệt nồng độ beef extract - dịng vi khuẩn 22 Chun ngành cơng nghệ sinh học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học ... tuyển chọn số dịng vi khuẩn hiếu khí có khả thủy phân bã mía cao 4.2.1 Phân lập sơ số dịng vi khuẩn hiếu khí có khả thủy phân bã mía 12 dịng vi khuẩn hiếu khí phân lập từ mẫu bã mía nhà máy đường... cellulose chất bã mía .26 4.2 Phân lập tuyển chọn số dịng vi khuẩn hiếu khí có khả thủy phân bã mía cao 27 4.2.1 Phân lập sơ số dịng vi khuẩn hiếu khí có khả thủy phân bã mía ... bã mía 3.2.3.2 Thí nghiệm Phân lập tuyển chọn số dịng vi khuẩn hiếu có khả sinh tổng hợp cellulase cao a Phân lập dòng vi khuẩn hiếu khí có khả phát triển chất bã mía Mục đích: chọn dịng vi khuẩn