Nghiên cứu thu nhận n acetylglucosamine (NAG) bằng chitinase từ penicillium oxalicum 20b định hướng ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng

MỞ ĐẦU Ở nước ta, năm gần đây, diện tích sản lượng tôm nuôi không ngừng tăng; đến năm 2015, diện tích nuôi tôm nước lợ đạt 692000 với sản lượng 596000 tấn, kim ngạch xuất khoảng tỷ USD Tuy nhiên ngành sản xuất hàng năm thải lượng lớn phụ phẩm giáp xác (khoảng 70000 tấn) gây ô nhiễm mạnh mẽ tới môi trường Do vậy, để nâng cao lợi ích kinh tế giảm thiểu ô nhiễm môi trường, cần khai thác tận thu thành phần có lợi từ phế liệu chitin, protein, astaxantin Chitin đại diện cho polymer sinh học tự nhiên đứng thứ hai sau cellulose, có mặt vỏ xương loại giáp xác: vỏ cua, vỏ tôm,… Chitin không sử dụng nhiều tính không tan nước Một sản phẩm tạo từ chitin N- acetylglucosamine (N-acetylD-glucosamine, hay GlcNAc, hay NAG) NAG có tiềm chữa bệnh viêm khớp, viêm dày, Ngoài NAG có đặc tính chống ung thư dùng chữa trị bệnh tự miễn dịch [69] Đa số NAG sản xuất thủy phân hóa học HCl đậm đặc nhiệt độ cao Xử lý hóa học gây nhiều bất lợi lượng phế thải acid, hiệu suất tạo NAG thấp (dưới 65%) giá thành cao Thêm nữa, NAG có vị mặn đắng hợp chất dư lại Do vậy, nhiều nghiên cứu tập trung thủy phân chitin sản xuất NAG chitinase Công bố sản xuất NAG từ chitin chitinase thô từ vi sinh vật khiêm tốn Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thu nhận Nacetylglucosamine (NAG) chitinase từ Penicillium oxalicum 20B định hƣớng ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng” * Mục tiêu nghiên cứu: - Thu nhận xác định đặc tính chế phẩm chitinase kỹ thuật từ Penicillium oxalicum 20B - Thu nhận NAG từ chitin phế liệu tôm Việt Nam chế phẩm chitinase kỹ thuật * Nội dung nghiên cứu: - Nghiên cứu sinh tổng hợp chitinase từ P oxalicum 20B - Thu nhận xác định đặc tính chế phẩm chitinase kỹ thuật - Nghiên cứu thủy phân chitin để thu NAG chế phẩm chitinase kỹ thuật nhận - Nghiên cứu thu nhận chế phẩm NAG tinh hướng tới ứng dụng vào thực phẩm chức * Những đóng góp luận án: - Là công trình công bố cách hệ thống đặc tính enzym điều kiện lên men sinh tổng hợp chitinase từ P oxalicum 20B - Đã tạo chế phẩm chitinase kỹ thuật từ P oxalicum 20B xác định đặc tính chế phẩm, ứng dụng để thủy phân chitin thu N-acetylglucosamine Đặc biệt ảnh hưởng cấu tử endochitinase N-acetylhexosaminidase hỗn hợp chế phẩm chitinase kỹ thuật đến hiệu suất tạo N-acetylglucosamine xem xét - Đã đưa qui trình tinh N-acetylglucosamine từ dịch thủy phân chitin xác định đặc tính chế phẩm N-acetylglucosamine phù hợp để sử dụng làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 N- ACETYLGLUCOSAMINE 1.1.1 Các đặc tính N- acetylglucosamine N-Acetylglucosamine dẫn xuất đường glucoza, có nhóm amit liên kết glucosamine axit axetic Công thức phân tử C8H15NO6, khối lượng phân tử 221,21 g/mol NAG có dạng bột màu trắng, vị nhẹ, nóng chảy 221oC, khả hoà tan NAG 25% nước NAG tồn dạng tự do, ngoại trừ sữa người (khoảng 600 - 1500 mg/ml) Hình 1.1 Công thức cấu tạo NAG NAG thành phần cấu trúc polysaccharide chitin Ngoài có thành tế bào vi khuẩn (trong đơn phân murein) lipopolysaccharide màng Ở vi khuẩn, murein phân hủy NAG lại hình thành liên quan đến phosphoryl hóa, GlcNAc-6-phosphate (GlcNAc-6-P) sử dụng để tổng hợp murein hay lipopolysaccharide chuyển hóa đường đường phân 1.1.2 Vai trò N- acetylglucosamine sản xuất thực phẩm chức NAG ứng dụng rộng cung cấp dinh dưỡng sử dụng điều trị tổn thương xương khớp, để cải thiện triệu chứng thoái hóa khớp, tăng cường khả tái tạo sụn khớp, điều trị tận gốc nguyên nhân gây bệnh khớp NAG dùng để phục hồi lớp sụn nối, hỗ trợ chữa bệnh viêm khớp mãn tính [54] Ở người cao tuổi khả tổng hợp NAG thể bị giảm sút dễ mắc bệnh viêm xương khớp, mà người ta phải đưa từ bên vào thể dạng thuốc, có tác dụng chống viêm kích thích sản xuất sụn Nhiều thử nghiệm lâm sàng thực điều trị cho bệnh nhân rối loạn khớp bao gồm bệnh: viêm khớp, viêm xương khớp, viêm khớp dạng thấp, tổn thương sụn, tổn thương khớp, thoái hóa khớp Kết nghiên cứu cho thấy NAG có vai trò quan trọng việc phòng chống tổn thương khớp, chống viêm xương khớp mãn, viêm khớp mãn tính bệnh tổn thương sụn xương [27] Bên cạnh NAG dùng tác nhân chống viêm chữa nhiều bệnh: nhiễm vi khuẩn mãn tính, viêm ruột dày NAG có khả tăng cường giải phóng mucopolysaccharide acid nguyên bào sợi, hình thành cấu trúc bảo vệ đường tiêu hóa làm tăng tính đàn hồi mô xung quanh mạch hoạt động tác nhân bảo vệ, khôi phục toàn vẹn chức bình thường niêm mạc ruột người Một thử nghiệm thí điểm lâm sàng để xác định hiệu điều trị NAG bệnh viêm ruột Trẻ em bị bệnh Crohn cho thấy cải thiện rõ ràng sau dùng NAG đường uống hay đường hậu môn Thực tế, thử nghiệm này, số 12 trẻ em cho thấy cải thiện rõ rệt cho uống NAG liệu pháp song song với liệu pháp hành, trường hợp lại không thấy chuyển biến Ngoài ra, trẻ bị bệnh viêm ruột khác dùng NAG đường hậu môn liệu pháp cho thấy cải thiện rõ rệt em em lại không đáp ứng liệu pháp Đáng lưu ý em không đáp ứng với NAG đường hậu môn trước đề kháng lại liệu pháp khác [125] Do đó, NAG hứa hẹn phương pháp điều trị rẻ tiền không độc hại bệnh viêm ruột mãn tính Gần đây, thử nghiệm lâm sàng giai đoạn III vừa hoàn thành [87] Da người gồm hai lớp lớp sừng (lớp ngoài) lớp hạ bì (lớp bên trong) để bảo vệ thể khỏi điều kiện khắc nghiệt môi trường thời tiết khô, tia cực tím…Tầng lớp sừng đóng vai trò quan trọng việc trì độ ẩm, độ săn cho da Lớp hạ bì bao gồm collagen, elastin… tạo nguyên bào sợi giúp làm tăng khả phục hồi, độ bền, độ đàn hồi, giúp cho da khỏe mạnh Một nhóm carbonhydrate phức tạp acid hyaluronic (HA) proteoglycan có khả giữ nước cao thành phần quan trọng việc trì độ ẩm cho da Lượng cabonhydrate giảm dần theo lứa tuổi, khả giữ nước phục hồi da giảm làm cho da khô, xuất nếp nhăn Bổ sung NAG giúp tăng cường phát triển biểu collagen nguyên bào sợi, thúc đẩy gia tăng tế bào sừng có tác dụng giữ ẩm, giảm xuất sắc tố da khuôn mặt, cải thiện nếp nhăn da [29] NAG có đặc tính chống ung thư dùng chữa trị bệnh tự miễn dịch [69] Ngoài ra, dùng NAG mỹ phẩm, băng bó vết thương, phụ gia thực phẩm sữa Lợi ích ứng dụng NAG thể Bảng 1.1 Bissett cs (2007), Chen cs (2010) công bố nghiên cứu lâm sàng NAG lên người bệnh uống như: hấp thụ, phân phối đào thải uống [15] Nghiên cứu Chen cs (2010) tỷ lệ hấp thụ đạt 98% NAG hấp thụ, phân phối vào tế bào khớp nhằm kết nối chặt chẽ thành ma trận tế bào khớp nối sụn, dây chằng, gân [27] Trong thể người, NAG giữ nguyên dạng glucoprotein, chất kích hoạt hàng loạt chất huyết tương hoạt hóa thành plasma [143] Chế phẩm chứa NAG sử dụng đường tiêm, uống NAG bị phân giải cách từ từ giữ cấu trúc giống chất có thể người nên khả hấp thu cao gấp lần so với glucosamine thông thường Một liều lượng lớn NAG (20 g) tiêm tĩnh mạch không độc tính không thay đổi nồng độ glucose máu [133] Người ta chứng minh rằng: 54% NAG cung cấp tiết qua đường nước tiểu ngày, điều rõ chuỗi phản ứng sinh