Tuyển Chọn Và Khảo Sát Điều Kiện Nuôi Cấy Vi Khuẩn Kỵ Khí Có Khả Năng Thủy Phân Rơm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC TUYỂN CHỌN VÀ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VI KHUẨN KỴ KHÍ CĨ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN RƠM CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ThS VÕ VĂN SONG TOÀN ThS DƯƠNG THỊ HƯƠNG GIANG SINH VIÊN THỰC HIỆN TÔ THỊ NGỌC ANH MSSV:3064437 LỚP:CNSH TT K32 Cần Thơ, Tháng 11/2010 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN ThS.Võ Văn Song Tồn Tơ Thị Ngọc Anh CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ThS.Dương Thị Hương Giang DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2010 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) LỜI CẢM TẠ Em xin chân thành gửi lời cám ơn sâu sắc đến: Các thầy cô truyền dạy kiến thức cho em suốt năm học vừa qua Ban giám đốc, thầy cô, anh chị phụ trách Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ sinh học quan tâm tạo điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành luận văn cách tốt Cô Dương Thị Hương Giang, thầy Võ Văn Song Tồn tận tình hướng dẫn, truyền đạt tri thức bổ ích, tác phong làm việc khoa học, giúp đỡ em suốt thời gian thực luận văn Chị Nguyễn Thị Xuân Dung, anh Nguyễn Ngọc Thạnh trao đổi, truyền đạt kinh nghiệm tạo điều kiện cho em thực thí nghiệm Em xin chân thành cám ơn Cô cố vấn học tập, bạn lớp bạn CNSH 33 phịng sinh hóa đồng hành động viên em học tập Em xin kính chúc q thầy bạn sinh viên dồi sức khoẻ công tác tốt Cần Thơ, ngày tháng năm 2010 Tơ Thị Ngọc Anh i TĨM LƯỢC Mười bốn dịng vi khuẩn kỵ khí phân lập từ cỏ bị có khả sinh cellulase ni cấy tách rịng môi trường agar chứa 0,5% chất rơm Kiểm tra hoạt tính thủy phân 14 dịng vi khuẩn kỵ khí phân lập từ cỏ bị mơi trường agar chứa rơm 0,5% cho thấy dòng vi khuẩn 43 sinh trưởng mạnh mẽ, có khả thủy phân rơm mạnh 13 dòng lại Dòng 43 vi khuẩn gram âm, có dạng cầu đơi, chuyển động Chúng sinh trưởng khoảng pH rộng từ 5,0 – 10,0, nhiệt độ từ 25-40 0C Trong điều kiện pH 6,0, nhiệt độ 300C, dòng 43 cho hoạt độ thủy phân cao Với thời gian ủ ngày, tương ứng với mật số vi khuẩn chủng đầu vào 106, dòng 43 sinh trưởng nhanh, hàm lượng protein sinh 0,10 mg/ml, đường khử sinh đạt giá trị 0,046µg/ml Từ khóa: cỏ bị, đường khử, kỵ khí, thủy phân, rơm ii MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT LỜI CẢM TẠ TÓM LƯỢC i MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG v DANH SÁCH HÌNH .vi CÁC TỪ VIẾT TẮT vii CHƯƠNG GIỚI THIỆU CHƯƠNG LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 TỔNG QUAN VỀ RƠM RẠ, CELLULOSE, 2.1.1 Tổng quan rơm .3 2.1.2 Cellulose .4 2.2 CELLULASE 2.2.1 Tổng quan Cellulase .6 2.2.2 Cơ chế hoạt động Cellulase 2.2.3 Giá trị kinh tế Cellulase 2.2.4 