Nghiên cứu thu nhận n acetyl d glucosamin từ dịch thủy phân chitin bằng chitinase

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - HOÀNG NỮ LỆ QUYÊN NGHIÊN CỨU THU NHẬN N-ACETYL-D-GLUCOSAMINE TỪ DỊCH THỦY PHÂN CHITIN BẰNG CHITINASE Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS LÊ THANH HÀ Hà Nội – Năm 2015 i MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT V DANH MỤC BẢNG VI DANH MỤC HÌNH .VII LỜI CAM ĐOAN VIII LỜI CẢM ƠN IX MỞ ĐẦU PHẦN I: TỔNG QUAN 1.1 Chitin – nguyên liệu sản xuất GlcNAc 1.1.1 Tổng quan chitin 1.1.2 Tính chất chitin 1.1.3 Ứng dụng chitin 1.2 Chitinase chế xúc tác thủy phân chitin 1.2.1 Giới thiệu chitinase 1.2.2 Phân loại chitinase 1.2.3 Cơ chế thủy phân chitin chitinase 1.3 Penicillium oxalicum 1.3.1 Phân loại 1.3.2 Đặc điểm hình thái sinh lý 1.3.3 Hệ chitinase Penicillium oxalicum tổng hợp .10 1.4 Tổng quan N-acetyl-D-glucosamine 10 1.4.1 Cấu tạocủa GlcNAc 11 1.4.2 Tính chấtcủa GlcNAc .11 1.4.3 Ứng dụng N-Acetyl-D-Glucosamine .12 1.5 Tình hình nghiên cứu sản xuất GlcNAc chitinase 13 1.5.1 Tình hình nghiên cứu giới 13 1.5.2 Tình hình nghiên cứu nước 14 ii 1.6 Một số phương pháp nghiên cứu tinh GlcNAc 15 PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 16 2.1 Nguyên liệu 16 2.2 Môi trường 16 2.3 Hóa chất thiết bị 17 2.4 Phương pháp nghiên cứu 18 2.4.1 Phương pháp chuẩn bị chitin huyền phù 18 2.4.2 Phương pháp lên men chìm 18 2.4.3 Phương pháp siêu lọc .19 2.4.4 Phương pháp thủy phân chitin chế phẩm chitinase .20 2.4.5 Phương pháp kết tủa dung môi ethanol 21 2.4.6 Phương pháp kết tinh GlcNAc 21 2.4.7 Quy trình tinh GlcNAc 22 2.4.8 Các phương pháp phân tích 24 2.4.8.1 Xác định hoạt độ chitinase 24 2.4.8.2 Xác định hoạt độ N-β-acetylhexosaminidase 24 2.4.8.3 Xác định hoạt độ endochitinase 25 2.4.8.4 Phương pháp TLC xác định phổ sản phẩm trình thủy phân 25 2.4.8.5 Định lượng N-Acetylglucosamine phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 26 2.4.8.6 Phương pháp xác định độ tinh GlcNAc 26 PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Khảo sát thu nhận chế phẩm chitinase cô đặc từ chitinase thô Penicillium oxalicum 20B phương pháp siêu lọc 27 3.1.1 Hoạt độ, hiệu suất thu hồi chế phẩm enzymechitinase cô đặc 27 iii 3.1.2 Ảnh hưởng hoạttính endochitinase N-β-acetylhexosaminidase đến khả thủy phân chế phẩm chitinase cô đặc 28 3.1.2 Xác định sản phẩm thủy phân chế phẩm chitinase cô đặc lần 30 3.2 Thu nhận tinh GlcNAc .33 3.2.1 Ảnh hưởng nồng độ Ethanol đến khả kết tủa tạp chất 33 3.2.2 Khả kết tinh GlcNAc dịch thủy phân sau kết tủa tạp chất bẳng ethanol 35 3.2.3 Nghiên cứu khả loại muối cô đặc dịch thủy phân 37 3.2.4 Ảnh hưởng mức độ cô đặc đến trình tinh GlcNAc 40 3.2.5 Ảnh hưởng thời gian kết tủa cồn đến trình tinh GlcNAc 41 3.2.6 Quy trình thu hồi tinh GlcNAc qui mô phòng thí nghiệm .42 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 PHỤ LỤC .53 iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT KÝ HIỆU TÊN ĐẦY ĐỦ GlcNAc, NAG N-acetyl-D-glucosamin (GlcNAc)2 Diacetyl chitobiose (GlcNAc)3 Chitooligomer EtOH Ethanol LD50 Lethal Dose TP Thủy phân DNS 3,5-dinitrosalicylic axit OD Mật độ quang Et Enzyme thô E2 Enzyme cô đặc lần E3 Enzyme cô đặc lần E4 Enzyme cô đặc lần Eqm Enzyme qua màng NAHase β-N-axetylhexosanminidase v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Sản lượng, giá trị thương mại lượng tiêu thụ sản phẩm từ chitin Bảng 2.1 Thành phần hóa học vỏ tôm Mũ Ni (% CK) 16 Bảng 2.2 Thành phần dinh dưỡng môi trường sử dụng 16 Bảng 2.3 Hóa chất sử dụng 17 Bảng 2.3 Thiết bị sử dụng 17 Bảng 3.1 Hoạt độ chế phẩm chitinase 27 Bảng 3.2 Hoạt độ endochitinase NAHase mẫu chế phẩm chitinase 29 Bảng 3.3 Kết tinh sử dụng cồn kết tủa 36 Bảng 3.4 Hiệu suất thu hồi độ tinh sau loại muối 38 Bảng 3.5 Ảnh hưởng mức độ cô đặc 40 Bảng 3.6 Ảnh hưởng thời gian kết tủa cồn 41 Bảng 3.7 Hiệu suất thu hồi sau lọc dòng ngang 42 Bảng 3.8 Kết tinh sản phẩm .42 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc chitin Hình 1.2 Ba dạng cấu trúc chitin Hình 1.3 Cơ chế phân cắt chitin Hình 1.4 Chi Penicillium thành phần chổi (bộ máy mang bào tử trần) Hình 1.5 Công thức cấu tạo GlcNAc 11 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình tạo chế phẩm chitinase cô đặc 20 Hình 2.2 Sơ đồ quy trình tinh GlcNAc 23 Hình 3.1 Khả thủy phân chế phẩm chitinase 29 Hình 3.2 Sắc ký mỏng sản phẩm thủy phân chitin chế phẩm chitinase 31 Hình 3.3 Kết HPLC mẫu sản phẩm thủy phân 32 Hình 3.4 Lượng kết tủa 5ml dịch cô đặc nồng độ cồn 33 Hình 3.5 Kết sắc ký mẫu kết tủa cồn 34 Hình 3.6 Lượng đường khử thất thoát vào kết tủa 35 Hình 3.7 Ảnh hưởng nồng độ cồn đến lượng GlcNAc kết tinh thu 35 Hình 3.8 Kết săc ký TLC mẫu kết tinh 37 Hình 3.9 Kết sắc ký mẫu sau kết tinh 39 Hình 3.10 Kết sắc ký HPLC sản phẩm tinh 39 Hình 3.11 Kết phân tích HPLC mẫu sản phẩm tinh 43 Hình 3.12 Phân tích HPLC với mẫu GlcNAc nội chuẩn 44 Hình 3.13 Kết TLC sản phẩm GlcNAc sau tinh 44 vii LỜI CAM ĐOAN Tôi Hoàng Nữ Lệ Quyên xin cam đoan nội dung luận văn với đề tài: “Nghiên cứu thu nhận N-acetyl-D-glucosamin từ dịch thủy phân chitin chitinase” công trình nghiên cứu sáng tạo thực hướng dẫn PGS.TS Lê Thanh Hà Các số liệu, kết trình bày luận văn hoàn toàn trung thực chưa công bố công trình khoa học khác viii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, cố gắng nỗ lực thân, nhận ủng hộ, giúp đỡ tận tình thầy cô giáo, gia đình bạn bè Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Thanh Hà - Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội tận tình bảo suốt trình thực đồ án tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn tới thầy cô giáo thuộc Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội giảng dạy giúp đỡ suốt trình học tập thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn! Học viên Hoàng Nữ Lệ Quyên ix Luận văn Thạc sĩ khoa học Hoàng Nữ Lệ Quyên MỞ ĐẦU Việt Nam với điều kiện thuận lợi địa lý cho việc phát triển ngành nuôi trồng thủy hải sản, nên năm gần ngành thủy hải sản nước ta phát triển mạnh mẽ không ngừng xuất nhiều nước giới Trong sản phẩm tôm đông lạnh chiếm tỷ lệ lớn Sản phẩm xuất tôm chủ yếu thân thịt tôm bỏ vỏ, đầu Vì sản lượng tiêu thụ tôm ngày tăng đồng nghĩa với việc phụ phẩm kèm theo vỏ, đầu tôm,… (chính nguồn nguyên liệu chitin dồi dào) ngày tăng Hàng năm Việt Nam, tôm đông lạnh xuất khoảng 58.000 lượng phế thải khoảng 33.000 (chiếm khoảng 40% nguyên liệu) [1] Từ trước đến phần nhỏ nguồn phế liệu chủ yếu dùng làm thức ăn gia súc, phân bón, bỏ mà chưa tận dụng để sản xuất sản phẩm có giá trị cao Chitin poly-beta-1,4-N-Acetylglucosamine, polymer sinh học phổ biến quan trọng tự nhiên [45] Nó đứng thứ hai sau cellulose mặt số lượng Người ta ước tính tỉ lệ hình thành chitin hàng năm số lượng ổn định chitin vào khoảng 1010 đến 1011 [47] Chitin tìm thấy chủ yếu vỏ động vật giáp xác cua tôm, lớp biểu bì côn trùng thành tế bào nấm Chitin chiếm 20-58% trọng lượng khô động vật biển, bao gồm tôm, cua, mực sò Những năm gần nhà khoa học nhận rằng, sử dụng lượng chitin làm thức ăn gia súc hàng năm bỏ khối lượng lớn nguồn nguyên liệu có giá trị kinh tế cao Để tận dụng nguồn phế liệu nghiên cứu theo hướng tạo dẫn xuất từ chitin quan tâm N-Acetyl-Dglucosamine (GlcNAc) đơn phân cấu tạo nên chitin - hay gọi 2-acetamino2-deoxy-β-D-glucose tham gia thành phần cấu tạo nên glycoprotein, proteoglycan glycosaminoglycan – hợp chất có vai trò tái tạo mô liên kết ngăn chặn phản ứng viêm thể [53] GlcNAc có vị ngọt, áp Công Nghệ Sinh Học 2013 - 2015 Luận văn Thạc sĩ Hoàng Nữ Lệ Quyên 3.2.6 Quy trình thu hồi tinh GlcNAc qui mô phòng thí nghiệm Theo phương pháp thực trên, trình cô quay chân không loại nước sau thủy phân làm độ nhớt dịch cao lượng đường oligomer chất dư Do để loại protein chitin dư tiến hành lọc dòng ngang với kích thước màng MWCO 10 kDa Kết bảng 3.7 cho thấy việc lọc dòng ngang làm thất thoát 8% lượng GlcNAc Bảng 3.7 Hiệu suất thu hồi sau lọc dòng ngang Mẫu Thể tích (ml) NAG (mg/ml) NAG tổng (mg) Hiệu suất thu hồi (%) Thủy phân 2000 14.66 29313.6 100 Dịch qua màng 1700 15.95 27107.2 92.47 Sau kết tủa oligomer cồn nồng độ cuối 90% nghiên cứu trước Tiến hành kết tinh GlcNAc từ dung dịch thủy phân cô đặc 25 lần với bước qui trình (hình 2.2.) Kết thể bảng 3.8 Bảng 3.8 Kết tinh sản phẩm Thể tích (ml) Khối lượng (mg) Hiệu suất thu hồi (%) Độ tinh (%) Dịch thủy phân 160 100 Dịch cô quay 125 92.28 Dịch sau cô quay 58.31 14.29 65.55 Kết tinh lạnh sau cô đặc dịch thủy phân 300 4.55 Cặn sau kết tủa cồn 525.8 17.79 Kết tinh sau loại cồn lần 406 22.1 Dịch không kết tinh Công nghệ Sinh học 2.5 42 100 21.67 2013 – 2015 Luận văn Thạc sĩ Hoàng Nữ Lệ Quyên Hình 3.11 Kết phân tích HPLC mẫu sản phẩm tinh A Mẫu GlcNAc1; GlcNAc2, GlcNAc3 chuẩn; B Mẫu sản phẩm sau tinh C Mẫu kết tủa cồn; D Mẫu không kết tinh Sản phẩm kết tinh thu gần tinh khiết, có độ tinh 100% theo tính toán phương pháp DNS HPLC Kết HPLC cho thấy mẫu chứa chất khác GlcNAc Để khẳng định mẫu sản phẩm sản phẩm GlcNAc mong muốn, tiến hành phân