hóa NAG Bảng 1.1 Ứng dụng lợi ích NAG Chức Đối tƣợng Thử nghiệm Tài liệu tham khảo Điều trị bệnh Ung thư di Bệnh đường ruột Bệnh rối loạn đường ruột Tổn thương khớp Động vật, người Con người Con người Con người [176] [177] [153] [90] Phòng ngừa bệnh Ngộ độc thuốc chất hóa học Thuốc kháng sinh Tác dụng phụ điều trị hóa trị điều trị sóng vô tuyến Say tàu xe Tế bào vi sinh vật, động vật Vi khuẩn Con người [178] [175] [176] Con người [174] Bệnh da Vệ sinh da Con người [172] Thực phẩm bổ sung Phụ gia sữa Phụ gia đồ uống thể thao Động vật, người Động vật, người [173] [167] Làm mỹ phẩm Giữ độ ẩm cho da Tăng tính đàn hồi màu sắc Giảm sản xuất melanin Con người Con người Con người [27] [130] [15] Các phép thử độc tố cho thấy NAG không độc Ngoài NAG tạo enzym có vị bền nhiệt Chính vậy, gần NAG dẫn xuất từ NAG sử dụng để bổ sung vào chế độ ăn uống, phát triển rộng chữa bệnh cho người [7] 1.1.3 Các phƣơng pháp sản xuất N- acetylglucosamine 1.1.3.1 Phương pháp hóa học Theo phương pháp hóa học, NAG sản xuất cách dùng axit HCl đậm đặc để thủy phân chitin nhiệt độ cao Nhiệt độ nồng độ axit cần phải kiểm soát cách chặt chẽ, đủ cao để thủy phân chitin tránh phân hủy NAG Thường trình thủy phân diễn nhiệt độ khoảng từ 40 - 80ºC nồng độ HCl từ 15 - 36% Sản lượng NAG đạt 6,42 g/l h [22] Phương pháp thường đạt hiệu suất thủy phân thấp (dưới 65%), giá thành cao thải lượng lớn axit gây ô nhiễm môi trường xung quanh, sản phẩm cuối có vị mặn có tác dụng phụ trình hóa học [128] Đặc biệt nhóm axetyl bị nên lại phải axetyl hóa trở lại phức tạp Do sản phẩm không coi tự nhiên có mặt chất hóa học (như O-axetyl, diaxetyl, dung môi) sản phẩm gây vị đắng [71] 1.1.3.2 Phương pháp chuyển hóa sinh học Sản xuất NAG qua trình chuyển hóa trực tiếp chitin vi sinh vật tổng hợp chitinase không thông qua giai đoạn thu chế phẩm trung gian Phương pháp có ưu điểm công đoạn trình khó kiểm soát tạo thành sản phẩm trao đổi chất khác NAG Theo Li cs (2005) dùng 2% gel chitin làm chất nuôi cấy vi khuẩn Aeromonas caviae DYU-BT4 từ mẫu đất Taiwan thu NAG với hàm lượng 7,8 g/l [83] Theo nghiên cứu khác Chen cs (2011), Chitinibacter tainanensis phân lập từ đất phía Nam Taiwan thủy phân chất -chitin ß-chitin cho hiệu suất thu hồi NAG 76% 98% Kết tinh dịch lên men thu NAG với độ tinh 99% [30] Các nhân tố phân giải chitin (CDFs) thủy phân chitin tạo suốt thời kỳ phát triển C tainanensis có mặt chitin Hoạt tính NAHase endochitinase tìm thấy vi khuẩn sống phần tế bào chết Hoạt độ riêng NAHase cao nhiều so với endochitinase Cơ chế hoạt động nhân tố phân giải chitin minh họa Hình 1.2 Hình 1.2 Sản xuất NAG chuyển hóa sinh học [71] Ngoài NAG sản xuất thông qua chủng biến đổi di truyền sử dụng glucose làm chất Các đường hướng chuyển hóa D-glucosamin tổng hợp NAG thay đổi kỹ thuật di truyền nhằm tăng hoạt tính enzym, giảm sản phẩm kìm hãm tăng lực với chất, nên tạo sản phẩm nồng độ cao Dùng vi sinh vật biến đổi gen không tận dụng nguồn chitin nhược điểm phương pháp 1.1.3.3 Phương pháp enzym Chitinase hệ enzym thủy phân chitin để thu nhận NAG phương pháp enzym Ở qui mô công nghiệp lớn, sản xuất NAG chitinase tinh Tuy nhiên chitinase tinh đắt kể từ chủng biến đổi gen Nên thực tế hay dùng enzym thô thu nhận NAG Phân giải chitin thành NAG chitinase diễn theo hai giai đoạn Đầu tiên endochitinase (EC 3.2.1.14) phân giải chitin thành oligomer, sau oligomer bị phân giải thành monomer NAHase (EC 3.2.1.96) [127] Sáng chế Haynes cs (1999) nước Mỹ thu nhận NAG chitinase (bao gồm chitinase chitobiosidase) thủy phân vỏ loài giáp xác [51] Pichyangkura cs (2002) dùng chitinase thô từ Burkholderia cepacia TU09 Bacillus licheniformis SK-1 thủy phân bột mịn α-chitin, β-chitin tạo NAG Chitinase từ B cepacia TU09 thủy phân β-chitin ngày α-chitin ngày có hiệu suất thu nhận NAG 85% Chitinase từ B licheniformis SK-1 thủy phân β-chitin ngày cho hiệu suất thu nhận NAG khoảng 75% Ngoài ra, hiệu suất thu nhận NAG đạt 41% thủy phân α-chitin B licheniformis SK-1 [110] Bohlmann cs (2004) dã đưa sáng chế: NAG thu với độ tinh cao cách thủy phân chitin sinh khối nấm sợi [22] Aiba (2005) dùng dịch enzym thô (gồm NAHase chitinase) từ A hydrophila H2330 để sản xuất NAG với quy mô lớn [7] Jung cs (2007) công bố sản xuất NAG N-acetylchitooligosaccharide dịch enzym thô từ Paenibacillus illinoisensis KJA-424 [60] Sau thời gian 48h thủy phân β – chitin chitinase từ nấm Aspergillus sp, hiệu suất thủy phân (HSTP) NAG đạt 65% Pha trộn hai enzym thô từ Trichoderma viride Acremonium cellulolyticus thủy phân tốt β - chitin dạng bột [57, 132] Hiện nay, tiềm sản xuất NAG sử dụng hệ enzym tái tổ hợp chitinase nhân lên E.coli [76] So với phương pháp hóa học, phương pháp thủy phân chitin enzym diễn điều kiện nhẹ nhàng, không gây ô nhiễm môi trường sản phẩm NAG tinh gần 100% nên ưa thích [74] Đối với phương pháp thủy phân chitin enzym phần chitin vô định hình thủy phân cách dễ dàng, chitin liên kết chặt chẽ thủy phân từ từ Hỗn hợp endochitinase, exochitinase (chitobiosidase NAHase) cần thiết cho thủy phân hoàn toàn chitin, hàm lượng NAHase cao NAG tạo có độ tinh khiết cao Do vậy, cấu trúc tinh thể chitin thành phần enzym hai yếu tố quan trọng sản xuất NAG phương pháp enzym [27] 1.2 CHITIN 1.2.1 Cấu tạo hóa học tính chất lý hóa chitin Chitin polysaccharide mạch thẳng gồm β-(1-4)-2-acetamido-2-deoxy-Dglucose Hay nói cách khác: Chitin cấu tạo từ đơn phân NAG liên kết liên kết 1,4- β-glucoside hình thành mạng lưới sợi có tổ chức Cấu trúc hóa học chitin giống với cấu trúc hóa học cellulose, chitosan Chúng khác nhóm OH, -NH2, -NHCOCH3 (Hình 1.3) Hình 1.3 Cấu trúc hóa học chitin, chitosan, cellulose [70] Chitin có màu trắng, cứng, không đàn hồi, không tan nước dung môi hữu thông thường hòa tan dung môi hexafluoro-2propanol, N,N-dimethylacetamid, hexafluroacetone, lithium thiocyanate Ngoài ra, chitin tan acid trichloroacetic (TCA), acid dichloroacetic (DCA) Muối LiCNS, Ca (CNS)2…có khả hydrat hóa mạnh mẽ để phân giải chitin [112] Khi dung dịch HCl đậm đặc, chitin bị phân hủy hoàn toàn thành 88,5% DGlucosamine 11,5% axit acetic, trình thủy phân bắt đầu xảy mối nối glucoside, sau loại bỏ nhóm acetyl (-CO-CH3) Đun nóng chitin dung dịch NaOH đậm đặc tạo thành chitosan chitin bị gốc acetyl: Chitin + n NaOH (đậm đặc) Chitosan + n CH3COONa Trong cấu trúc tinh thể chitin, chuỗi chitin tạo thành qua liên kết hydro Cấu trúc tinh thể chitin ổn định liên kết hydro, tương tác kỵ nước phân tử phân tử Mỗi chuỗi có nhiều liên kết hydro phân tử đường lân cận gọi liên kết nội phân tử gồm liên kết hydro nhóm cacbonyl với nhóm hydroxyl vị trí cacbon - liên kết hydro thứ hai nhóm OH cacbon - vòng oxi, tương tự liên kết hydro chuỗi cellulose Ngoài ra, chuỗi giữ vững liên kết hydro mạnh C = O N – H [97] Liên kết hydro lớn làm tăng cường độ cứng chuỗi tinh thể chitin Hình 1.4 Liên kết hydro nội phân tử chitin [97] Chitin có trình tự xếp cao, cấu trúc tinh thể Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X [97], người ta chứng minh chitin tồn ba dạng cấu hình: α-chitin, β-chitin γ-chitin [45], dạng khác trình tự xếp chuỗi vùng tinh thể Dạng chitin khác xếp khác hướng mắt xích (NAG) mạch thể Hình 1.5 Có thể biểu diễn mắt xích mũi tên cho phần đầu mũi tên nhóm –CH2OH, phần đuôi nhóm –NHCOCH3, cấu trúc α, β, γ- chitin mô tả sau: Hình 1.5 Dạng cấu hình α, β, γ- chitin [45] Ba dạng đa hình chitin khác mức độ hydrat hóa, kích thước số chuỗi chitin đơn vị tế bào -chitin (có nhiều vỏ tôm, cua) phân bố rộng rãi nhất, dạng rắn kết tinh nhất, chuỗi xếp kiểu đối song song đặn [26], nên liên kết hydro lớp hệ chuỗi, có liên kết hydro lớp kề Do làm đặc tính -chitin bền vững, cứng không tan nước Cấu trúc -chitin có thêm liên kết hydro (được tạo nhóm hydroxymethyl (CH2OH) chuỗi liền kề nhau), không tìm thấy liên kết cấu trúc β – chitin [100] β-chitin (có nhiều mai mực) gồm chuỗi song song, γ-chitin (nhiều nấm nấm men) có hai chuỗi song song theo hướng kết hợp chuỗi thứ ba với hướng đối diện song song, lớp loại liên kết hydro Loại γ-chitin nghiên cứu cho cấu trúc lỗi hai dạng α β – chitin dạng cấu trúc thứ ba chitin coi biến thể αchitin [13] Sự phân bổ dạng không liên quan tới nguyên tắc phân loại dạng khác xuất thể, đặc tính chức khác nhau: α-chitin dạng đầy đủ nhất, cứng [121] So sánh -chitin với ß-chitin, ß-chitin dễ bị thủy phân enzym -chitin tồn tự nhiên phổ biến β-chitin γ-chitin có tính bền, mềm dẻo nhiều chức sinh lý Dạng β chuyển đổi sang dạng α xử lý với kiềm chuyển ngược lại dạng γ-chitin chuyển đổi sang α-chitin cách xử lý với lithium thiocyanate [99] 1.2.2 Nguồn thu nhận chitin Chitin tách lần từ nấm vào năm 1811 [23] Chitin hợp chất polimer có mặt từ nhiều nguồn khác Chitin thành phần cấu trúc quan trọng vỏ số động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác giun tròn Ở động vật bậc cao, chitin thành phần chủ yếu mô da, giúp tái tạo gắn liền vết da Ở thực vật, chitin có thành tế bào nấm họ Zygenmyctes, sinh khối nấm mốc, số loại tảo… Các nguồn chitin từ công nghiệp thủy sản bao gồm vỏ tôm, cua, ghẹ, mai mực ống mực nang Nhìn chung, hàm lượng chitin phế liệu giáp xác chiếm khoảng 10 – 60% so với trọng lượng khô [148] Hiện chitin tách chiết từ vỏ giáp xác chủ yếu phương pháp hóa học; ứng dụng công nghệ điện hóa để tách chiết tinh chế chitin từ vỏ đầu tôm [6]; thời gian gần phương pháp sinh học bắt đầu nghiên cứu sử dụng sản xuất chitin [14] Giáp xác nguồn nguyên liệu thủy sản chiếm 30 – 35% tổng lượng nguyên liệu Việt Nam Trong công nghiệp chế biến thủy sản xuất khẩu, tỷ lệ cấu mặt hàng đông lạnh giáp xác chiếm 70 - 80% công suất chế biến Các nhà máy chế biến thủy sản tiêu thụ lượng lớn nguyên liệu nên thải lượng đáng kể phế liệu phế liệu vỏ - đầu tôm, vỏ cua, vỏ ghẹ chủ yếu Ở Việt Nam, hàng năm nhà máy chế biến thải bỏ lượng phụ phẩm giáp xác lớn khoảng 70000 Riêng tỉnh Khánh Hòa, lượng phế liệu khoảng 2257 tấn/ năm Phế liệu thải trực tiếp môi trường gây ô nhiễm lớn, đem xử lý chất thải chi phí lớn Chính vậy, phế liệu ngành thủy sản Việt Nam (vỏ tôm, ghẹ, ) cần tận dụng nhằm nâng cao lợi ích kinh tế, đồng thời giải toán ô nhiễm môi trường ngành chế biến thủy sản mang lại 1.3 CHITINASE 1.3.1 Hệ chitinase Hệ thống chitinase thủy phân chitin gồm: Endochitinase (E.C 3.2.1.14), exochitinase (EC 3.2.1.52) gồm 1,4-β-chitobiosidase (E.C 3.2.1.30) β-N-acetylhexosaminidase (EC 3.2.1.96) 10 18 Bierau, H., R.J Hinton, and A Lyddiatt (2001) Direct process integration of cell disruption and fluidized bed adsorption in the recovery of labile microbial enzymes Bioseparation 10(13): pp 73-85 19 Binod, P., S Chandran, S Pradeep, S George, and P Asok (2007) Fungal biosynthesis of endo-chitinase and chitobiase in solid state fermentation and their application for the production of N-acetyl-D-glucosamine from colloidal chitin Bioresour Technol 98: pp 27422748 20 Binod, P., T Puztahelyi, V Nagy, C Sandhya, G Szakacs, and I Pcsi (2005) Production and purification of extracelluatlar chitinase g=from Penicillium aculeatum NRRL 2129 under solid statatione ferment Enzyme Microbital Technology 36(7): pp 880-887 21 Black, M.M and H.M Schwarz (1950) The estimation of chitin and chitin nitrogen in crawfish waste and derived products Aalyst 75: pp 185-188 22 Bohlman, J.A., D.O Schisler, K.O Hwang, J.P Hennling, J.R Trinkle, T.B Anderson, J.D Steinke, and A Vanderhoff (2004) N-Acetyl-D-glucosamine and Process for Producing NAcetyl-D-glucosamine, in US Patent NO 6693188B2 23 Braconnot, J (1811) Sur la nature des champignons Ann Chim (Paris) 79: pp 265-304 24 Brzezinska, M.S., U Jankiewicz, and M Walczak (2013) Biodegradation of chitinous substances and chitinase production by the soil actinomycete Streptomyces rimosus International Biodeterioration & Biodegradation 84: pp 104-110 25 Cannon, R.D., K Niimi, H.F Jenkinson, and M.G Shepherd (1994) Molecular cloning and expression of the Candida albicans b-Nacetylhexosaminidase (HEXI) gene J Bacteriol 176: pp 2640-2647 26 Carlstrom, D (1957) The Crystal Structure of Alpha-Chitin (Poly-N-Acetyl-DGlucosamine) Journal of Biophysical and Biochemical Cytology 3: pp 669-683 27 Chen, J.K., R.S Chia, and L.L Chao (2010) N-Acetylglucosamine: Production and Applications Marine Drugs 8: pp 2493-2516 28 Chen, J.K., C.R Sheng, and C.L Liu (2014) The Characteristics of Chitinase Expression in Aeromonas schubertii Appl Biochem Biotechnol 172: pp 3827-3834 29 Chen, R.H.H., M.Y Chung, W.L Tsai, and C.H Liu (2008) Effect of Different Concentrations of Collagen, Ceramides, N-Acetyl Glucosamine, or Their Mixture on Enhancing the Proliferation of Keratinocytes, Fibroblasts and the Secretion of Collagen and/or the Expression of mRNA of Type I Collagen J Food Drug Anal 16: pp 66-74 30 Chern, L.L., E Stackebrandt, S.F Lee, F.L Lee, J.K Chen, and H.M Fu (2004) Chitinibacter tainanensis Gen nov sp nov., a Chitin-degrading Aerobe from Soil in Taiwan Int J Syst Evol.Microbiol 54: pp 1387-1391 31 Choi, H., L Laleye, and G.F Amantea (1997) Release of aminopeptidase from Lactobacillus casei sp casei by cell disruption in a microfluidizer Biotechnol Technology 11(7): pp 451453 32 Darbyshire, J (1981) Large-scale enzyme extraction and recovery In: Wiseman A (ed) Topics in enzyme and fermentation biotechnology Ellis Horwod, Chichester 5: pp 147–186 33 Donnell, C.P.O., B.K Tiwari, P Bourke, and P.J Cullen (2010) Effect of ultrasonic processing on food enzymes of industrial importance Trends in Food Science and Technology 21(7): pp 358-367 34 Felse, P.A and T Panda (2000) Production of microbial chitinases - A revisit Biosci Biotechnol Biochem Bioprocess Engineering 23: pp 127-134 35 Felse, P.A.P., T (1999) Self-directing optimization of parameters for extracellular chitinase production by Trichoderma harzianum in batch mode Proc Biochem 34: pp 563-566 36 Fenice, M., R.D Giambattista, E Raetz, J.L Leuba, and F Federici (1998) Repeated-batch and continuous production