Nghiên cứu tuyển chọn và xác định điều kiện nuôi cấy chủng sinhchitinase cho thu nhận n acetyl d glucosamin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - ĐINH VĂN BÔN NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VÀ XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY CHỦNG SINH CHITINASE CHO THU NHẬN N-ACETYL-D-GLUCOSAMINE LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN : PGS.TS Lê Thanh Hà Hà Nội – Năm 2015 Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn LỜI CAM ĐOAN Tôi Đinh Văn Bôn xin cam đoan nội dung luận văn với đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn xác định điều kiện nuôi cấy chủng sinhchitinase cho thu nhận N-acetyl-D-glucosamin” công trình nghiên cứu sáng tạo thực dƣới hƣớng dẫn PGS TS Lê Thanh Hà Các số liệu, kết trình bày luận văn hoàn toàn trung thực chƣa công bố công trình khoa học khác Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đƣợc luận văn này, cố gắng nỗ lực thân, nhận đƣợc ủng hộ, giúp đỡ tận tình thầy cô giáo, gia đình bạn bè Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Thanh Hà - Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội tận tình bảo suốt trình thực đồ án tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn tới thầy cô giáo thuộc Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm – Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội giảng dạy giúp đỡ suốt trình học tậ p thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn! Sinh viên Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU 10 PHẦN I TỔNG QUAN 12 1.1 Chitinase 12 1.1.1 Cấu trúc 12 1.1.2 Cơ chế hoạt động chitinase 13 1.1.3 Các đặc tính hệ chitinase [4] 14 1.1.3.1 Trọng lƣợng phân tử 14 1.1.3.2 Điểm đẳng điện, số Michaelis 14 1.1.3.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ 14 1.1.3.4 Ảnh hƣởng pH 15 1.1.3.5 Các ion kim loại 15 1.1.3.6 Sự ổn định 15 1.1.4 Các nguồn thu nhận chitinase [4],[15] 16 1.1.4.1 Vi khuẩn 16 1.1.4.2 Chitinase nấm 16 1.1.5 Sơ lƣợc nghiên cứu chitinase từ vi sinh vật 16 1.1.5.1 Tình hình nghiên cứu giới 16 1.1.5.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc 19 1.2 Đặc điểm sinh học chi nấm mốc Penicillium 20 1.2.1 Vị trí phân loại Penicillium hệ thống phân loại nấm [1],[14] 20 1.2.2 Chitinase sinh tổng hợp chi Penicillium [1] 20 1.2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả sinh tổng hợp chitinase 20 1.2.3.1 Ảnh hƣởng thành phần dinh dƣỡng 21 1.2.3.2 Ảnh hƣởng điều kiện lên men 22 1.3 Chitin 23 Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn 1.3.1 Nguồn gốc Chitin 23 1.3.2 Cấu tạo chitin 24 1.3.3 Các tính chất chitin [15],[21] 25 1.4 N-Acetyl-D- glucosamin (GlcNAc) 26 1.4.1 Cấu tạo N-Acetyl-D- glucosamin 26 1.4.2 Tính chất N-Acetyl-D- glucosamin 26 1.4 Ứng dụng N-Acetyl-D- glucosamin [12] 27 PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 28 2.1 Nguyên vật liệu 28 2.1.1 Giống vi sinh vật 28 2.1.2 Hóa chất 28 2.1.3 Dụng cụ 28 2.1.4 Các thiết bị 28 2.1.5 Môi trƣờng 29 2.1.5.1 Môi trƣờng nhân giữ giống 29 2.1.5.2 Môi trƣờng czapeck (môi trƣờng hoạt hóa) 29 2.1.5.3 Môi trƣờng MS chitin (môi trƣờng lên men) 30 2.2 Các phƣơng pháp 30 2.2.1 Phƣơng pháp giữ giống 30 2.2.2 Phƣơng pháp hoạt hóa giống 30 2.2.3 Phƣơng pháp chuẩn bị chitin huyền phù [20] 31 2.2.4 Phƣơng pháp lên men chủng Penicillium oxalicum 20B 31 2.2.5 Xác định hàm lƣợng N-acetyl glucosamin 31 2.2.6 Phƣơng pháp xác định hoạt độ chitinase [33] 32 2.2.7 Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy lên sinh tổng hợp chitinase chủng Penicillium oxalicum 20B 33 2.2.7.1 Ảnh hƣởng tốc độ lắc tới hoạt tính chitinase 33 2.2.7.2 Ảnh hƣởng nguồn cacbon