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1.1 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí 2.3.1.2 Phương pháp đo đường kính thủy phân 2.3.1.3 Phương pháp pha loãng vi sinh vật 2.3.1.4 Phương pháp nhuộm gram vi khuẩn 10 2.3.1.5 Đếm mật số vi sinh vật phương pháp đếm sống 10 2.2.5 Phương pháp sinh hóa 11 2.3.2.1 Định lượng protein phương pháp Bradford (1976) 11 2.3.2.1 Xác định hoạt tính Cellulase phương pháp Nelson- Somogyi (1942) 11 2.3 TỔNG QUAN VỀ HỆ VI SINH VẬT KỴ KHÍ TRONG DẠ CỎ TRÂU BÒ 11 2.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƯỚC 12 2.4.1 Trong nước .12 iii 2.4.2 Ngoài nước .12 CHƯƠNG PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 3.1 Địa điểm, thời gian, hóa chất, phương tiện nghiên cứu 13 3.1.1 Địa điểm 13 3.1.2 Thời gian 13 3.1.3 Vật liệu thí nghiệm 13 3.1.3.1 Nguyên liệu 13 3.1.3.2 Nguồn gốc vi khuẩn 13 3.1.4 Hoá chất 13 3.1.5 Thiết bị 13 3.1.6 Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật 13 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.2.1 TN1: Khảo sát hàm lượng cellulose bột rơm 14 3.2.2 TN2: Phân lập vi khuẩn kỵ khí mơi trường chất rơm 15 3.2.3 TN3: Tuyển chọn dịng vi khuẩn kỵ khí có khả thủy phân rơm cao 15 3.2.4 TN4: Khảo sát nhiệt độ pH tối ưu cho phát triển vi khuẩn chất rơm 16 3.2.5 TN5: Khảo sát thời gian tối ưu cho phát triển dòng vi khuẩn thủy phân rơm 17 3.2.6 TN6: Khảo sát ảnh hưởng mật độ vi khuẩn chủng vào lên trình phân hủy rơm 18 3.3 Xử lý thống kê 19 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 4.1 TN1: Hàm lượng cellulose bột rơm 20 4.2 TN 2: Kiểm tra độ rịng, nhuộm gram, mơ tả đặc điểm khuẩn lạc vi khuẩn .20 4.3 TN3: Tuyển chọn dịng vi khuẩn kỵ khí có khả thủy phân rơm cao 23 4.4 TN4: Khảo sát pH nhiệt độ tối ưu cho phát triển dòng 43 51 25 4.5 TN5: Khảo sát thời gian tối ưu cho phát triển dòng vi khuẩn 43 .27 4.6 TN6: Ảnh hưởng mật số vi khuẩn chủng vào đến sinh trưởng vi khuẩn 30 iv CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33 5.1 Kết luận 33 5.2 Đề nghị 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO .34 v DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Thành phần cellulose, hemicelluloses ligin số thực vật Bảng 2: Thành phần môi trường rơm .14 Bảng 3: Thành phần % cellulose loại rơm khác 20 Bảng 4: Hình thái khuẩn lạc 22 Bảng 5: Hình thái vi khuẩn 22 Bảng 6: Số liệu đường kính thủy phân 14 dịng vi khuẩn kỵ khí 24 vi DANH SÁCH HÌNH Hình (a): Đốt rơm đồng ruộng Hình (b): Sử dụng rơm làm giá thể trồng nấm Hình 2: Phân tử cellulose đơn phân phân tử cellulose Hình 3: Liên kết hydro nội gian phân tử cellulose .5 Hình 4: Cấu trúc enzyme cellulase Hình 5: Cơ chế hoạt động enzyme cellulase Hình 6: Bình hút ẩm chân khơng .8 Hình 7: Cách pha loãng mẫu 10 Hình 8: Các bước xác định hàm lượng cellulose