tích mẫu sản phẩm kết tinh phân tích HPLC theo phương pháp nội chuẩn, nghĩa trộn lượng mẫu GlcNAc kết tinh thu với lượng mẫu GlcNAc chuẩn theo tỉ lệ 1:1, kết phân tích cho thấy mẫu GlcNAc kết tinh mẫu GlcNAc chuẩn trùng pic, khối lượng tăng lên, chứng tỏ mẫu kết tinh sản phẩm GlcNAc Kết thể hình 3.12 Công nghệ Sinh học 43 2013 – 2015 Luận văn Thạc sĩ Hoàng Nữ Lệ Quyên Hình 3.12 Phân tích HPLC với mẫu GlcNAc nội chuẩn a GlcNAc chuẩn; b Mẫu nội chuẩn Kết hình 3.12 cho thấy mẫu sản phẩm kết tinh trùng với pic GlcNAc chuẩn Điều chứng tỏ qui trình thu nhận tinh GlcNAc qui mô phòng thí nghiệm hiệu Tuy nhiên so với độ tinh sản phẩm tăng lên rõ rệt hiệu suất thu hồi giảm đáng kể 22.1%, nguyên nhân lượng lớn GlcNAc bị thất thoát vào kết tủa cồn lượng GlcNAc lại dịch không kết tinh chưa thu hồi Hình 3.13 Kết TLC sản phẩm GlcNAc sau tinh 0- GlcNAc chuẩn; 1-3 Các mẫu GlcNAc sau tinh Công nghệ Sinh học 44 2013 – 2015 Luận văn Thạc sĩ Hoàng Nữ Lệ Quyên Sản phẩm sau tinh tiến hành xác định phổ sản phẩm sắc ký siclicagel (TLC) Kết chạy sắc ký trình bày qua hình 3.13 Nhận thấy sản phẩm sau tinh có vạch trùng với vạch GlcNAc chuẩn mà vạch khác, chứng tỏ sản phẩm sau tinh GlcNAc Công nghệ Sinh học 45 2013 – 2015 Luận văn Thạc sĩ Hoàng Nữ Lệ Quyên PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Chế phẩm chitinase cô đặc 2, 3, lần (v/v) có hoạt tính chitinase tăng tương ứng 1.8 lần; 2.3 lần; 3.1 lần so với chế phẩm thô ban đầu Hiệu suất thu hồi tương ứng đạt 94.3%; 78%; 76.4% Tỉ lệ Hexosaminidase/Endochitinase chế phẩm enzyme cô đặc lần, enzyme qua màng 0.171; 0.007 có ảnh hưởng đến lượng đường khử tạo thành tương ứng 5.18 mg/ml; 0.76 mg/ml Sản phẩm thủy phân chế phẩm enzyme cô đặc lần chủ yếu GlcNAc theo kết phân tích TLC mà lẫn đường đôi, đường ba (Hình 3.2.) HPLC với độ tinh cao (Hình 3.3) Quá trình tinh lựa chọn nồng độ cồn cuối 90% để loại bỏ tạp chất thu GlcNAc tinh 100% theo phương pháp phân tích HPLC Qui trình tinh GlcNAc từ dịch thủy phân chitin chitinase qui mô phòng thí nghiệm có sử dụng phương pháp siêu lọc với màng lọc MWCO 10kDa, mức độ tinh GlcNAc thu đạt 100% theo phương pháp DNS HPLC 4.2 Kiến nghị - Nâng cao mức độ tinh hiệu suất thu hồi sản phẩm phương pháp: sắc ký lọc gel, lọc nano - Nghiên cứu thời gian kết tủa cồn để giảm lượng GlcNAc thất thoát vào kết tủa dịch không kết tinh Công nghệ Sinh học 46 2013 – 2015 Luận văn Thạc sĩ Hoàng Nữ Lệ Quyên TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Thủy, Lưu Thị Lệ and Trần Thị Tuyết, Nghiên cứu tận dụng chế phẩm nguyên liệu thủy sản (vỏ tôm, cua,…) để chiết rút chitin-chitosan sử dụng công nghiệp Báo cáo đề tài Phân Viện công nghiệp thực phẩm thành phố Hồ Chí Minh, 2004: p 11-16 Nhân, Nguyễn Quang, Nghiên cứu thu nhận, tinh xác định tính chất chitinase từ mủ cao su Hevea brasiliensis Ngành Công nghệ sinh học - Đại học Cần Thơ, 2011 DTN, Quỳnh, Trầm ĐTH, and Hà LT, Nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin keo thu N-acetyl-D-glucosamine