tới hoạt tính chitinase 33 2.2.7.3 Ảnh hƣởng hàm lƣợng chitin tới hoạt tính chitinase 33 Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn 2.2.7.4 Ảnh hƣởng nguồn nitơ tới hoạt tính chitinase 33 2.2.7.5 Ảnh hƣởng hàm lƣợng cao nấm men tới hoạt tính chitinase 34 2.2.7.6 Ảnh hƣởng thời gian lên men tới hoạt tính chitinase 34 2.2.8 Phƣơng pháp xác định sinh khối 34 2.2.9 Phƣơng pháp xác định hoạt tính hexosaminidase [45] 34 2.2.10 Xác định hoạt độ endochitinase [55] 35 2.2.11 Phƣơng pháp TLC xác định phổ sản phẩm trình thủy phân 35 2.2.12 Phƣơng pháp phân lập bào tử đơn [19] 35 2.2.12.1 Nguyên lý phƣơng pháp 35 2.2.12.2 Các bƣớc thực 35 2.2.12.3 Chú ý 36 PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Kết tuyển chọn chủng 37 3.2 Kết tuyển chọn bào tử đơn có khả sinh tổng hợp chitinase có hoạt tính cao 39 3.3 Ảnh hƣởng nồng độ bào tử thời gian hoạt hóa 41 3.4 Ảnh hƣởng dạng nguyên liệu chitin tới hoạt tính chitinase 42 3.5 Ảnh hƣởng nồng độ chitin thô tới hoạt tính chitinase 43 3.7 Ảnh hƣởng nguồn nito 46 3.8 Ảnh hƣởng hàm lƣợng cao nấm men 47 3.9.Kết động thái sinh trƣởng Penicillium oxalicum 20B 48 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 4.1 Kết luận 52 4.2 Kiến nghị 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC 60 Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT KÝ HIỆU TÊN ĐẦY ĐỦ GlcNAc, NAG N-acetyl-D-glucosamin (GlcNAc)2 Diacetyl chitobiose (GlcNAc)3 Chitooligomer VP1 Vibrio parahemolyticus DMAc N,N-dimetyl axetamindo LD50 Lethal Dose TP Thủy phân CMN Cao nấm men DNS 3,5-dinitrosalicylic axit OD Mật độ quang Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Tỷ lệ chitin loài khác 23 Bảng 3.1 Hoạt tính chitinase chủng tuyển chọn 37 Bảng 3.2 Điều kiện lên men chủng Penicillium oxalicum 20B trước sau khảo sát51 Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cơ chế hoạt động chitinase 13 Hình 1.2.Công thức cấu tạo chitin 24 Hình 1.3 Các kiểu xếp mạch đại phân tử chitin 25 Hình 1.4 Cấu tạo N-Acetyl-D- glucosamin 26 Hình 2.1 Bào tử nấm mốc Penicillium oxalicum nảy mầm…………………………36 Hình 2.2 Các bào tử đơn phát triển thành khuẩn lạc riêng rẽ 36 Hình 3.1 Sắc ký đồ sản phẩm thủy phân chủng nghiên cứu 38 Hình 3.2 Hoạt tính NAHase chủng nghiên cứu 39 Hình 3.3 Hoạt độ chitinase khả thủy phân chitinase từ bào tử đơnTB1-TB8 39 Hình 3.4 Hoạt độ chitinase khả thủy phân bào tử đơnTB1, TB2, TB6 40 Hình 3.5 Ảnh hưởng nồng độ cấp giống tới hoạt tính chitinase khă thủy phân 24h 41 Hình 3.6 Ảnh hưởng dạng chitin tới hoạt tính khả thủy phân chitinase 43 Hình 3.7 Ảnh hưởng nồng độ chitin thô tới hoạt tính khả thủy phân chitinase 44 Hình 3.8 Ảnh hưởng tốc độ lắc tới hoạt tính khả thủy phân chitinase 45 Hình 3.9 Ảnh hưởng nguồn nito tới hoạt tính chitinase khả thủy phân chitinase 46 Hình 3.10 Ảnh hưởng hàm lượng CNM tới hoạt tính chitinase khả thủy phân chitinase 48 Hình 3.11 Sự thay đổi pH dịch lên men 49 Hình 3.12 Sự thay đổi hoạt tính chittinase, hoạt độ endochittinase, hoạt độ Nacetyl-D-hexominidase 50 Hình 3.13 Sắc ký đồ sản phẩm TP 24h chitinase thời điểm lấy mẫu 50 Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn MỞ ĐẦU Cùng với phát triển toàn xã hội, sống ngƣời ngày đƣợc cải thiện, ngƣời có điều kiện để quan tâm chăm sóc sức khỏe Môi trƣờng bị ô nhiễm, sản phẩm thực phẩm không hợp vệ sinh hay tồn dƣ hóa chất độc hại lan tràn khắp nơi thị trƣờng Chính yếu tố khách quan nhƣ khiên sức khỏe bị suy yếu, số bệnh khớp N-Acetyl-D-glucosamin (NAG) đƣờng đơn, tồn nhiều sụn khớp, chất nhầy, não, thành phần liên kết tế bào với tế bào, truyền đạt thông tin từ tế bào sang tế bào khác N-Acetyl-D-glucosamin thành phần cấu tạo