of chitinolytic enzymes by Penicillium janthinellum immobilised on chemically modifies macroporous cellulose Journal of biotechnology 62(2): pp 119-131 37 Focher, B., P.L Beltranme, A Naggi, and G Torri (1990) Alkaline Ndeacetylation of chitin enhanced by flash treatments: reaction kinetics and structure modifications Carbohydr Polym 12: pp 405-418 97 38 Frankowski, J., G Berg, and H Bahl (2001) Purification and properties of two chitinolytic enzymes of the biocontrol agent Serratia plymuthica HRO C48 Arch Microbiol 176: pp 421426 39 Frenander, U and A.S Jonsson (1996) Cell harvesting by cross-flow microfiltration using a shear-¨enhanced module Biotechnol Bioeng 52(3): pp 397-403 40 Garrido, F., U.C Banerjee, and Y Chisti (1994) Disruption of a recombinant yeast for the release of beta-galactosidase Bioseparation 4(5): pp 319-328 41 Ghanem, K.M., S.M Al-Garni, and N.H Al-Makishah (2010) Statistical optimization of cultural conditions for chitinase production from fish scales waste by Aspergillus tereus African Journal of Biotechnology 9(32): pp 5135-5146 42 Gkargkas, K., M.D Nedev, G Topakas, E christakopoulos, and P Kekos (2004) Studies on a N-acetyl-[beta]-D-glucosaminidase produced by Fusarium oxysporum F3 grown in solid state fermentation 39(11): pp 1599-1605 43 Guadalupe, V.-L., G.-M Humberto, M Gimeno, A Lospez-Luna, E Basrzana, and K Shirai (2013) Ultrasonication and steam-explosion as chitin pretreatments for chitin oligosaccharide production by chitinases of Lecanicillium lecanii Bioresource Technology 146: pp 794-798 44 Gupta, R., R Saxena, P Chaturvedi, and J Virdi (1995) Chitinase production by Streptomyces viridificans: Its potential in fungal cell wall lysis J Appl Bacteriol 78: pp 378383 45 Hackman, R.H and M Goldberg (1965) Studies on Chitin Nature of Alpha- and BetaChitins Australian Journal of Biological Sciences 15(3): pp 526-532 46 Hakola, M (2013) Catalytic Pretreatments and Microwave Assisted Hydrolysis of Lignocellulosic Raw Materials Laboratory of Inorganic Chemistry, Department of Chemistry, Faculty of Science, University of Helsinki: pp 3-47 47 Hamid, R., M Ahmad, M.M Ahmad, M.Z Abdin, and S Javed (2013) Purification and characterization of thermostable chitinase from a novel S maltophilia strain Malaysian Journal of Microbiology 9(1): pp 7-12 48 Hao, Z., Y Cai, X Liao, X Zhang, Z Fang, and D Zhang (2012) Optimization of nutrition factors on chitinase production from a newly isolated Chitiolyticbacter meiyuanensis SYBCH1 Brazilian Journal of Microbiology 43: pp 177-186 49 Haran, S., H Schickler, A Oppenheim, and I Chet (1995) New components of the chitinolytic system of Trichoderma harzianum Mycol Res 99: pp 441-446 50 Harman, G.E., C.K Hayes, M Lorito, R.M Broadway, A.D Pietro, C Peterbauer, and A Tronsmo (1993) Chitinolytic enzymes of Trichoderma harzianum: purification of chitobiosidase and endochitinase Phytopathology 83: pp 313-318 51 Haynes, C.A., P Aloise, and A.L Creagh (1999) Process for producing N-Acetyl-DGlucosamine: United States Patent, Patent No 998 173 pp 1-26 52 Hiraga, K., L Shou, M Kitazawa, S Takahashi, M Shimada, R Sato, and K Oda (1997) Isolation and characterization of chitinase from a flake chitin degrading marine bacterium, Aeromonas hydrophila H-2330 Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61(1): pp 174176 53 Ho-Seong, L and K Sang-Dal (1994) The production and enzymatic properties of chitinase from Pseudomonas stulzeri YPL-1 as a biocontrol agent J Microbiol Biotechnol 4: pp 134140 54 Houpt, J.B., R McMilla, and S.D Paget-Dellio (1999) Effect of Glucosamine Hydrochloride in the Treatment of Pain pf Osteoarthritis of the Knee J Rheumatol 26: pp 2423-2430 55 Huang, J.H., C.J Chen, and Y.C Su (1996) Production of chitinolytic enzymes from a novel species of Aeromonas J Ind Microbiol 17: pp 89-95 56 Illanes, A., F Acevedo, and J Gentina (1994) Production of penicillin acylase from Bacillus megaterium in complex and defined media Proc Biochem 29(4): pp 263-270 57 Jamialahmadi, K., J Behravan, M.F Najafi, M.T Yazdi, A.R Shahverdi, and M.A Faramarzi (2011) Enzymatic Production of N - Acetyl - Glucosamine from Chitin Using Crude Enzyme Preparation of Aeromonas sp PTCC1691 Biotechnology 10(3): pp 292-297 98 58 Jankiewicz, U., M.S Brzezinska, and E Saks (2012) Identification and characterization of a chitinase of Stenatrophomonas maltophilia, a bacterium that is antagonistic towards fungal phytopathogens journal of Bioscience and Bioengineerint 113(1): pp 30-35 59 Jennifer, G.L., S Khalif, and A.J Castle (2005) An improved method for detection and quantification of chitinase activities Canadian Fournal of Microbiology 51(6): pp 491- 495 60 Jung, W.J., A Souleimanov, R.D Park, and D.L Smith (2007) Enzymatic production of Nacetylchitooligosaccharides by crude enzyme derived from Paenibacillus illioisensis KJA-424 Carbohydr Polym 67: pp 256-259 61 Kang, S.C., S Park, and D.G Lee (1999) Purification and characterization of a novel chitinase from the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae J Invertebr Pathol 73: pp 276-281 62 Kao, P.M., C.I Chen, S.C Huang, Y.C Chan, P.J Tsai, and Y.C Liu (2007) Development of continuous chitinase production process in a membrane bioreactor by Paenibacillus sp CHEN1 Process Biochem 42: pp 606-611 63 Kapat, A.R., S.K., and T Panda (1996) Optimization of carbon and nitrogen sources in the medium and environmental factors for enhanced production of chitinase by Trichoderma harzianum Bioproc Eng 15: pp 13-20 64 Karube, I., Kawasaki, and T Morita (1993) Enzymatic Decomposition Method of Chitin Containing Materials: United States Patent, Patent No 262 310 65 Katarzyna, S., M.S Antczak, M Walczak, and T Antczak (2008) Isolation and purification of intracellular chitosanalytic enzymes of Mucor circinelloides Progress on chemistry and application of chitin and its 8: pp 107-116 66 Kim, K.J., Y.J Yang, and J.G Kim (2003) Purification and Characterization of Chitinase from Streptomyces sp M-20 Journal of Biochemistry and Molecular Biology 36(2): pp 185189 67 Kim, K., A.L Creagh, and C.A Haynes (1998) Effective Production of N-Acetyl-β-Dglucosamine by Serratia mareescens Using Chitinaeeous Waste Biotechnol Bioprocess Eng 3: pp 71-77 68 Kim, K and H.S Ji (2001) Effect of Chitin Sources on Production of Chitinase and Chitosanase by Streptomyces griseus HUT 6037 Biotechnol Bioprocess Eng 6: pp 18-24 69 Kirkham, S.G and R.K Sammarasinghe (2009) Review article: glucosamine J Orthop Surg (Hong Kong) 17: pp 72-76 70 Kohr, E (2001) Chitin:fulfilling a biomaterials promise Oxford:Elsevier 71 Kuan Chen, J., C Rui Shen, and C Liu Liu (2010) N-Acetylglucosamine: Production and Applications Marine Drugs 8: pp 2493-2516 72 Kuddus, S.M and R.I.Z Ahmad (2013) Isolation of novel chitinolytic bacteria and production optimization of extracellular chitinase Journal of Genetic Engineering