chitinase thô từ Penicillium oxalicum 20B Tuyển tập báo cáo hội thảo công nghệ sinh học toàn quốc 2013, 2013b 1: p 508-512 Huong, Dang Thi, et al., Characterization of chitinase fractions obtained by ultrafiltration of culture broth Penicillium oxalicum 20B Journal of Biotechnology, 2015 13(2A): p 611 – 617 Đinh Minh Hiệp, Hệ chitinase Trichoderma vai trò kiểm soát sinh học Báo cáo chuyên đề nghiên cứu sinh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh, 2007 DTN, Quỳnh, et al., Ảnh hưởng yếu tố lên men đến sinh tổng hợp chitinase N-acetyl-D-glucosamine từ chủng Penicillium oxalicum20B Tạp chí Khoa học công nghệ thủy sản, 2013a Số đặc biệt: p 508-512 Thành, Đặng Trung, Bước đầu nghiên cứu thu nhận chitinase khoai lang (Impomoea batatas) Khánh Hòa Tạp chí Khoa học công nghệ thủy sản, 2008 Khương, Tô Duy, Khảo sát sinh tổng hợp chitinase Trichoderma spp khả đối kháng với số nấm gây bệnh thực vật Trường Đại học Khoa học tự nhiên TP Hồ Chí Minh, 2004 Hiệp, Đinh Minh, Nghiên cứu enzyme chitinase β-glucanase từ vi nấm Trichoderma spp khả kiểm soát sinh học số nấm gây bệnh thực vật Viện Sinh học Nhiệt đới TP Hồ Chí Minh, 2010 Công nghệ Sinh học 47 2013 – 2015 Luận văn Thạc sĩ Hoàng Nữ Lệ Quyên TIẾNG ANH 10 Fu, Xing, et al., An acidic, thermostable exochitinase with β - Nacetylglucosaminidase activity from Paenibacillus barengoltzii converting chitin to N-acetyl glucosamine Biotechnology for Biofuels, 2014 7: p 174 11 Dahiya N1, Tewari R, Hoondal GS,, Biotechnological aspects of chitinolytic enzymes: a review Appl Microbiol Biotechnol, 2006 71(6): p 773-82 12 R.H, Hackman, Studies on Chitin, Action of Mineral Acids on Chitin Australian Journal of Biological Sciences 1962 15(3): p 526-532 13 C.K.S Pillai, Willi Paul; and Chandra P Sharma;, Chitin and chitosan polymers: Chemistry, solubility and fiber formation Progress in Polymer Science., 2009 34: p 641-678 14 Abdulwadud Abdulkarim et al, Extraction and Characterisation of Chitin and Chitosan from Mussel Shell Civil and Environmental Research, 2013 3(2): p 108 - 114 15 Khoushab;, Feisal and Montarop Yamabhai;, Chitin Research Revisited Marine Drugs, 2010 8: p 1988-2012 16 MM, Black and Schwarz HM, The estimation of chitin and chitin nitrogen in crawfish waste and derived products Analyst, 1950 75: p 185-188 17 Khoushab, Feisal and Montarop Yamabhai, Chitin Research Revisited Marine Drugs, 2010 8: p 1988-2012 18 Inmaculada Aranaz and et al, Functional Characterization of Chitin and Chitosan Current Chemical Biology, 2009 3: p 203-230 19 Avelelas., Francisco Pires, Pilado add Value - valorisation of non-traditional marine resources, School of Tourism and Maritime Technology - Peniche Polytechnic Institute of Leiria - Portugal, 2013: p - 63 20 J, Adarsh K and Dr G Madhu, A Comparative Study on Metal Adsorption Properties of Different Forms of Chitosan International Journal of Innovative Research in Science, Engineering and Technolog, 2014 3(2): p 9609 - 9617 Công nghệ Sinh học 48 2013 – 2015 Luận văn Thạc sĩ Hoàng Nữ Lệ Quyên 21 Kasprzewska and Anna, Plant chitinase-Regulation and function 2003 8: p 809-824 22 Saboki Ebrahim, K.Usha, and Bhupinder Singh, Pathogenesis Related (PR) Proteins in Plant Defense Mechanism Science against microbial pathogens: communicating current research and technological advances in Agricultural and Food Biotechnology, 2011 23 Tomokaru Kawase, Akihiro Saito, Toshiya Sato, Ryo Kanai, Takeshi Fujii, and Kiyotaka Miyashita and Takeshi Watanabe Naoki Nikaido, Distribution and Phylogenetic Analysis of Family 19 Chitinase in Actinobacteria Applied and Environmental Microbiology, 2004 70: p 1135 24 Takeshi Watanabe, Ryo Kanai, Tomokaru Kawase, Toshiaki Tanabe, Masaru and Shohei Sakuda and Kiyotaka Miyashita Mitsutomi, Family 19 chitinases of Streptomyces species: characterization and distribution Microbiology 1999 145: p 3353-3363 25 Rifat Hamid, Minhaj A Khan, Mahboob Ahmad, Malik Mobeen Ahmad, and Javend Musarrat and Saleem Javed Malik Zainul Abdin, An update: Chitinase Journal of Pharmacy Bioallied Sciences, 2013 5(1): p 21-29 26 Jamialahmadi, K., et al., Enzymatic Production of N-acetylD-glucosamine from Chitin Using Crude Enzyme Preparation of Aeromonas sp PTCC1691 Biotechnology, 2011 10(3): p 292-297 27 Ohn, Tsuyoshi and et al, A Modular Family 19 Chitinase Found in the Prokaryotic Organism Streptomyces griseus HUT 6037 Journal of Bacteriology, 1996 178(17): p 5065-5070 28 J H Kuk, et al., Production of N-acetyl-β-D-glucosamine from chitin by Aeromonas sp GJ-18 crude enzyme Applied microbial and cell physiology, 2005: p 384-389 29 J, Rodiriguez, Copa - Patino JL, and Perez-Leblic MI, Purification and properties of a chitinase from Penicillium oxalicum autolysates Letters in Applied Microbiology, 1995 20(1): p 46-49 30 Levin RM, Krieger NN, and Winsler RJ, Glucosamine and Acetylglucosamine tolerance in man J Lab Clin Med, 1961 58: p 927-932 Công nghệ Sinh học 49 2013 – 2015 Luận văn Thạc sĩ Hoàng Nữ Lệ Quyên 31 Gooday, G., The Ecology of Chitin Degradation Microb Ecol, 1990: p 387–430 32 Spellman, et al, Carbohydrate Structures of Human Tissue Plasminogen Activator Expressed in Chinese Hamster Ovary Cells J Biol Chem, 1989: p 14100–14111 33 Wu A.M.W., et al, Roles of Mammalian Structural Units, Ligand Cluster and Polyvalency in the Abrus precatorius Agglutinin and Glycoprotein Recognition Process Mol Immunol, 2009: p 3427–3437 34 Xu, Q.L., J,, Use of N-Acetyl D-glucosamine in Treatment of Organ Lesion Related to Toxicosis of Drugs or Chemicals US Patent NO 6693176B2, 2006 35 Alvarez., Francisco J., The Effect of Chitin Size, Shape, Source and Purification Method on Immune Recognition Molecules, 2014 19: p 44334451 36 Chen, J K., C R Shen, and C L Liu, N-acetylglucosamine: production and applications Mar Drugs, 2010 8(9): p 2493-516 37 Hitoshi Sashiwa et al, Enzymatic production of N-acetyl-D-glucosamine from chitin Degradation study of