nên axit hyaluronic thúc trình sinh sản chodroitin - thành phần cấu tạo nên sụn khớp gối, tay, bả vai, xƣơng chậu… NAG đƣợc sử dụng nhiều y học để phục hồi, điều trị tận gốc nguyên bệnh khớp Ngoài ứng dụng điều trị bệnh viêm khớp, NAG đƣợc ứng dụng để chữa bệnh viêm ruột, ứng dụng mỹ phẩm làm đẹp da, chất để sản xuất axit sialic (ứng dụng chữa bệnh cúm) đƣợc chứng minh có khả chữa nhiều bệnh (ung thƣ di căn, phản ứng miễn dịch…) N-axetyl-D-glucosamin (NAG) hay gọi 2-acetamino-2-deoxy-β-Dglucose, đơn phân cấu tạo nên chitin có nhiều vỏ tôm, cua, mực… Mặt khác, giáp xác nguồn nguyên liệu thủy sản dồi chiếm 1/3 tổng sản lƣợng nguyên liệu thủy sản Việt Nam Trong công nghiệp chế biến thủy sản xuất khẩu, tỷ lệ cấu mặt hàng đông lạnh giáp xác chiếm từ 70 – 80% công suất chế biến Hàng năm nhà máy chế biến thải bỏ lƣợng phế liệu giáp xác lớn khoảng 70.000tấn/năm Nguồn phế liệu nguyên liệu quan trọng cho công nghiệp sản xuất chitin, chitosan, glucosamin sản phẩm khác Do việc nghiên cứu phát triển sản xuất sản phẩm từ vỏ tôm cần thiết nhằm nâng cao giá trị sử dụng phế liệu làm môi trƣờng NAG sản xuất từ chitin nhiều phƣơng pháp khác nhƣ: hóa học sinh học Phƣơng pháp hóa học đƣợc thực thủy phân axit mạnh Do 10 Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn 160rpm sau giảm dần tốc độ lắc cao Kết hình 3.8 cho thấy tƣơng ứng khả thủy phân hoạt độ chitinase, hoạt tính cao, khả thủy phân tốt ngƣợc lại Tốc độ lắc 160rpm đƣợc chọn để tiến hành thí nghiệm 3.7 Ảnh hƣởng nguồn nito Tiến hành thí nghiệm với nguồn nito khác là: NaNO3, Urea, cao nấm men, CNM+NaNO3, CNM + Urea Kết thu đƣợc thể hình3.9: Từ hình 3.11 kết cho ta thấy với nguồn nito cao nấm men hoạt độ chitinase sinh cao đạt 0,073U/ml Ngƣợc lại nguồn nitơ vô nhƣ NaNO3 hay urea cho hoạt độ chitinase thấp tƣơng ứng 0,022U/ml 0,023U/ml Tuy nhiên nguồn nito vô NaNO3 kết hợp với nguồn nito cao nấm men hoạt độ chitinase sinh tƣơng đối cao đạt 0,067U/ml chứng tỏ cao nấm men có ảnh hƣởng tốt tới sinh tổng hợp chitinase chủng Penicillium oxalicum 20B A Hình 3.9 Ảnh hưởng nguồn nito tới hoạt tính chitinase khả thủy phân chitinase A.Hoạt tính chitinase;B Lƣợng đƣờng khử tạo thành sau 24 thủy phân chitinase Theo nghiên cứu P Binod cộng (2006) chủng P aculeatum (trong điều kiện lên men rắn) cho hoạt tính chitinase cao, hoạt tính endochitinase tăng gấp bổ sung NaNO3 [49] Theo Nampoothiri cộng (2003), bổ 46 B Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn sung 2% (w/w) cao nấm men vào môi trƣờng nuôi cấy bán rắn khả tạo chitinase Trichoderma harzianum tăng đáng kể Suresh Chandrasekharan (1999) ghi nhận gia tăng sản lƣợng enzyme môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma harzianum đƣợc cung cấp muối amonium photphat cao nấm men [32] N N Nawani B P Kapadnis trình nghiên cứu tối ƣu hóa phƣơng pháp thiết kế thí nghiệm dựa toán thống kê cho thấy Streptomyces sp NK 1057 cung cấp nguồn nito từ hai nguồn cao nấm men (NH4)2SO4 sản lƣợng chitinase tăng từ 4- 10% so với dùng riêng lẻ nguồn [42] Từ kết hình 3.9ta thấy sử dụng nguồn nito CNM cho enzyme có khả thủy phân cao Sử dụng kết hợp nguồn nito CNM NaNO3 cho enzyme thủy phân tốt Tuy nhiên quan sát suốt trình thủy phân, enzyme sinh tổng hợp đƣợc sử dụng nguồn nito CNM có tốc độ thủy phân nhanh nhiều so với sử dụng kết hợp CNM với NaNO3 Từ kết chọn nguồn nito CNM tiến hành thí nghiệm 3.8 Ảnh hƣởng hàm lƣợng cao nấm men Tất thành phần quan trọng tế bào chứa Nito (Protein, axit nucleic, enzyme ) Nito chiếm 10- 15% trọng lƣợng khô tế bào Nito tham gia cấu tạo protit nhƣ : Protein, axit amin, glycoprotein, lipitprotein, peptidoglucan Việc chọn nguồn nito cần