bột rơm 14 Hình 9: Quy trình tuyển chọn dịng vi khuẩn kỵ khí có khả thủy phân rơm cao 16 Hình 10: Quy trình khảo sát thời gian tối ưu cho phát triển dòng vi khuẩn chọn 17 Hình 11: Quy trình khảo sát ảnh hưởng mật số vi khuẩn lên hiệu suất thủy phân rơm 18 Hình 12: Khuẩn lạc dịng vi khuẩn 30 (a), 33 (b), 38 (c), 39 (d) 21 Hình 13 : Hình thái vi khuẩn 21 Hình 14: Vịng trịn đường kính thủy phân dòng 51 43 sau ngày ủ 23 Hình 15: Vịng trịn thủy phân dịng 43 pH 6,0; 7,0 30 0C 23 Hình 16: Vịng trịn thủy phân dịng 43 tại nhiệt độ ủ 30 0C, 35 0C 26 Hình 17: Biểu đồ thể tương tác pH nhiệt độ đến hoạt tính thủy phân dòng vi khuẩn 43 sau ngày ủ 26 Hình 18: Mật số vi khuẩn theo thời gian 27 Hình 19: Biểu đồ thể hàm lượng protein sinh theo thời gian 28 Hình 20: Biểu đồ thể lượng đường khử sinh theo thời gian (µg/ml) .29 Hình 21: Hoạt tính CMCase theo thời gian .30 Hình 22: Ảnh hưởng mật số chủng vào đến hàm lượng protein sinh 30 Hình 23: Mẫu hàm lượng protein theo mật số vi khuẩn 31 Hình 24: Ảnh hưởng mật số chủng vào đến hàm lượng đường khủ sinh 31 vii CÁC TỪ VIẾT TẮT CBH: Cellobiohydrolase Egl: Endoglucanase Bgl: β-glucosidase CMC: Carboxymethyl-cellulose Số lượng vi sinh vật mẫu lớn độ pha lỗng cao Khi pha lỗng mẫu ý dùng ống hút riêng cho độ pha loãng Mẫu pha loãng thành dãy nồng độ thập phân 1/10, 1/100,…Mỗi bậc pha loãng 1/10 (Trần Linh Thước, 2002) Hình 25 Phương pháp pha lỗng mẫu theo dãy thập phân Chủng cấy vi sinh vật Trước tiến hành cấy, buồng cấy phải khử trùng cẩn thận đèn cực tím 30 phút Môi trường nuôi cấy vi sinh vật đĩa Petri đưa vào buồng cấy số dụng cụ cần thiết khử trùng Sau chủng lên đĩa Petri xong cho vào bình hút ẩm ủ ngày, đếm khuẩn lạc Phương pháp đếm mật số vi khuẩn cách đếm sống Môi trường pha loãng nhiều lần chuyển đến dĩa Petri trộn lẫn với môi trường chứa agar khoảng 45 0C, để nguội, môi trường đặc lại, đem ủ tủ ủ đếm số khuẩn lạc (colony) suy số tế bào dung dịch muốn đếm Phương pháp gọi phương pháp đếm sống có vi sinh vật sống phát triển thành khuẩn lạc (Nguyễn Hữu Hiệp, 2007) Phương pháp nhuộm gram Các bước tiến hành *Pha dung dịch Glugol Nước cất thêm đến 300ml Nghiền KI cối với 5-10ml nước cất Thêm iodine tinh thể vào nghiền hịa tan hồn tồn Cho dung dịch nghiền vào cốc đong thêm nước đến 300ml Bảo quản lọ màu vòng 30 ngày trước sử dụng Bảng Hóa chất pha dung dịch Glugol Tên hoá chất Iodine KI Khối lượng 20 Đơn vị gram gram *Pha dung dịch thuốc nhuộm Basic Fuchsin Bảng Hóa chất pha dung dịch thuốc nhuộm Basic Fuchsin Tên hoá chất Basic Fuchsin Cồn 95% Khối lượng/ Thể Đơn vị tích 0,5 gram 20 Ml Nước cất thêm đến 100ml Hoàn tan 0,5g chất nhuộm Basic Fuchsin 25ml cồn 95% Pha loãng đến 100 ml với nước cất Lọc cần thiết, với giấy lọc Whatman số 31 để lọc bỏ phần chất nhuộm không tan * Pha