N-acetylchitooligosaccharide and the effect of mixing of crude enzymes Carbohydrate Polymers., 2003 5: p 391-395 38 Kuk J, et al., Production of N-acetyl-β-d-glucosamine from chitin by Aeromonas sp GJ-18 crude enzyme Applied Microbiology and Biotechnology, 2005 68(3): p 384-389 39 Binod, Parameswaran, et al., Fungal biosynthesis of endochitinase and chitobiase in solid state fermentation and their application for the production of N-acetyl-D-glucosamine from colloidal chitin Bioresource Technology, 2007 98(14): p 2742-2748 40 Kumar, R Sharma, and R Tewari, Production of N-Acetyl glucosamine Using Recombinant Chinolytic Enzymes Indian J Microbiol, 2011 51(3): p 319-325 Công nghệ Sinh học 50 2013 – 2015 Luận văn Thạc sĩ Hoàng Nữ Lệ Quyên 41 Aiba, Seiichi, Production of N-Acetyl-D-Glucosamine from Chitin Using crude enzyme preparations in Large Scale Journal of Metals, Materials and Minerals, 2005 15(1): p 23-25 42 Cabrera, Juan Carlos and Pierre Van Cutsem, Preparation of chitooligosaccharides with degree of polymerization higher than by acid or enzymatic degradation of chitosan Biochemical Engineering Journal, 2005 25: p 165–172 43 Lama-Muñoz, Antonio, et al., Production, characterization and isolation of neutral and pectic oligosaccharides with low molecular weights from olive by products thermally treated Food Hydrocolloids, 2012 28: p 92-104 44 Mubarak, Muhammad Qadri Effendy, Mohd Hafez Mohd Isa, and Abdul Rahman Hassan, Single-step Cross-flow Ultrafiltration for Recovery and Purification of Surfactin Produced by Bacillus subtilis ATCC 21332 International Conference on Chemical, Environment & Biological Sciences, 2014: p 17-18 45 K Jamial Ahmadi, et al., Isolation and Characterization of a Chitionolytic Enzyme Prodiucing Microorganism, Paenibacillus chitinolyticus JK2 from Iran Research Journal of Microbiology, 2008 3(6): p 395-404 46 Pianzzola, M.J., M Moscatelli, and S Vero, Characterization of Penicillium Isolates Associated with Blue Mold on Apple in Uruguay Plant disease, 2004 88(1): p 23-28 47 Jolanta Kumirska, et al., Application of Spectroscopic Methods for Structural Analysis of Chitin and Chitosan Marine Drugs, 2010 8: p 1567-1636 48 Sashiwa, H., et al., Production of N-acetyl-D-glucosamine from alpha-chitin by crude enzymes from Aeromonas hydrophila H-2330 Carbohydr Res, 2002 337(8): p 761-3 49 Yoyi Matsumoto, et al., Production of β-N-acetylhexosaminidase of Verticillium lecanii by solid state and submerged fermentations utilizing shrimp waste silage as substrate and inducer Process Biochemistry, 2004 39: p 665-671 50 Onumpai, Chatchaya, et al., Microbial Utilization and Selectivity of Pectin Fractions with Various Structures APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 2011 77(16): p 5747–5754 Công nghệ Sinh học 51 2013 – 2015 Luận văn Thạc sĩ Hoàng Nữ Lệ Quyên 51 Zhu, Yun Ping, et al., Purification and Identification of 1-Deoxynojirimycin (DNJ) in Okara Fermented by Bacillus subtilis B2 from