thiết để đảm bảo đƣợc hiệu suất cao có lợi mặt kinh tế lên men Các loại hợp chất nito mà nấm sợi đồng hóa đƣợc thƣờng cao nấm men, cao malt, cao ngô, nguồn nito vô nhƣ NH4NO3, (NH4)2SO4, NaNO3…Trong nguồn cao nấm men, pepton thành phần mà loài nấm tiếp hợp, nấm túi ƣa sử dụng Mặt khác, nồng độ nito khác có ảnh hƣởng rõ rệt lên sinh trƣởng sinh tổng hợp enzyme chủng Tiến hành thí nghiệm hàm lƣợng cao nấm men khác là: 0%; 0,5%;1%;1,5% Thu dịch chiết enzyme thô, xác định hoạt tính enzyme, khảo sát khả thủy phân thời điểm 72h, 96h, 120h, 144h lên men Kết đƣợc thể đồ thị hình 3.10: 47 Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn A B Hình 3.10 Ảnh hưởng hàm lượng CNM tới hoạt tính chitinase khả thủy phân chitinase A.Hoạt tính chitinase;B Lƣợng đƣờng khử tạo thành sau 24 thủy phân chitinase Từ hình, ta thấy tăng hàm lƣợng cao nấm men từ 0% đến 1%, hoạt tính chitinase tăng đáng kể Chủng Penicillium oxalicum 20B sinh tổng hợp chitinase có hoạt độ cao hàm lƣợng cao nấm men 1% đạt 0,062U/ml, tăng xấp xỉ gấp 2,1lần so với hàm lƣợng cao nấm men 0,5% hoạt độ chitinase 0,030U/ml Khi tăng hàm lƣợng cao nấm men lên 1,5% hoạt độ giảm nhanh Tƣơng ứng với hoạt tính, khả thủy phân mạnh hoạt tính cao Do chọn hàm lƣợng CNM 1% 3.8.Kết động thái sinh trƣởng Penicillium oxalicum 20B Sử dụng điều kiện tối ƣu trƣớc đó, lên men Penicillium oxalicum 20B sinh tổng hợp chitinase Xác định lƣợng sinh khối khô, hoạt độ chitinase,hoạt độ endochittinase, hoạt độ N-acetyl-D-hexominidase, pH dịch lên men thời điểm lấy mẫu 72h, 96h, 108h, 120h, 132h, 144h 48 8 0 Sinh khối khô (g/L) pH Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn Thời gian lên men (ngày) Hình 3.11 Sự thay đổi pH dịch lên men pH môi trƣờng có ảnh hƣởng đến phát triển khả sinh tổng hợp enzyme vi sinh vật Các ion H+ OH- ion hoạt động mạnh nhất, nên biến đổi dù nhỏ nồng độ chúng môi trƣờng gây nên biến đổi rõ rệt khả sinh trƣởng phát triển sinh vật Kết hình 3.11 cho thấy pH ngày dịch lên men 6,67 Sau pH giảm dần ổn định khoảng pH 5,5 Kết phù hợp với quan điểm Ingold (1967), cho pH thích hợp cho nấm sợi sinh enzyme tối ƣu 4-6 Chủng A protuberus sinh chitinase cao pH =5,5 [9], chủng Penicillium citrinum sinh chitinase cao pH=4,5 [11], chủng Penicillium sp LYG 0704 có pH tối ƣu pH= [20] Sinh khối tăng nhanh chóng đạt cực đại sau khoảng 50h lên men sau giảm theo thời gian Sự giảm sinh khối đƣợc lý giải trình tự phân P oxalicum chitinase Thành phần cấu tạo nên thành tế bào P oxalicum chitin, sau 8h lên men, hàm lƣợng đƣờng môi trƣờng cạn kiệt, môi trƣờng có chất cảm ứng chitin thô, chitinase đƣợc sinh tổng hợp để thủy phân chitin, đồng thời trình tự phân xảy khiến cho pellet vỡ, hàm lƣợng sinh khối giảm Theo J Rodri´guez (1993), chitinase, glucanase đóng vai trò quan trọng trình tự phân P oxalicum 49 0,08 14 0,07 12 0,06 10 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 Hoạt độ endochitinase &NAHase (U/ml) Hoạt độ chitinase (U/ml) Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn Thời gian lên men (ngày) Hình 3.12 Sự thay đổi hoạt tính chittinase, hoạt độ endochittinase, hoạt độ N-acetyl-D-hexominidase Từ kết hình 3.12 cho thấy hoạt tính chittinase cao vào thời điểm 120h Nó tƣơng ứng với kết thủy phân, hoạt độ N-acetyl-Dhexominidase endochitinase Nó cho thấy hoạt độ N-acetyl-Dhexominidase endochitinase cao khả thủy phân tăng theo tƣơng ứng Hình 3.13 Sắc ký đồ sản phẩm TP 24h chitinase thời điểm lấy mẫu (1) NAG chuẩn; (2)Đối chứng; (3)(4)(5)(6)(7)(8) Dịch thủy phân 24h thời điểm lấy mẫu enzyme thô 72, 96, 108, 120, 132, 144 (h) 50 Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn Kết sắc ký đồ lần khẳng định sản phẩm thủy phân chitin chitinase sinh tổng hợp đƣợc từ P Oxalicumchủ yếu NAG thể vệt màu có chiều cao tƣơng ứng với NAG chuẩn hình 3.13 Các vệt màu có độ đậm nhạt khác thể nồng độ NAG dịch thủy phân Các băng 4, 5, 6, 7, vệt màu có độ đậm tƣơng đƣơng trùng khớp với kết hàm lƣợng NAG mẫu xấp xỉ hình 3.13 Vệt màu băng số đậm chứng tỏ khả thủy phân chitinase 120h lên men tốt Kết cho thấy sinh khối phát triển nhanh dừng vào ngày thứ Sau sinh khối cân lƣợng đƣờng môi trƣờng hết nên nấm mốc bắt đầu tiết enzyme để thủy phân chất chitin để làm nguồng cacbon Do enzyme bắt đầu tiết từ ngày thứ cao vào ngày thứ tƣơng ứng với hình 3.12 Từ kết kết luận đƣợcthời gian thích hợp để thu enzyme chitinase 120h hoạt độ chitinase đạt cực đại Sau khảo sát yếu tố ảnh hƣởng tới trình sinh tổng hợp chitinase chủng Penicillium oxalicum 20B, tiến hành lên men điều kiện trƣớc sau khảo sát bảng 3.2 Bảng 3.2 Điều kiện lên men chủng Penicillium oxalicum 20B trƣớc sau khảo sát Các yếu tố ảnh hƣởng Chitin Trƣớc khảo sát Sau khảo sát Chitin huyền phù 6% Chitin thô 0,4% (0,4% chitin thô) Cao nấm men 0,5% 1% MgSO4 0,14% 0,14% NaCl 0,1% 0,1% KCl 0,1% 0,1% CaCl2 0,01% 0,01% pH 5 Thời gian lên men 144h 120h Tốc độ lắc 150rpm 160rpm Hoạt độ chitinase (U/ml) 0,023 ± 0,0009 0,0 74± 0,0077 Kết cho ta thấy hoạt độ chitinase sau tối ƣu tăng xấp xỉ 3,2 lần từ 0,023 đến 0,074U/ml 51 Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Tuyển chọn chủng Penicillium oxalicum 20B có hoạt tính chitinase NAHase cao phù hợp cho ứng dụng thu nhận N-acetyl-D-glucosamine - Nguồn cacbon nito quan cho sinh tổng hợp chitinase chủng Penicillium oxalicum 20B Việc thay chitin keo chitin thô chƣa xử lý không làm giảm hoạt tính chitinase khả thủy phân chitinase đáng kể Nguồn Nito cao nấm men cho hoạt tính chitinase cao Tốc độ lắc có ảnh hƣởng lớn đến hoạt tính chitinase 160 rpm cho hoạt tính chitinase cao - Tại điều kiện lên men môi trƣờng MS chitin với yếu tố pH 50,4% chitin thô, 1% cao nấm men,tốc độ lắc 160rpm, thời gian lên men 120h, hoạt tính chitinase thu đƣợc 0,074 U/ml tăng 3,3 lần so với trƣớc tối ƣu 4.2 Kiến nghị - Dùng qui hoạch thực nghiệm tối ƣu sinh tổng hợp chitinase từ chủng P oxalicum 20B - Nghiên cứu ảnh hƣởng tỉ lệ NAHase/endochitinase đến hiệu thủy phân chitin thành GlcNAc 52 Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn TÀI LIỆU THAM KHẢO Bùi Xuân Đồng and Nguyễn Huy Văn, Vi nấm dùng công nghệ sinh học 2000, Hà Nội: NXB Khoa học Kỹ thuật 154-160; 184-198 Đặng Trung Thành, Bước đầu nghiên cứu thu nhận chitinase khoai lang (Ipomoea batatas) Khánh Hòa Tạp chí Khoa học-Công nghệ Thủy sản - số 03/2008, 2008 Diễn đàn Webtretho [cited 2013 28/11]; Available from: http://www.webtretho.com/forum/register.php Đinh Minh Hiệp, Hệ chitinase Trichoderma vai trò kiểm soát sinh học 2007, Báo cáo chuyên đề nghiên cứu sinh: Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh Đinh Minh Hiệp, Nghiên cứu enzyme chitinase β-glucanase từ vi nấm Trichoderma spp khả kiểm soát sinh học số nấm gây bệnh thực vật 2010, Viện Sinh học nhiệt đới, TP Hồ Chí Minh Dƣơng Thị Ngọc Quỳnh, Đồng Thị Hƣơng Trầm, and Lê Thanh Hà, Nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin keo thu N- axetyl- D- glucosamine chitinase thô từ Penicillium oxalicum 20B 2013, Hội nghị khoa học công nghệ sinh học toàn quốc 2013.: Viện công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội, Lê Thị Huệ, Khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme chitinase số chủng NS thuộc giống Aspergillus, Trichoderma ứng dụng 2010, Trƣờng ĐHSP Tp HCM Nguyễn Quang Nhân, Nghiên cứu thu nhận, tinh xác định tính chất