thuốc nhuộm Crystal Violet Bảng Hóa chất pha thuốc nhuộm Crystal Violet Tên hoá chất Khối lượng /thể tích Đơn vị Crystal violet (chất nhuộm chiếm 90%) gram Ethanol (95%) 20 ml Nước cất 80 ml (*Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2003) *Các bước nhuộm gram Nước vơ trùng lên kính mang vật Chuyển vi sinh vật lên kính mang vật Cố định vi sinh vật kính mang vật 1-2 giọt Crystal violet phút Rửa nước cất vô trùng 1-2 giọt iod phút Rửa cồn 70oC (nhanh) Rửa nước vô trùng 1-2 giọt Fuchsin phút Rửa nước vô trùng Khơ Quan sát mẫu kính hiển vi quang học (x400) Hình 26 Qui trình nhuộm gram vi khuẩn Phương pháp kiểm tra hoạt tính cellulase đường tròn thủy phân Khảo sát hiệu suất thuỷ phân CMC dòng vi khuẩn phân lập Nghiệm thức lặp lại lần, kết trung bình cộng lần lặp lại Mục đích thí nghiệm: Xác định dịng vi khuẩn có khả thủy phân CMC Ngun tắc: Trên mơi trường CMC 1% có bổ sung congo red vi khuẩn phân hủy CMC tạo thành vòng tròn suốt bao quanh khuẩn lạc vi khuẩn Chỉ tiêu quan sát: Hoạt độ thủy phân tính theo cơng thức Đường kính thủy phân E = Đường kính khuẩn lạc Mẫu thử: Các dịng vi khuẩn phân lập Tiến hành thí nghiệm: Dùng kim cấy hoà tan khuẩn lạc vào tuýp eppendoft tuýp có độ đục tương tương sử dụng micropipet hút 10µl dung dịch vi khuẩn nhỏ lên đĩa mơi trường CMC có bổ sung congo red Ind (C32H22N6O6S2Na2) Mỗi đĩa dòng, lần lập lại Quan sát, đo đường kính vịng thủy phân tính hiệu suất II CÁC PHƯƠNG PHÁP SINH HÓA Phương pháp Bradford (1976) Các bước tiến hành: Chuẩn bị dung dịch Bradford: hòa tan 100mg Coomassie Brilliant Blue G250 50ml ethanol 95%  cho thêm 100ml acid phosphoric 85%  khuấy  bổ sung thêm nước cất 1lít  Lọc dung dịch giấy lọc Whatman No.1 trữ chai tối nhiệt độ phòng Xây dựng đường chuẩn : Chuẩn bị dãy protein BSA chuẩn với nồng độ tăng dần từ 0, 5, 10, 20, 30 , 50 µg/ml  Thí nghiệm lặp lại lần  Chuẩn bị ống eppendorf thêm vào chất theo bảng: Ống nghiệm Hóa chất Nồng độ BSA (µg/ml) Thể tích BSA (µl) Thể tích H2O cất (µl) 0 100 5 95 10 10 90 20 20 80 30 30 70 40 40 60 50 50 50  Lắc ống  Lấy 100 l dung dịch từ ống nghiệm cho vào dãy ống nghiệm đánh số tương tự  Cho vào ống 2ml thuốc thử  Lắc ống máy vortex để tránh khơng có bọt khí  Sau 10 phút tiến hành đo OD ( định chuẩn máy quang phổ với dung dịch đệm (ống 1) bước sóng 595 nm Chỉnh OD giá trị Tiến hành đo ống lại  Ghi nhận lại kết  Tính giá trị trung bình lần lặp lại  Vẽ biểu đồ đường chuẩn BSA thể mối tương quan tuyến tính nồng độ protein (g/ml) với độ hấp thu (OD) bước sóng 280nm Định lượng protein có mẫu:  Hàm lượng protein mẫu tiến hành đo đồng thời với việc dựng đường chuẩn Mẫu pha loãng lần, 10 lần 20 lần (đo lặp lại lần)  Lấy 100l mẫu pha loãng cho vào ml dung dịch thuốc thử  Ghi nhận kết quả, lấy giá trị trung bình ống  Từ phương