Chinese Traditional Food (Meitaoza) Journal of Agricutural and Food Chemistry, 2010 58(7): p 4097-103 52 Nguyen H.A et.al, Heterologous Expression and Characterization of an NAcetyl-β-D-hexosaminidase from Lactococus lactic spp lactis IL1403 Journal of Agricutural and Food Chemistry 2012 60(12): p 3275-3281 53 Jeen-Kuan Chen, Chia-Rui Shen, and Chao-Lin Liu, N-Acetylglucosamine: Production and Applications Marine Drugs, 2010 8: p 2493-2516 54 J Rodriguez, et al., A p-N-acetylhexosaminidase from Penicillium oxalicum implicated in its cell-wall degradation Letters in Applied Microbiology, 1994 19: p 217-220 Công nghệ Sinh học 52 2013 – 2015 Luận văn Thạc sĩ Hoàng Nữ Lệ Quyên PHỤ LỤC OD 540 Xây dựng đường chuẩn N-Acetyl-D-glucosamine y = 1.8708x - 0.0943 R² = 0.9994 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.1 Nồng độ NAG (mg/ml) Hình PL1 Phương trình đường chuẩn N-Acetyl-D-Glucosamine Xây dựng đường chuẩn pNp Hình PL2 Phương trình đường chuẩn pNp Công nghệ Sinh học 53 2013 – 2015 Luận văn Thạc sĩ Hoàng Nữ Lệ Quyên PL Bảng 3.4 Hiệu suất thu hồi mức độ tinh GlcNAc sau loại muối GlcNAc (mg/ml) GlcNAc tổng (mg) 185 12.1 2239.2 Hiệu suất thu hồi (%) 100 140 14.75 2066.34 92.28 225.9 1129.5 50.44 442.86 256.22 11.44 16.59 474.3 292.35 13.05 61.63 389.7 416.05 18.58 99.64 Mẫu Thể tích (ml) Dịch thủy phân Dịch cô quay Dịch sau cô quay Kết tinh lạnh lần loại muối Kết tủa cồn Kết tinh sau loại cồn lần Rửa kết tinh Kết tinh sau loại cồn lần Rửa kết tinh Dịch lại không kết tinh Công nghệ Sinh học Khối lượng (mg) 47.7 13.3 1.1 47.71 2.5 140.17 54 Độ tinh (%) 2.13 14.2 1.31 52.48 2.34 99.64 15.65 2013 – 2015 Luận văn Thạc sĩ Hoàng Nữ Lệ Quyên PL Bảng 3.8 Kết tinh GlcNAc Thể tích (ml) Khối lượng (mg) GlcNAc (mg/ml) GlcNAc (mg) Hiệu suất thu hồi (%) Độ tinh (%) Dịch thủy phân 160 12.1 1936.62 100 Dịch cô quay 125 14.3 1787.1 92.28 Dịch sau cô quay 225.9 1129.4 58.31 14.29 65.55 Kết tinh lạnh sau cô đặc dịch thủy phân 300 88.19 4.55 Cặn sau kết tủa cồn 525.8 334.67 17.79 Kết tinh sau loại cồn lần 396.8 418.44 21.6 Rửa kết tinh 0.7 Kết tinh sau loại cồn lần 73.54 9.2 2.65 9.7 0.5 Rửa kết tinh 0.5 47.71 1.23 Dịch không kết tinh 2.5 167.8 21.67 Công nghệ Sinh học 55 100 100 2013 – 2015 Luận văn Thạc sĩ Hoàng Nữ Lệ Quyên Thu nhận tinh sản phẩm GlcNAc quy mô phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học 56 2013 – 2015 ... [11] Từ nhu cầu thực tiễn, nhằm hoàn thiên qui trình sản xuất GlcNAc từ chitin phương pháp sinh học tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu thu nhận N-Acetyl- D-glucosamine từ dịch thủy phân chitin. .. thô từ Penicillium oxalicum 20B thủy phân chitin thu GlcNAc 1.5.2 Tình hình nghiên cứu nước Các nghiên cứu Việt nam chủ yếu tập trung vào chitinase Đặng Trung Thành (2008) nghiên cứu thu nhận. .. xin cam đoan nội dung luận văn với đề tài: Nghiên cứu thu nhận N-acetyl-D-glucosamin từ dịch thủy phân chitin chitinase” công trình nghiên cứu sáng tạo thực hướng dẫn PGS.TS Lê Thanh Hà Các