and Biotechnology 11: pp 39-46 73 Kuk, J.H., W.J Jung, G.H Jo, J.S Ahn, K.Y Kim, and R.D Park (2005) Selective preparation of N-acetyl-D-glucosamine and N,N’- diacetylchitobiose from chitin using a crude enzyme preparation from Aeromonas sp Biotechnology Letters 27: pp 7-11 74 Kuk, J.H., W.J Jung, G.H Jo, Y.C Kim, K.Y Kim, and R.D Park (2005) Production of Nacetyl-β-D-glucosamine from chitin by Aeromonas sp GJ-18 crude enzyme Appl Microbiol Biotechnol 68: pp 384-389 75 Kumar, D.P., R.K Singh, P.D Anupama, M.K Solanki, S Kumar, A.K Srivastava, P.K Singhal, and D.K Arora (2012) Studies on Exo-Chitinase Production from Trichoderma asperellum UTP-16 and Its Characterization Indian J Microbiol 52(3): pp 388-395 76 Kumar, S., R Sharma, and R Tewari (2011) Production of N-Acetylglucosamine Using Recombinant Chitinolytic Enzymes Indian J Microbiol 51(3): pp 319-325 77 Kunz, C., O Sellam, and Y Bertheau (1992) Purification and characterization of a chitinase from the hyperparasitic fungus Aphanocladium album Physiol Mol Plant Pathol 40: pp 117-131 78 Lama-Munoz Antonio, e.a (2012) Production, characterization and isolation of neutral and pectic oligosaccharides with low molecular weights from olive by products thermally treated Food Hydrocolloids 28: pp 92-104 99 79 Lee, S.L., A Burt, and G Russotti (1995) Microfiltration of recombinant yeast cells using a rotating disk dynamic filtration system Biotechnol Bioeng 48(4): pp 386-400 80 Lee, Y.G., K C Chung, S.G Wic, J.C Lee, and H.J Bae (2009) Purification and properties of a chitinase from Penicillium sp LYG 0704 Protein Expresion and Purification 65: pp 244250 81 Li, D.C., S Chen, and J Lu (2005) Purification and partial characterization of two chitinase from the mycoparasitic fungus Talaromyces flavus Mycopathologia 159: pp 223-229 82 Li, D.C., S.H Zhang, K.Q Liu, and J Lu (2004) Purification and partial characterization of a chitinase from the mycoparasitic fungus Trichothecium roseum J Gen Appl Microbiol 50: pp 35-39 83 Li, Y.L., S.T Wu, S.T Yu, and J.R Too (2005) Screening of a Microbe to Degrade Chitin Taiwanese J Agric Chem Food Sci 43: pp 410-418 84 Li, Z.J., V Shukla, K.S Wenger, A.P Fordyce, A.G Pedersen, and M.R Marten (2002) Effects of increased impeller power in a production-scaleAspergillus oryzaefermentation Biotechnology Progress 18: pp 437-444 85 Lien, T.S., S Wu, S Yu, and J.R Too (2007) Purification and characterization of a thermophilic chitinase produced by Aeromonas sp DYU-Too7 Korean J Chem Eng 24(5): pp 806-811 86 Liu, B.L., P.M Kao, Y.M Tzeng, and K.C Feng (2003) Production of chitinase from Verticillium lecanii F091 using submerged fermentation Enzym Microbial Technol 33: pp 410-415 87 Liu, Y.L.Z., G Liu, J Jia, S Li, and C Yu (2008) Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry Method for Determination of N-Acetylglucosamine Concentration in Human Plasma J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 862: pp 150-154 88 Luciana, F.F., H.Y Kawaguti, and H.H Sato (2009) Production, purification and application of extracellular chitinase from Cellulosimicrobium cellulans 191 Brazilian Journal of Microbiology 40: pp 623-630 89 Mahadevan, B.C and D L (1997) Properties of the chitinase of the antifungal agent Streptomyces lydicuis WYEC108 Enzyme Microb Technol 20: pp 489-493 90 Marcum, F and J Seanor (2007) Composition and method for treating rheumatoid arthritis, in US patent NO 003258 91 Mathivanan, N., V Kabilan, and K Murugesan (1997) Production of chitinase by Fusarium chlamydosporum, a mycoparasite to groundnut rust Puccinia arachidis Ind J Exp Biol 35: pp 890-893 92 Matsumoto, Y., G Saucedo-Castaneda, and K Shirai (2004) Production of β-Nacetylhexosaminidase of Verticillium lecanii by solid state and submerged fermentations utilizing shrimp waste silage as substrate and inducer Process Biochemistry 39: pp 665-671 93 McCormack, J., T.J Hackett, M.G Tuohy, and M.P Conghlan (1991) Chitinase production by Talaromyces emersonii 13: pp 677-682 94 Middelberg, A.P.J (2000) Microbial cell disruption by high-pressure homogenization In: Desai MA (ed) Downstream processing of proteins Humana Press, Totowa: pp 11-22 95 Miller, G.L (1959) Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar Anal Chem 31(3): pp 426-428 96 Ming-De, D., A.J David, D Cyron, A.D Grund, A.J.J.R Thomas, C Leanna, O Mathre, R Rosson, J Running, D Severson, L Song, and S Wassink (2004) Process and materials for production of glucosamine and N-acetylglucosamine, in US Patent NO 0091976 A1 97 Minke, R and J Blackwell (1978) Structure of Alpha-Chitin Jounal of Molecular Biology 120 (2): pp 167-181 98 Mohammad, T.J and K Karimi (2008) Pretreatment of Lignocellulosic Wastes to Improve Ethanol and Biogas Production: A Review International Journal of Molecular Sciences 9: pp 1621-1651 99 Muzzarelli, R.A.A (1977) Chitin Pergamon Press, Oxford, Great Britain: pp 1-309 100 Muzzrelli, R.A.A., M.E.I Mehtedi, and M.M Belmonte (2014) Emerging Biomedical Applications of Nano - Chitins and Nano-Chitosans Obtained via Advanced Eco-Friendly Technologies from Marine Resources Marine drugs 12: pp 5468-5502 100 101 Nakagawa, Y., Oyama, Y., Kon, N., Nikaido, M., Tanno, K., and J Kogawa (2011) Development of innovative technologies to decrease the environmental burdens associated with using chitin as a biomass resource: Mechanochemical grinding and enzymatic degradation Carbohydrate Polymers 83: pp 1843-1849 102 Nawani, N.N and B.P Kapadnis (2005) Optimization of chitinase production using statistics based experimental designs Process Biochemistry 40: pp 651-660 103 Nawani, N.N., B.P Kapadnis, A.D Das, A.S Rao, and S.K Mahajan (2002) Purification and characterization of a thermophilic and acidophilic chitinase from Microbispora sp V2 Appl Microbiol J 93: pp 965-975 104 Ohishi, K.Y., M Ohta, T Suzuki, M Izumida, H Sano, H Nishijama, and M Miwa (1996) Purification and properties of two chitinases from Vibrio alginolyticus H-8 J Ferment Bioeng 82: pp 598-600 105 Osada;, M., C Miura, Y.S Nakagawa, M Kaihara, M Nikaido, and K Totani (2013) Effects of supercritical water and mechanochemical grinding treatments on physicochemical properties of chitin Carbohydrate Polymers 92: pp 1573-1578 106 Park, J.K., K Morita, I Fukumoto, Y Yamasaki, T Nakagawa, M Kawamukai, and H Matsuda (1997) Purification and characterization of the Chitinase (ChiA) from Enterobacter sp G-1 Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61(4): pp 684-689 107 Patidar, P., D Agrawal, T Banerjee, and S Patil (2005) Optimisation of process parameters for chitinase production by soil isol isolates of Penicillium chrysogenum under solid substrate fermentation Process Biochemistry 40: pp 2962-2967 108 Patil, N.S., S.R Waghmare, and J.P Jadhav (2013) Purification and characterization of an extracellular antifungal chitinase from Penicillium ochrochloron MTCC 517 and its application in protoplast formation Process Biochemistry 48: pp 176-183 109 Pianzzola, M.J., M Moscatelli, and S Vero (2004) Characterization of Penicillium Isolates Associated with Blue Mold on Apple in Uruguay Plant disease 88(1): pp 23-28 110 Pichyangkura, R., S Kudan, K Kuttiyawang, M Sukwattanasinitt, and S Aiba (2002) Quantitative Production oF 2-Acetoamodo-2-D-glucose from Crystalline Chitin by Bacterial Chitinase Carbohydr Res 337: pp 557-559 111 Pietro, A.d., M Lorito, C.K Hayes, R.M Broadway, and G.E Harman (1993) Endochitinase from Gliocladium virens: isolation, characterization, and synergistic antifungal activity in combination with gliotoxin Phytopathology 83: pp 308-313 112 Pillai, C.K.S., W Paul, and C.P Sharma (2009) Chitin and chitosan polymers: Chemistrym solubility and fiber formation Prpgress in Polymer Science 34: pp 641-678 113 Pleban, S., L Chernin, and I Chet (1997) Chitinolytic enzymes of an endophytic strain of Bacillus cereus Letters in Applied Microbiology 25(4): pp 284-288 114 Pradeep, G.C., H.Y Yoo, S.S Cho, Y.H Choi, and J.C Yoo (2015) An Extracellular Chitinase from Streptomyces sp CS147 Releases N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) as Principal Product Appl Biochem Biotechnol 175: pp 372-386 115 Rishad, K.S., R.S Sharrel, V.K Nathan, S Shabanamol, and M.S Jisha (2016) Optimised production of chitinase from a novel mangrove isolate, Bacillus pumilus MCB-7 using response surface methodology Biocatalysis and Agricultural Biotechnology 5: pp 143-149 116 Rodriguez, J., J.L Copa-Patlfio, and M.L Pbtez-Leblic (1995) Purification and properties of a chitinase from Penicillium oxalicurn autolysates Letters in Applied Microbiology 20: pp 48-49 117 Rodriguez, J., M.J Santos, J.L Copa-Patino, and M.I Pesrez-Leblic (1993) Chitinolytic activity produced by Penicillium oxalicum in different culture media Letters in Applied Microbiology 16: pp 69-11 118 Rodriguez, J., M.J Stantos, J.L Copa-Patino, and M.I.P Leblic (1994) A β-Nacetylhexosaminidase from Penicillium oxalicum implicated in its cell-wall degradation Letters in Applied Microbiology 19: pp 217 - 220 119 Rohani, S (2010) Applications of the crystallization process in the pharmaceutical industry Chem Eng China 4(1): pp 2-9 120 Roy, I and M.N Gupta (2003) Applications of microwaves in biological sciences Current science 85: pp 1685-1693 101 121 Rudall, K.M and W Kenching (1973) Chitin System Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society 48(4): pp 597-605 122 Sabry, S.A (1992) Microbial degradation of shrimp shell waste J Basic Microbiol 32: pp 107-111 123 Sahai, A.S and M.S Manocha (1993) Chitinases of fungi and plants: Their involvement in morphogenesis and host-parasite interaction FEMS Microbiol Rev 11: pp 317-338 124 Saima, M.K., Rooh, I.Z Ahmad (2013) Isolation of novel chitinolytic bacteria and production optimization of extracellular chitinase Journal of Genetic Engineering and Biotechnology 11: pp 39-46 125 Salvatore, S.H.R., S Tomlin, S.E Davies, S Edwards, J.A Walker-Smith, I French, and S.H Murch (2000) A Pilot Study of N-Acetyl Glucosamine, a Nutritional Substrate for Glycosaminoglycan Synthesis, in Paediatric Chronic Inflammatory Bowel Disease Aliment Pharmacol Ther 14: pp 1567-1579 126 Sang-Lang, W., C Wun-Tsu, and L Ming-Chan (1995) Production oF chitinase by Pseudomonas aerogunisa K-187 using shrimp and crab shell powder as carbon source Proc Natl Sci Council Republic of China Part: Life Sci 19: pp 105-112 127 Sanjeev Kumar, Rohit Sharma, and R Tewari (2011) Production of N-Acetylglucosamine Using Recombinant Chitinolytic Enzymes Indian J Microbiol 51(3): pp 319-325 128 Sashiwa, H., S Fujishima, N Yamano, N Kawasaki, A Nakayama, E Muraki, and S Aiba (2001) Production of N-Acetyl-D-glucosamine from β-Chitin by Enzymatic Hydrolysis Chem Lett 31: pp 308-309 129 Sashiwa, H., S Fujishima, N Yamano, N Kawasaki, A Nakayama, E Muraki, K Hiraga, K Oda, and S Aiba (2002) Production oF N-Acetyl-D-glucosamine from α-chitin by Crude Enzymes from Aeromonas hydrophila H2330 Carbohydr Res 337: pp 557-559 130 Sayo, T., S Sakai, and S Inoue (2004) Synergestic effect of N-acetylglucosamine and retinoids on hyaluronan production in human keratinocytes Skin Pharmacol Physiol 17 pp 77-84 131 Scopes, R.K (1994) Protein purification principles and practice(3rd ed.) USA: Springer 132 Setthakaset, P., R Pichyangkura, A Ajavakom, and M Sukwattanasinitt (2008) Preparation of N-acetyl-D-Glucosamine Using Enzyme from Aspergillus sp Journal of Metals, Materials and Minerals 18(2): pp 53-57 133 Shadia, M.A.-A., F.E Mouafi, and A.A Keera (2012) Extracellular Metabolites Produced by a Novel Strain Bacillus alvel NRC-14: Molasses-Based Growth for High Production of Nacetylglucosamine Australian Journal of Basic and Applied Sciences 6(6): pp 252-261 134 Sherief, A.A., M.M.A EI-Sawah, and M.A Abdel-Naby (1991) Some properties of chitinase produced by potent Aspergillus carneus strain Appl Microbiol Biotechnol 35: pp 228-230 135 Shin, J.H., G.M Lee, and J.H Kim (1994) Comparison of cell disruption methods for determining β-galactosidase activity expressed in animal cells Biotechnol Technology 8(6): pp 425-430 136 Sikorski, P., Hori, R., & Wada, M (2009) Revisit of α-chitin crystal structure using high resolution x-ray diffraction data Biomacromolecules 10: pp 1100-1105 137 Sindhu, R and M Kuttiraja (2012) A novel surfactant-assisted ultrasound pretreatment of sugarcane tops for improved enzymatic release of sugars Bioresource Technology: pp 1- 138 Singh, A.K (2010) Optimization of culture conditions for thermostable chitinase production by Paenibacillus sp D1 Process Biochemistry 4(21): pp 2291-2298 139 Singh, A.K., G Mehta, and H.S Chhatpar (2009) Optimization of medium constituents for improved chitinase production by Paenibacillus sp D1 using statistical approach Journal of Applied Microbiology 49: pp 708-714 140 Singh, R., A Banerjee, and P Kaul (2005) Release of an enantioselective nitrilase from Alcaligenes faecalis MTCC 126: a comparative study Bioproc Biosys Eng 27(6): pp 415424 141 Smith, B.C (1996) Fundamentals of Fourier Transform Infrared Spectroscopy CRC Press: Boca Raton, FL, USA 102 142 Souza, R.F., R.C Gomes, R.R.R Coelho, C.S Alviano, and R.M.A Soares (2003) Purification and characterization of an endochitinase produced by Colletotrichum gloeosporioides FEMS Microbiology Letters 222: pp 45-50 143 Spellman, M.W., L.J Basa, C.K Leonard, J.A Chakel, J.V O'Connor, and S Wilson (1989) Carbohydrate Structures of Human Tissue Plasminogen Activator Expressed in Chinese Hamster Ovary Cells J Biol Chem 264: pp 14100-14111 144 Sukwattanasinitt, M., H Zhu, H Sashiwa, and S Aiba (2002) Utilization of commercial nonchitinase enzymes from fungi for preparation of 2-acetamido-2-deoxy-D-glucose from β-chitin Carbohydr Res 337 pp 133-137 145 Suresh, P.V., P.K.K