trình đường chuẩn ta suy hàm lượng protein dung dịch đo Phương pháp Nelson (1942) Khảo sát hoạt tính cellulase dịch ni cấy vi khuẩn phương pháp Nelson 1942) Mục đích: Xác định hoạt tính cellulase dịch ni cấy vi khuẩn Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị hóa chất thuốc thử:  Hóa chất: 100mM dung dịch đệm Sodium Acetate pH=0,5, dung dịch CMC 0,5%, dung dịch chuẩn glucose 1mM 50mM dung dịch đệm Sodium acetate pH = 5.0  Thuốc thử đồng: hỗn hợp A1:A2  Thuốc thử Asenomolybdate: hỗn hợp B3:B4  A1: Hòa tan 15g K – Na – tartrate H2O 30g Na2CO3 (khan) với khoảng 300ml nước cất Thêm 20g NaHCO3 Hòa tan 180g Na2SO4 (khan) với khảng 500ml nước cất nóng đun sơi để loại khí Trộn hai dung dịch sau làm nguội hỗn hợp thêm nước đến lít  A2: 5g CuSO4 45g Na2SO4 khan/250ml nước cất  B1: 26,5g (NH4)6MoO24.4H2O/450ml nước cất Vừa khuấy vừa thêm 21ml H2SO4 đậm đặc  B3: Hòa trộn B1 B2 với nhau, để tủ ủ 37 0C 24 – 48 bảo quản tối  B4: 1,5N H2SO4 (41ml H2SO4 đậm đặc/1 lít nước cất) Dựng đường chuẩn glucose:  Pha dung dịch đường chuẩn: chuẩn bị ống nghiệm, cho vào ống thành phần chất theo bảng sau: [Glucose] (mM) Dung dịch glucose (ml) Amac pH 5.0 (ml) Tổng thể tích (ml) 0,0 0,0 1 0,1 0,1 0,9 0,2 0,2 0,8 0,3 0,3 0,7 0,4 0,4 0,6 0,5 0,5 0,5  Dựng đường chuẩn: chuẩn bị dãy ống eppendorf (mỗi nghiệm thức lập lại lần) 0,0 0,1 0,2 0,3 [Glucose] (mM) 300 300 300 300 Dung dịch glucose (µl) 150 150 150 150 Thuốc thử Đồng (µl) Đun sơi 10 phút, để nguội nhiệt độ phòng 150 150 150 150 Thuốc thử Arseno-molybdate (µl) 1 1 Nước cất (ml) Ủ 20 phút Ly tâm có cặn, đo quang phổ bước sóng 520nm 0,4 300 150 0,5 300 150 150 150  Ghi nhận kết Vẽ biểu đồ đường chuẩn Xác định hàm lượng đường khử sản phẩm thủy phân:  Cho vào ống 50l tinh bột 1%+50l enzyme+đệm maleic  Ủ 30 phút 40oC  Cho thuốc thử Đồng vào  Đối chứng: lấy ống eppendorf khác, dùng enzyme bất hoạt (đun nóng 100oC 30 phút) (bố trí song song với thí nghiệm có enzyme chưa bất hoạt)  Xác định hàm lượng đường khử sinh mẫu theo đường chuẩn Tính tốn kết quả:  Đơn vị hoạt tính enzyme 1ml enzyme tính theo cơng thức: U= * K’ Trong U: hoạt tính enzyme (U/ml) X: Hàm lượng glucose dung dịch đo T: thời gian phản ứng (30 phút) VE: Thể tích enzyme (50l) K’: hệ số pha lỗng  Đơn vị hoạt tính riêng enzyme (hoạt tính đặc hiệu) số đơn vị hoạt tính 1mg protein U/mg PHỤ LỤC 2: SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM Thí nghiệm 1: Khảo sát hàm lượng cellulose rơm Bảng 10 Hàm lượng cellulose có rơm Khối lượng cốc sau sấy (g) Khối lượng mẫu (g) 29,3114 28,7581 29,8915 1,0002 1,0097 1,0039 Khối lượng cốc+mẫu sau phân tích (g) 29,6851 29,1218 30,2591 Khối lượng mẫu sau phân tích (g) 0,37 0,36 0,37 Kàm lượng cellulose (%) 37,36 36,02 36,62 Thí nghiệm 3: Tuyển chọn dịng vi khuẩn kỵ khí có khả