chitinase từ mủ cao su Hevea brasiliensis 2011, Ngành sinh học thực phẩm: trƣờng đại học Cần Thơ Nguyễn Thị Hà, Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy chủng Aspergillus protuberus sinh tổng hợp enzyme chitinase phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ, in Tạp chí khoa học 2012 : 22b 26- 35 Trường Đại Học Cần Thơ 2012 53 Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn 10 Nguyễn Thị Hà, Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy chủng nấm sợi Penicillium oxalicum sinh tổng hợp enzyme chitinase phân lập từ đất Hội nghị khoa học toàn quốc sinh thái tài nguyên sinh vật lần thứ 5: p 10011007 11 Nguyễn Thị Hà, Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy chủng Penicillium citrinum sinh tổng hợp enzyme chitinase phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ, in Tạp chí khoa học : 27(2013): 32- 39 Trường Đại Học Cần Thơ 2012 12 Siêu thực phẩm chức Vuishopping.com 2009 [cited 2014 28/2/]; Available from: http://vuishopping.com/n-acetyl-glucosamine-1000mg- giam-dau-khop-gap-3-lan-id947.html 13 Tô Duy Khƣơng, Khảo sát sinh tổng hợp chitinase Trichoderma spp khả đối kháng với số nấm gây bệnh thực vật 2004, Trƣờng Đại Học Khoa học tự nhiên TP Hồ Chí Minh 14 Võ Thị Bích Viên, Khảo sát đặc điểm sinh học số chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus Penicillium từ rừng ngập mặn cần TP Hồ Chí Minh 2009: Trƣờng đại học sƣ phạm TP Hồ Chí Minh 15 A Shubakov P.S kucheryavykh, Chitinolytic Activity of Filamentous Fungi Applied Biochemistry and Microbiology, 2004 Vol 40(No 5): p 445-447 16 Anil Kumar Singh, Optimization of culture conditions for thermostable chitinase production by Paenibacillus sp D1 2010 Vol 4(21): p 22912298 17 Berahim, Z., Production Of Chitinase By A Locally Isolated Fungus 2007, Universiti Putra Malaysia Institutional Repository 18 Binod, P., et al., Production and purification of extracellular chitinases from Penicillium aculeatum NRRL 2129 under solid-state fermentation Enzyme and Microbial Technology, 2005 36(7): p 880-887 19 Choi, Y.W., Hyde, K.D and Ho, W.H , Single spore isolation of fungi Fungal Diversity, 1999 3: p 29-38 54 Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn 20 Chung K-C Lee YG, W.S., Lee JC, and Bae H-J, , Purification and properties of a chitinase from Penicillium sp LYG 0704 Protein Expression and Purification, 2009 65(2): p 244-250 21 DaizoKoga, Application of Chitinase in Agriculture Journal of Metals, Materials and Minerals., 2005 Vol 15(1): p 33-36 22 G M Escott, H., V M., & Adams, D.J,, Inducible chitinolytic system of Asppergillus fumigatus Microbiology Vol 144 1998 1575 23 I A Stoyachenko, V., V P., & Davankov, V A,, Chitinases of Streptoomyces kurssanovii: purification and some properties Carbohydratte polymers, 1994 24(1): p 47-54 24 I Kawachi, F., T., Ujita, M., Ishii, Y., Yamagishi, K., Sato, H., et al.,, Purification and properties of extracellular chitinase from the parasitic fungus Isaria japonica Journal of bioscience and bioengineering, 2001 92(6): p 544-549 25 J Rodriguez, C.P., J L., & Pérez Leblic, M I.,, Purification and properties of a chitinase from Penicillium oxalicum autolystates Letters in applied microbiology, 1995 20(1): p 46-49 26 Jennifer L.Guthrie, S.K.v.A.J.C., An improved method for detection anh quantification of chitinase activities Canadian Journal of Microbiology, 2005 Vol.51(Iss 6): p 491 -495 27 K Gkargkas, M., D., Nedev, G., Topakas, E., Christakopoulos, P., Kekos, D., et al., , Studies on a N-acetyl-[beta]-d-glucosaminidase produced by Fusarium oxysporum F3 grown in solid-state fermentation Process Biochemistry, 2004 39(11): p 1599-1605 28 K M Ghanem, A.