Anil, and N.M Sachindra (2011a) Thermoactive β-Nacetylhexosaminidase production by a soil isolate of Penicillium monoverticillium CFR under solid state fermentation: parameter optimization and application for N-acetyl chitooligosaccharides preparation from chitin World J Microbiol Biotechnol 27(6): pp 14351447 146 Suresh, P.V and M Chandrasekaran (1999) Impact of process parameters on chitinase production by an alkalophilic marine Beauveria bassiana in solid state fermentation Process Biochem 34: pp 257-267 147 Suresh, P.V and P.K.A Kumar (2012) Enhanced degradation of α-chitin materials prepared from shrimp processing byproduct and production of N-acetyl-D-glucosamine by thermoactive chitinases from soil mesophilic fungi Biodegradation 23: pp 597-607 148 Synowiecki, J and N.A Al-Khateeb (2003) Production, properties and some new applications of chitin and its derivatives Crit Rev Food Sci Nutr 43(2): pp 145-171 149 Tagawa, K and K Okazaki (1991) Isolation and some cultural conditions of Streptomyces species which produce enzymes lysing Aspergillus niger cell wall J Ferment Bioeng 71: pp 230-236 150 Taherzadeh, M.J and K Karimi (2008) Pretreatment of Lignocellulosic Wastes to Improve Ethanol and Biogas Production: A Review International Journal of Molecular Sciences 9: pp 1621-1651 151 Takahashi, M., T Tsukiyama, and T Suzuki (1993) Purification and some properties of chitinase produced by Vibrio sp Journal of Fermentation and Bioengineering 75(6): pp 457559 152 Takayanagi, T.A., K.; Takiguchi, Y.; Shimahara, K (1991) Isolation and characterisation of thermostable chitinases from Bacillus licheniformis X-7U Biochem Biophy Acta 1078: pp 404-410 153 Talent, J and R Garcy (1996) Pilot study of oral polymeric N-acetylglucosamine as a potentil treatment for patients with osteoarthritis Clin Ther 18 pp 1184-1190 154 Tasharrofi, N., S Adrangi, M Fazeli, H Rastegar, M.R Khoshayand, and M.A Faramarzi (2011) Optimization of chitinase production by Bacillus pumilus using Plackett–Burman design and response surface methodology Iranian Journal of Pharmaceutical Research 10: pp 759-768 155 Taylor, G., S Jabaji-Hare, P Charest, and W Khan (2002) Purification and characterization of an extracellular exochitinase,β-N-acetylhexosaminidase, from fungal mycoparasite Stachybotrys elegans Can J Microbiol 48: pp 311-319 156 Toharisman, A., M.T Suhartono, M.S Barth, J.K Hwang, and Y.R Pyun (2005) Purification and characterization of a thermostable chitinase from Bacillus licheniformis Mb-2 World Journal of Microbiology & Biotechnology 21: pp 733-738 157 Tsujibo, I., I Orikoshi, H Tanno, K Fujimoto, I MIyamoto, and C Imada (1993) Cloning, sequence and expression of a chitinase gene from a marine bacterium, Alteromonas sp strain O-7 J Bacteriol 175: pp 176-181 158 Ueda, M., A Fujiwara, T Kawaguchi, and M Arai (1995) Purification and some properties of six chitinases from Aeromonas sp No 10S-24 Bioscience Biotechnology and Biochemistry 59: pp 2162-2164 159 Ulhoa, C.J and J.F Peberdy (1992) Purification and some properties of the extracellular chitinase produced by Trichoderma harzianum Enzyme Microb Technol 14: pp 236-241 103 160 Urszula, J., S.B Maria, and S Elżbieta (2012) Identification and characterization of a chitinase of Stenotrophomonas maltophilia,a bacterium that is antagonistic towards fungal phytopathogens Journal of Bioscience and Bioengineering 113(1): pp 30-35 161 Usui, T.H., Y.; Nanjo, F.; Ishido, Y (1984) Transglycosylation reaction of a chitinase purified from Nocardia orientails Biochem Biophy Acta 923: pp 302-339 162 Vaidya, R.J., S.I M, V.P R, and C.H S (2001) Production of chitinase and its optimization from a novel isolate Alcaligenes xylosoxydans: potential in antifungal biocontrol World J Microbiol Biotechnol 17: pp 691-696 163 Vyas, P.D., M.V (1989) Chitinase production by Myrothecium verrucaria and its significance in fungal mycelia degradation J Gen Microbiol 35: pp 343-350 164 Wang, S.L and W.T Chang (1997) Purification and characterization of two bifunctional chitinases/lysozymes extracellularly produced by Pseudomonas aeruginosa K-187 in a shrimp and crab shell powder medium Appl Environ Microbiol 63: pp 380-386 165 Wen, C.M., C.S Tseng, C.Y Cheng, and Y.K Li (2003) Purification, characterization and cloning of a chitinase from Bacillus sp NCTU2 Biotechnology and Applied Biochemistry 35(3): pp 213-219 166 West, P.A and R.R Colwell (1984) Identification and classification of Vibrionaceae: An overiew In: Colweii RR, editor Vibrios in the environment New York: John Wiley and Sons, Inc: pp 285-363 167 Wong, C Glucosamine, alternative medicine 2007; Available from: (http://altmedicine.about.com/cs/herbsvitaminsek/a/Glucosamine.htm) 168 Wu, T., S Zivanovic, and F ADraughon (2005) Physicochemical Properties and Bioactivity of Fungal Chitin and Chitosan J Agric Food Chem 53: pp 3888-3894 169 Wu, Y., Sasaki, T., Irie, S., & Sakurai, K (2008) A novel biomass-ionic liquid platform for the utilization of native chitin Polymer 49: pp 2321-2327 170 Wunderlich, B (2001) Thermal Analysis Encyclopedia of Materials: Science and Technology Elsevier Science Ltd., Oxford, UK: pp 9134-9141 171 Xia, J.L., J Xiong, R.Y Zhang, K.K Liu, B Huang, and Z.Y Nie (2011) Production of Chitinase and its Optimization from a Novel Isolate Serratia marcescens XJ-01 Indian J Microbiol 51(3): pp 301-306 172 Xu, Q (1997) Application of N-acetylglucosamine for preparing skin sanitary article preparations: CN patent NO 1156028 173 Xu, Q., J Liu, and Z Yuan (2004) Use of N-acetylglucosamine as additive in milk products: WO patent NO.2004 093556 174 Xu, Q., J Liu, and Z Yuan (2005) Use of N-acetylglucosamine in the manufacture of pharmaceutical useful for treating motion sickness US patent NO 6946452 B2 175 Xu, Q., J Liu, and Z Yuan (2006) Antibacterial composition of N-acetyl-Daminoglucosamine and antibiotic: EP patent NO 1669077 B2 176 Xu, Q., J Liu, and Z Yuan (2006) Use of N-acetyglucosamine in the manufacture of pharmaceutical useful for suppress side effect of radiotherapy and chemotherapy: US patent NO 7037904 177 Xu, Q., J Liu, and Z Yuan (2007) Use of N-acetylglucosamine in preparation of drugs for the treatment of cancer and metastasis EP patent NO 16660446 A1 178 Xu, Q., J Liu, and Z Yuan (2008) Use of N-acetylglucosamine in treatment of organ lesions related to toxicosis of drugs or chemicals: US patent NO 7345030 B2 179 Yabuki, M., K Mizushina, T Amatatsu, A Ando, T Fujii, M Shimada, and M Yamashita (1986) Purification and characterization of chitinase and chitobiase produced by Aeromonas hydrophila sub sp anaerogenes A52 The Journal of General and Applied Microbiology 32(1): pp 25-38 180 Yong, T., J Hong, L Zhangfu, Z Li, D Xiuqiong, T Ke, G Shaorong, and L Shigui (2005) Purification and characterization of an extracelluar chitinase produced by bactetium C4 Annals of Microbiology 