thủy phân rơm cao Bảng 11 đường kính thủy phân 14 dịng vi khuẩn mơi trường rơm 0,5% STT 10 11 12 13 14 Dòng vi khuẩn 30 31 32 33 36 37 38 39 42 43 44 49 51 52 Đường kính thủy phân (Thời gian ủ ngày) Lặp lại lần B1 a1 (mm) (mm) 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 14,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 23,00 7,00 7,00 7,00 Lặp lại lần a2 (mm) 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 12,00 7,00 7,00 7,00 7,00 Lặp lại lần A3 b2 (mm) (mm) b3 (mm) 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 13,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 Thí nghiệm 5: Khảo sát thời gian tối ưu cho phát triển dòng vi khuẩn 43 Bảng 12 Giá trị OD 595 nm hàm lượng protein theo thời gian Thời gian (ngày) 1 2 3 4 5 6 7 OD 595 nm L1 0,074 0,108 0,051 0,096 0,077 0,064 0,074 0,062 0,158 0,112 0,095 0,118 0,192 0,196 0,138 0,063 0,107 0,073 0,050 0,071 0,095 L2 0,062 0,079 0,045 0,080 0,061 0,064 0,074 0,061 0,156 0,110 0,092 0,125 0,183 0,190 0,132 0,098 0,102 0,073 0,048 0,073 0,081 L3 0,054 0,072 0,038 0,084 0,058 0,065 0,072 0,06 0,15 0,115 0,098 0,120 0,184 0,194 0,136 0,092 0,098 0,073 0,048 0,074 0,071 Bảng 13 Giá trị OD 520nm đường khử hoạt tính CMCase theo thời gian Thời gian (ngày) 1 2 3 4 5 6 L1 0,144 0,12 0,121 0,115 0,141 0,188 0,132 0,131 0,151 0,201 0,196 0,218 0,189 0,164 0,28 0,17 0,177 0,168 OD 520nm (CMC) L2 L1 0,120 0,122 0,117 0,119 0,12 0,121 0,131 0,136 0,138 0,147 0,134 0,131 0,135 0,158 0,141 0,143 0,149 0,187 0,162 0,161 0,246 0,197 0,232 0,241 0,221 0,288 0,288 0,17 0,172 0,172 0,165 0,184 0,173 Đối chứng OD 520nm (CMC) L1 L2 L3 0,116 0,118 0,117 0,117 0,111 0,119 0,114 0,115 0,11 0,11 0,124 0,137 0,133 0,134 0,13 0,134 0,127 0,115 0,114 0,128 0,122 0,122 0,127 0,128 0,128 0,137 0,149 0,166 0,162 0,137 0,134 0,174 0,162 0,159 0,155 0,18 0,139 0,186 0,154 0,223 0,21 0,284 0,146 0,153 0,157 0,156 0,151 0,151 0,156 0,157 0,155 7 0,155 0,145 0,141 0,185 0,151 0,154 0,156 0,148 0,18 0,156 0,156 0,156 0,15 0,141 0,15 0,15 0,145 0,168 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng mật số vi khuẩn chủng vào đến sinh trưởng vi khuẩn Bảng 14 Giá trị OD 595nm hàm lượng protein theo mật số vi khuẩn chủng vào Mẫu vi khuẩn 1 2 3 4 5 L1 0,095 0,216 0,16 0,19 0,162 0,288 0,253 0,238 0,226 0,232 0,202 OD 595 nm L2 0,095 0,217 0,16 0,186 0,232 0,277 0,256 0,246 0,225 0,235 0,224 L3 0,095 0,214 0,183 0,192 0,175 0,278 0,243 0,227 0,254 0,243 0,236 Bảng 15 ảnh hưởng mật số vi khuẩn chủng vào đến lượng đường khử sinh Mẫu vi khuẩn 1 2 3 4 5 L1 0,165 0,165 0,162 0,165 0,171 0,189 0,156 0,167 0,159 0,151 Đối chứng (OD 520nm) (CMC) L2 L3 0,15 0,155 0,164 0,16 0,16 0,158 0,166 0,164 0,187 0,167 0,179 0,182 0,152 0,169 0,167 0,156 0,157 0,173 0,155 0,158 PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ Bảng 16 Kết thống kê hoạt tính thủy phân 14 dịng vi khuẩn kỵ khí sau ngày ủ môi trường thạch rơm Multiple Range Tests for Duong kinh thuy phan by Dong vi khuan -Method: 95.0 percent LSD Dong vi khuan Count Mean Homogeneous Groups -30 7.0 X 52 7.0 X 33 7.0 X 31 7.0 X 32 7.0 X 38 7.0 X 39 7.0 X 42 7.0 X 36 7.0 X 44 7.0 X 49 7.0 X 37 7.0 X 51 12.3333 X 43 13.0 X -* denotes a statistically significant difference Variance Check Cochran's C test: 0.988417 P-Value = 0.023166 Bartlett's test: 4.67293 P-Value = 0.0263347 Hartley's test: 85.3333 Bảng 17 Kết thống kê ảnh hưởng pH nhiệt độ lên hoạt tính thủy phân dịng vi khuẩn 43 sau ngày ủ Analysis of Variance for Duong kinh thuy phan - Type III Sums of Squares Analysis of Variance for Duong kinh thuy phan - Type III Sums of Squares -Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -MAIN EFFECTS A:Nhiet 1530.39 306.078 156.30 0.0000 B:pH 1490.86 212.98 108.76 0.0000 INTERACTIONS AB 1194.72 35 34.1349 17.43 0.0000 RESIDUAL 188.0 96 1.95833 -TOTAL (CORRECTED) 4403.97 143 -All F-ratios are based on the residual mean square error Bảng 18 Thống kê ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính thủy phân rơm dòng vi khuẩn 43 Multiple Range Tests for Duong kinh thuy phan by Nhiet -Method: 95.0 percent LSD Nhiet Count LS Mean Homogeneous Groups -45 24 7.0 X 50 24 7.0 X 40 24 12.375 X 25 24 13.5 X 35 24 14.1667 XX 30 24 14.875 X -* denotes a statistically significant difference Bảng 19 Thống kê ảnh hưởng pH lên hoạt tính thủy phân rơm dòng vi khuẩn 43 Multiple Range Tests for Duong kinh thuy phan by pH -Method: 95.0 percent LSD pH Count LS Mean Homogeneous Groups -11 18 7.0 X 18 7.0 X 10 18 9.83333 X 18 10.7222 X 18 12.6667 X 18 13.6111 X 18 14.9444 X 18 16.1111 X -* denotes a statistically significant difference Đường chuẩn dung dịch BSA Bảng 20 Bảng giá trị OD dung dịch BSA STT OD 30 60 120 180 240 300 L1 0,071 0,187 0,355 0,51 0,653 0,758 L2 0,07 0,187 0,353 0,509 0,655 0,757 L3 0,0705 0,187 0,354 0,5095 0,654 0,7575 OD 595 nm Đường chuẩn BSA 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 y = 0.0026x + 0.0174 R2 = 0.9921 0.4 0.3 0.2 0.1 0 50 100 150 200 250 300 350 Nồng độ BSA (ug/ml) Hình 27 Biểu đồ đường chuẩn protein (BSA) Đường chuẩn dung dịch glucose chuẩn Bảng 21 giá trị OD dung dịch glucose chuẩn STT glucose 0,2 0,4 0,6 0,8 L1 0,11 0,367 0,581 0,844 1,02 1,217 L2 0,107 0,351 0,544 0,876 1,08 1,248 L3 0,108 0,366 0,575 0,817 1,114 1,228 TB 0,108333 0,361333 0,566667 0,845667 1,071333 1,231 TB that 0,000 0,253 0,458 0,737 0,963 1,123 Đường chuẩn đường khử y = 1.1463x + 0.0159 R2 = 0.9955 1.4 1.2 OD 520nm 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 Nồng độ Glucose Hình 28 Biểu đồ đường chuẩn glucose