-G., S M., & Al-Makishah,N H,, Statistical optimization of cultural conditions for chitinase production from fish scales waste by Aspergillus terreus African Journal of Biotechnology, 2010 9(32): p 51355146 55 Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn 29 K M Ghanem, A.F., F.A., & Farsi, R M.,, Statiscal optimization of cultural condition for chitinase production from shellfish waste by Alternaria alternata African Journal of Microbiology Research, 2011 5(13): p 16491659 30 Khanh Dang Vu., e.a., Induced production of chitinase to enhance entomotoxicity of Bacillus thuringiensis employing starch industry wastewater as a substrate Bioresource Technology, 2009 100 (2009): p 5260–5269 31 Kim S.S., K.S.H.v.L.Y.M., Preparation, Characterization, and Properties of β - chitin and N-acetylated β - chitin J.Polymer Sci.:Part B: Polymer Physics, 1996 Vol 34: p 2367-2374 32 Lalke-Porczyk M Swiontek-Brzezinska, E., & Donderski, W ,, Chitinolytic acticity of bacteria and fungi isolated from shirmp exoskeletons Oceanological and Hydrobiological Studies, 2007 3(36): p 101-111 33 Lee, Y.-S., et al., Cloning, purification, and characterization of chitinase from Bacillus sp DAU101 Bioresource Technology, 2007 98: p 27342741 34 Lee, Y.G., et al., Purification and properties of a chitinase from Penicillium sp LYG 0704 Protein Expression and Purification, 2009 65(2): p 244-250 35 M Fenice, D.G., R., Raetz, E., Leuba, J L., & Federici, F,, Repeated-batch and continuous production of chitinolytic enzymes by Penicillium janthinellum immobilised on chemically-modifies macroporous cellulose Journal of biotechnology, 1998 62(2): p 119-131 36 M H El-Katany, G., M., Robra, K H., Elnaghy, M A., & Gubitz, G M.,, Characterization of a chitinase and an endo-b-1, 3-glucanase from Trichoderma harzianum Rifai T24 involved in control of the phytopathogen Sclerotium rolfsii Applied microbiology and biotechnology, 2001 56(1): p 137-143 56 Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn 37 M Pedraza-Reyes, L.-R., E.,, Purification and some properties of two forms of chitinase from myceliial cells of Mucor rouxii Journal of general microbiology, 1989 135(1): p 211 38 M Takahashi, T., T., & Suzuki, T.,, Purifiication and some properties of chitinase produced by Vibrio sp Journal of fermentation and bioengineering, 1993 75(6): p 457-459 39 M.A Abdel-Naby, E.-S., N M A., & Sherrief, A A.,, Purification and some properties of chitinase from Aspergillus carneus Applied biochemistry and biotechnology, 1992 37(2): p 141-154 40 Matsumoto, K.S., Fungal chitinases Research Signpost, 2006( San Rafael Atlixco No 186.) 41 N Dahiya, T., R., & Hoondal, G S., , Biotechnologicanl aspects of chitinolytic enzymes: a review Applied microbiology and biotechnology 2006 71(6): p 773-782 42 N N Nawani, B.P.K., Optimization of chitinase production using statistics based experimental designs Process Biochemistry 40, 2005: p 651-660 43 N Rattanakit, P., A., Yano, S., Wakayama, M., & Tachiki, T,, Utilization of shirmp shellfish waste as a substrate for solid-state cultivation of Aspergillus sp S1-13: Evaluation of a culture based on chitinase formation which is necessary for chitin-assimilation Journal of bioscience and bioengineering, 2002 93(6): p 550-556 44 N Rattanakit, Y., S., Plikomol, A., Wakayama, M., & Tachiki, T.,, Purification of Aspergillus sp S1-13 chitinases and their role in sacchaification of chitin in mash of solid-state culture with shellfish waste Journal of bioscience and bioengineering, 2007 103(6): p 535-541 45 