55(3): pp 213-218 181 Young, M.E.B., R.L., and P.A Caroad (1985b) Kinetics of chitinase production: II Relation between bacterial growth, chitin hydrolysis, and enzyme synthesis Biochem Bioegg 27: pp 776-780 104 182 Yuli, P.E., M.T Suhartono, Y Rukayadi, J.K Hwang, and Y.R Pyunb (2004) Characteristics of thermostable chitinase enzymes from the Indonesian Bacillus sp.13.26 Enzyme Microb Technol 35: pp 147-153 183 Zeki, N.H and S.N Muslim (2010) Purification, Characterization and Antifungal Activity of Chitinase from Serratia marcescens Isolated from Fresh Vegetables Ibn Al - Haitham J For Pure and Appl Sci 23(1): pp 12-25 184 Zhou, S.N., C.Y Yang, Y.J Lu, L Huang, C.U Cai, and Y.C Lin (1999) Isolation and characterization of chitinase from marine bacterium Vibrio sp World Journal of Microbiology and Biotechnology 15(6): pp 745-746 105 PHỤ LỤC Phụ lục Mẫu nguyên liệu chitin A B C D E F Mũ ni thô 600 µm< Mũ ni < mm 425 µm< Mũ ni < 600 µm Mũ ni < 63 µm Sú thô Mực thô Phụ lục Thành phần môi trường tuyển chọn nuôi cấy P oxalicum 20B MT1 (PDA – Môi trường giữ giống) (g/l): Potato extra g; Saccarose 30 g; Agar 20 g; pH MT2 (Czapeck – Môi trường hoạt hóa giống) (g/l): NaNO3 g; K2HPO4 g; KCl 0,3 g; MgSO4.7H2O 0,5 g; Saccarose 30 g; FeSO4 0,01 g; pH MT3 (g/l) – Môi trường lỏng lên men sinh tổng hợp chitinase: Chitin g; Cao nấm men 10 g; K2HPO4 g; KH2PO4 g; MgSO4.7H2O 1,4 g; NaCl g; KCl g; CaCl2 0,1 g; pH 106 Phụ lục Đồ thị đường chuẩn NAG phương pháp DNS Phụ lục Đồ thị đường chuẩn BSA để xác định hàm lượng protein phương pháp Lowry Phụ lục Đồ thị đường chuẩn p-nitrophenyl N-axetyl-β-D glucosaminidase (pNP-NAG) Standard curve of pNP 1,6 y = 4,4174x + 0,078 R2 = 0,9992 1,4 1,2 OD Series1 0,8 Linear (Series1) 0,6 0,4 0,2 0 0,1 0,2 0,3 Concentration (mM) 107 0,4 Phụ lục Đặc tính phân đoạn enzym sau cô đặc 2, 3, lần E cô đặc 2L E cô đăc 3L E cô đặc 4L Phân đoạn Enzym E thô Ecd 2L Eqm 2L Ecd 3L Eqm 3L Ecd 4L Eqm 4L Tổng thể tích (ml) 1500 750 750 500 1000 375 1125 Hoạt độ riêng (U/mg protein) 0,339 0,309 0,136 0,305 0,176 0,299 0,235 Chitinase (U/ml) 0,078 0,142 0,007 0,194 0,009 0,239 0,013 Tổng chitinase (U) 117,461 106,857 4,894 97,000 9,299 89,727 14,683 HSTH chitinase (%) 100,000 90,972 4,167 82,581 7,917 76,389 12,500 NAHase (U/ml) 0,662 1,239 0,017 1,715 0,013 2,152 0,012 Tổng NAHase (U) 993,00 929,25 12,75 857,50 13,00 807,00 13,50 HSTH NAHase (%) 100,000 93,580 1,284 86,354 1,309 81,269 1,360 Endochitinase (U/ml) 5,147 8,802 0,945 11,271 1,178 12,695 1,258 Tổng Endochitinase (U) 7720,5 6601,5 708,750 5635,5 HSTH Endochitinase (%) 100,000 85,506 9,180 72,994 15,258 61,662 18,331 H/E 0,129 0,141 0,018 0,152 0,011 0,170 0,010 1178,000 4760,625 1415,250 Phụ lục Ảnh hưởng mức độ cô đặc dịch thủy phân đến HSTH NAG A Mức độ cô đặc dịch thủy phân khoảng 6,7 lần Bƣớc Thể tích (ml) Bx (%) Dịch thủy phân ban đầu 53,5 Dịch sau cô đặc Khối lƣợng (mg) NAG (mg/ml) NAG (mg) HSTH từ dịch thủy phân NAG (%) 2,2 9,756 521,95 100,00 12,2 61,97 495,76 94,98 Độ tinh NAG (%) Hạt kết tinh dịch sau cô đặc để 40C, 48h 400 4,24 0,81 1,06 Cặn sau kết tủa cồn 320 7,73 1,48 2,42 Kết tinh chế phẩm NAG sau loại cồn 502 427,96 81,99 85,25 33,90 6,50 Dịch không kết tinh 1,6 21,19 108 B Mức độ cô đặc dịch thủy phân khoảng 7,9 lần NAG (mg/ml) NAG (mg) HSTP NAG (%) 2,2 9,756 308,29 100,00 16,7 73,29 293,16 95,09 Bƣớc Thể tích (ml) Bx (%) Dịch thủy phân sau lọc dòng ngang 31,6 Dịch sau cô đặc Khối lƣợng (mg) Độ tinh NAG (%) Hạt kết tinh dịch cô đặc 264 2,92 0,95 1,11 Cặn sau kết tủa EtOH 192 4,71 1,53 2,45 Kết tinh chế phẩm NAG sau loại EtOH 280,1 247,75 80,36 88,45 25,34 8,22 NAG (mg/ml) NAG (mg) HSTP NAG (%) Dịch không kết tinh 1,08 23,46 C Mức độ cô đặc dịch thủy phân khoảng 10,2 lần Thể tích (ml) Bx (%) Dịch thủy phân sau lọc dòng ngang 39,6 2,2 9,756 386,34 100 Dịch sau cô đặc 3,9 19,1 94,27 367,65 95,16 Bƣớc Khối lƣợng (mg) Độ tinh NAG (%) Hạt kết tinh dịch cô đặc 335 4,21 1,09 1,26 Cặn sau kết tủa EtOH 238 6,75 1,75 2,84 Kết tinh chế phẩm NAG sau loại EtOH 336,1 301,76 78,11 89,78 38,28 9,91 Dịch không kết tinh 1,36 28,15 109 D Mức độ cô đặc dịch thủy phân khoảng 15,7 lần NAG (mg/ml) NAG (mg) HSTH NAG (%) 2,2 9,756 736,58 100,00 29,3 145,66 699,17 94,92 Bƣớc Thể tích (ml) Bx (%) Dịch thủy phân sau lọc dòng ngang 75,5 Dịch sau cô đặc 4,8 Khối lƣợng (mg) Độ tinh NAG (%) Hạt kết tinh dịch sau cô đặc 704 15,82 2,15 2,25 Cặn sau kết tủa cồn 457 17,89 2,43 3,91 Kết tinh chế phẩm NAG sau loại cồn 588,2 548,50 74,47 93,25 86,56 11,75 Dịch không kết tinh 2,7 32,06 Phụ lục Thủy phân gel chitin 40% dịch NAG với Bx = 2,2% Cơ chất Khối lƣợng (g) Nồng độ gel (%) Khối lƣợng gel (g) 1,04 40 0,416 ml gel chitin Chitin khô NAG theo tuyệt đối lý thuyết (mg) (mg) 16,06 17,45 Lƣợng NAG theo HPLC (mg) HSTP NAG (%) 15,605 89,43 Phụ lục Ảnh hưởng tỷ lệ EtOH/Dịch thủy phân cô đặc (Bx = 29,3%, V= 4,8 ml) tới NAG thất thoát vào kết tủa EtOH Tỷ lệ EtOH/Dịch thủy phân cô đặc Khối lƣợng cặn kết tủa (mg) Độ ẩm (%) Cặn kết tủa dịch cô đặc (mg/ml) Tổng cặn khô tuyệt đối (mg) NAG (mg) NAG thất thoát vào kết tủa (%) NAG kết tủa (%) 380,87 2,35 77,48 371,92 10,47 1,42 2,82 423,74 2,59 85,99 412,77 13,85 1,88 3,36 469,25 2,61 95,21 457,00 17,89 2,43 3,91 10 472,07 2,77 95,62 458,99 38,73 5,26 8,44 11 475,94 2,83 96,35 462,47 52,17 7,08 11,28 110 Phụ lục 10 Ảnh hưởng tỷ lệ EtOH/Dịch thủy phân cô đặc (Bx = 29,3%, V= 4,8 ml) tới HSTH NAG Độ tinh NAG NAG (mg) HSTH NAG từ dịch thủy phân (%) Độ tinh NAG (%) 656,65 502,1 68,17 76,46 2,49 615,88 521,4 70,79 84,66 603,52 2,54 588,19 548,5 74,47 93,25 10 605,54 2,59 589,86 550,6 74,75 93,34 11 609,72 2,53 594,29 555,3 75,39 93,44 Tỷ lệ EtOH/Dịch thủy phân cô đặc Chế phẩm NAG tinh thể (mg) Độ ẩm (%) NAG tinh thể khô tuyệt đối (mg) 673,56 2,51 631,61 Phụ lục 11 Ảnh hưởng tỷ lệ EtOH/Dịch thủy phân cô đặc (Bx = 29,3%, V= 4,8 ml) tới NAG thất thoát vào dịch không kết tich NAG (mg) NAG thất thoát vào dịch không kết tinh (%) NAG dịch không kết tinh (mg/ml) 56,16 140,4 19,06 56,16 2,6 44,95 116,87 15,87 44,95 2,7 32,06 86,562 11,75 32,06 10 2,5 25,17 62,925 8,54 25,17 11 2,3 19,49 44,827 6,09 19,49 Tỷ lệ EtOH/Dịch thủy phân cô đặc Thể tích dịch không kết tinh (ml) NAG (mg/ml) 2,5 Phụ lục 12 Kết phân tích tiêu E coli, Salmonella Pb, Hg, Cd Phụ lục 13 Kết xác định LD50 Phụ lục 14 Kết phân tích hàm lượng NAG HPLC 111 ... t n dụng ngu n chitin nhược điểm phương pháp 1.1.3.3 Phương pháp enzym Chitinase hệ enzym thủy ph n chitin để thu nh n NAG phương pháp enzym Ở qui mô công nghiệp l n, s n xuất NAG chitinase tinh... tinh Tuy nhi n chitinase tinh đắt kể từ chủng bi n đổi gen N n thực tế hay dùng enzym thô thu nh n NAG Ph n giải chitin thành NAG chitinase di n theo hai giai đo n Đầu ti n endochitinase (EC... phương pháp sinh học bắt đầu nghi n cứu sử dụng s n xuất chitin [14] Giáp xác ngu n nguy n liệu thủy s n chiếm 30 – 35% tổng lượng nguy n liệu Việt Nam Trong công nghiệp chế bi n thủy s n xuất khẩu,