Bảng 22 Thống kê hàm lượng protein sinh theo thời gian Multiple Range Tests for HAM LUONG PROTEIN by THOI GIAN -Method: 95.0 percent LSD THOI GIAN Count Mean Homogeneous Groups -1 0.91 X 0.97 X 1.05 X 1.33 X 3 1.52 X 1.77 X 2.96667 X - denotes a statistically significant difference Variance Check Cochran's C test: 0.529627 P-Value = 0.0758145 Bartlett's test: 1.68209 P-Value = 0.410363 Hartley's test: 16.2173 Bảng 23 Thống kê lượng đường khử sinh theo thời gian Multiple Range Tests for duong khu sinh by THOI GIAN -Method: 95.0 percent LSD THOI GIAN Count Mean Homogeneous Groups 0.0 X 3 0.000333333 X 0.004 X 0.0233333 X 0.024 X 0.025 X 0.054 X - denotes a statistically significant difference Variance Check Cochran's C test: 0.906838 P-Value = 0.0000421051 Bartlett's test: 14.2438 P-Value = 0.0000656399 Hartley's test: 4575.0 Bảng 24 Kết thống kê ảnh hưởng thời gian đến hoạt tính CMCase Multiple Range Tests for CMCase by THOI GIAN -Method: 95.0 percent LSD THOI GIAN Count Mean Homogeneous Groups -2 0.0 X 0.0 X 3 0.0000266667 X 0.00128 X 0.00133333 X 0.00137667 X 0.00299333 X - denotes a statistically significant difference Cochran's C test: 0.914578 P-Value = 0.000266221 Bartlett's test: 13.4352 P-Value = 0.000235378 Hartley's test: 2180.64 Bảng 25 kết thống kê ảnh hưởng mật số vi khuẩn chủng vào đến hàm lượng protein sinh Multiple Range Tests for HAM LUONG PROTEIN by VI KHUAN -Method: 95.0 percent LSD VI KHUAN Count Mean Homogeneous Groups -2 0.07 X 0.07 X 0.08 XX 0.08 XX 0.095 X - denotes a statistically significant difference Variance Check Cochran's C test: 0.8 P-Value = 0.590334 Bartlett's test: 1.25 P-Value = 0.585438 Hartley's test: 4.0 Bảng 26 Kết thống kê ảnh hưởng mật số chủng vào đến hàm lượng đường khử sinh Multiple Range Tests for Duong khu sinh by Mau vi khuan -Method: 95.0 percent LSD Mau vi khuan Count Mean Homogeneous Groups -5 0.0285 X 0.0295 X 0.031 X 2 0.032 X 0.0465 X -* denotes a statistically significant difference Variance Check Cochran's C test: 0.316129 P-Value = 1.0 Bartlett's test: 1.13252 P-Value = 0.978678 Hartley's test: 3.0625 ... 1998) Đề tài "TUYỂN CHỌN VÀ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VI KHUẨN KỴ KHÍ CĨ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN RƠM" có ý nghĩa thiết thực nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn kỵ khí phân lập từ cỏ bị xử lý rơm rạ sau thu... cellulose bột rơm 14 3.2.2 TN2: Phân lập vi khuẩn kỵ khí mơi trường chất rơm 15 3.2.3 TN3: Tuyển chọn dịng vi khuẩn kỵ khí có khả thủy phân rơm cao 15 3.2.4 TN4: Khảo sát nhiệt độ... dòng vi khuẩn kỵ khí kiểm tra khả thủy phân rơm mơi trường thạch rơm 0,5% Trong dịng 43 có khả thủy phân rơm tạo đường trịn thủy phân Dịng 43 chọn lựa cho thí nghiệm Dòng vi khuẩn 43 vi khuẩn