Nguyen, H.A., et al., Heterologous Expression and Characterization of an N-Acetyl-b-D-hexosaminidase from Lactococcus lactis ssp lactis journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012 60: p 3275-3281 57 Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn 46 P Binod, P., T., Nagy, V., Sandhya, C., Szakacs, G., Pocsi, I., et al.,, Production and purification of extracellular chitinase from Penicillium aculeatum NRRL 2129 under solid-state fermentation Enzyme and microbital technology, 2005 36(7): p 880-887 47 P Patidar, A., D., Banerjee, T., & Patil, S , , Optimistion of process parameters for chitinase production by soil isolates of Pencillium chrysogenum under solid substrate fermentation Process Biochemistry, 2005 40(9): p 2962-2967 48 P.Pochanavanich W.Suntornsuk, Fungal chitosan production and its characterization Letters in Applied Microbiology, 2002 35(17-21) 49 Parameswaran Binod, C.S., Pradeep Suma, George Szakacs, Ashok Pandey,, Fungal biosynthesis of endochitinase and chitobiase in soild state fermentation and thei application for the production of N-acetyl-Dglucosamine from colloidal chitin Bioresounrce Technology, 2006 98(2007): p 2742-2748 50 Rodriguez, J., J.L Copa-Patino, and M.I Pérez-Leblic, Purification and properties of a chitinase from Penicillium oxalicum autolysates Letters in Applied Microbiology, 1995 20(1): p 46-49 51 Roushan Islam, B.D., Diversity of chitinases and their industrial potential International Journal of Applied Research, 2015 1(4): p 55-60 52 S L Wang, H., J R.,, Microbial reclamation of shellfish wastes for the production of chitinases Enzyme and microbial technology, 2001 28(4-5): p 376-382 53 Y S Lee, p., I H., Yoo, J S., Chung, S Y., Lee, Y C., Cho,Y S., et al.,, Cloning, purification, and characterization of chitinase from Bacillus sp DAU101 Bioresource technology, 2007 98(14): p 2734-2741 54 Y Tao, L., Z., Xie, J., Jin, H., Ran, H., Tao, K., et al.,, Indentification of a chitinase producing bacterium C4 and histopathologic study on locusts Pest management science, 2005 61(2): p 159-165 58 Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn 55 Yabuki, M., et al., Purification and characterization of chitinase and chitobiase produced by Aeromonas hydrophila subsp anaerogenes A52 The Journal of General and Applied Microbiology, 1986 32: p 25-38 56 Yoyi Matsumoto, G.S.-C., Sergio Revah, Keiko Shirai, Production of β-Nacetylhexosaminidase of Verticillium lecanii by solid state and submerged fermentations utilizing shrimp waste silage as substrate and inducer Process Biochemistry, 2004(39): p 665-671 59 Luận văn tốt nghiệpĐinh Văn Bôn PHỤ LỤC Xây dựng đƣờng chuẩn N-acetyl-D-glucosamin  Tỷ lệ DNS : mẫu = 2:1 1,8 y = 1,959x - 0,149 R² = 0,996 1,6 1,4 OD540 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 Nồng độ NAG (mg/ml) y = 1,870x - 0,094 R² = 0,999 2,0 1,8 1,6 OD 540 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,1 Nồng độ NAG (mg/ml) Hình PL1: Phƣơng trình đƣờng chuẩn N-acetyl-D-glucosamin 60 ... đoan nội dung luận văn với đề tài: Nghiên cứu tuyển chọn xác định điều kiện nuôi cấy chủng sinhchitinase cho thu nhận N-acetyl-D-glucosamin” công trình nghiên cứu sáng tạo thực dƣới hƣớng dẫn PGS... tạo điều kiện tốt trình lên men Vì đặt vấn đề tiến hành đề tài: Nghiên cứu tuyển chọn xác định điềukiện nuôi cấy chủng sinh chitinasecho thu nhận N-acetyl-D-glucosamin” Mục tiêu đề tài: - Lựa chọn. .. chitinase cao từ chủng giống thoái hóa - Tối ƣu điều kiện sinh tổng hợp chitinase thu nhận N-acetyl-D-glucosamin Nhiệm vụ đề tài: - Tuyển chọn chủng sinh chitinase ứng dụng cho thu nhận N-acetyl-D-