Nghiên cứu ảnh hưởng của tiền xử lý chitin đến hiệu quả của quá trình thủy phân chitin bằng chitinase

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - HÀ QUANG TÙNG NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA TIỀN XỬ LÝ CHITIN ĐẾN HIỆU QUẢ CỦA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN CHITIN BẰNG CHITINASE LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – Năm 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - HÀ QUANG TÙNG NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA TIỀN XỬ LÝ CHITIN ĐẾN HIỆU QUẢ CỦA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN CHITIN BẰNG CHITINASE Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS LÊ THANH HÀ Hà Nội – Năm 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi Hà Quang Tùng, xin cam đoan nội dung luận văn với đề tài “Nghiên cứu ảnh hƣởng tiền xử lý chitin đến hiệu trình thủy phân chitin chitinase” công trình nghiên cứu thực hướng dẫn PGS.TS Lê Thanh Hà Các số liệu, kết trình bày luận văn hoàn toàn trung thực chưa công bố công trình khoa học khác LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, trước tiên xin gửi lời trân thành cảm ơn tới thầy cô giáo Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội tận tình giảng dạy, hướng dẫn suốt thời gian học tập nghiên cứu vừa qua Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Lê Thanh Hà, Nghiên Cứu Sinh Đặng Thị Hường tận tình giúp đỡ, trực tiếp bảo, hướng dẫn thời gian làm thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè tạo điều kiện, quan tâm, giúp đỡ, động viên góp ý cho suốt trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn! Học viên Hà Quang Tùng MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Chitin 1.1.1 Giới thiệu chitin 1.1.2 Cấu trúc tinh thể chitin 1.1.3 Tính chất chitin .7 1.1.4 Ứng dụng chitin 1.1.5 Các yếu tố tác động ảnh hưởng đến cấu trúc tinh thể chitin 1.2 Chitinase 12 1.2.1 Giới thiệu enzyme chitinase 12 1.2.2 Vai trò chitinase 12 1.2.3 Ứng dụng chitinase 13 1.2.4 Phân loại enzyme chitinase 13 1.2.5 Cơ chế xúc tác thủy phân chitin chitinase 14 1.2.6 Các nghiên cứu chitinase từ nấm mốc Penicillium 16 1.3 Tổng quan N-acetyl-D-glucosamine .17 1.3.1 Cấu trúc hóa học tính chất GlcNAc .17 1.3.2 Ứng dụng N-acetyl-D-glucosamine .18 1.3.3 Phương pháp thu nhận GlcNAc 20 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Nguyên liệu .22 2.2 Hóa chất 22 2.3 Thiết bị 22 2.4 Phƣơng pháp 23 2.4.1 Phương pháp chuẩn bị chitin huyền phù 23 2.4.2 Phương pháp thu nhận chế phẩm chitinase 23 2.4.3 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme chitinase .23 2.4.4 Phương pháp chạy sắc ký mỏng 24 2.4.5 Phương pháp xác định hàm ẩm nguyên liệu .24 2.4.6 Phương pháp xác định Nitơ tổng số (phương pháp Kjeldahl) 25 2.4.7 Phương pháp xác định hàm lượng protein (phương pháp Biuret) 26 2.4.8 Phương pháp xác định hàm lượng chitin nguyên liệu .27 2.4.9 Xác định hiệu suất thủy phân 27 2.4.10 Phương pháp nghiên cứu dùng xử lý nguyên liệu chitin 28 2.4.11 Phương pháp phân tích SEM (Scanning Electron Microscope) .30 2.4.12 Phương pháp phân tích HPLC (High Performance Liquid Chromatography) 30 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .31 3.1 Lựa chọn nguồn nguyên liệu chitin 31 3.2 Nghiên cứu ảnh hƣởng phƣơng pháp tiền xử lý đến hiệu thủy phân 32 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng phương pháp tiền xử lý vật lý .32 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng phương pháp tiền xử lý hóa học riêng rẽ hay kết hợp vật lý 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC 60 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT KÝ HIỆU TÊN ĐẦY ĐỦ GlcNAc, NAG N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc)2 Diacetyl-chitobiose (GlcNAc)3 Triacetyl-chitotriose DNS 3,5-dinitrosalicylic acid TLC Thin Layer Chromatography HPLC SEM High Performance Liquid Chromatography Scanning Electron Microscope DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số đặc tính hóa lý sinh học chitin phụ thuộc vào khối lượng phân tử trung bình (Mw) mức độ N-acetyl hóa (DA) [34] .7 Bảng 1.2 Điều kiện sản xuất chitinase lên men chìm từ số loại nấm 17 Bảng 2.1 Khảo sát điều kiện xử lý nhiệt, áp suất lên nguyên liệu chitin 28 Bảng 2.2 Các phân đoạn kích thước nguyên liệu chitin sử dụng 29 Bảng 2.3 Khảo sát điều kiện siêu âm nguyên liệu chitin 29 Bảng 3.1 Hàm lượng chitin loại nguyên liệu 33 Bảng 3.2 Kết định lượng hàm lượng dịch đường sau thủy phân HPLC (các mẫu khảo sát khối lượng mg) .43 Bảng PL1 Kết xây dựng đường chuẩn N-acetyl-D-glucosamine 60 Bảng PL2 Môi trường PDA (Nhân giữ giống) 62 Bảng PL3 Môi trường czapeck (môi trường hoạt hóa) 62 Bảng PL4 Môi trường MS chitin (môi trường lên men) 62 Bảng PL5 Ảnh hưởng kích thước chitin lên hiệu suất thủy phân .63 Bảng PL6 Ảnh hưởng chế độ siêu âm lên hiệu suất thủy phân chitin mũ ni 63 Bảng PL7 Ảnh hưởng siêu âm gián đoạn lên hiệu suất thủy phân 64 Bảng PL8 Khảo sát tác động siêu âm lên loại kích thước chitin mũ ni .64 Bảng PL9 Ảnh hưởng hóa chất lên hiệu suất thủy phân chitin mũ ni thô 65 Bảng PL10 Ảnh hưởng xử lý vật lý lên hiệu suất thủy phân chitin gel 65 Bảng PL11 Ảnh hưởng hóa chất lên hiệu suất thủy phân chitin gel 66 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu tạo Chitin .3 Hình 1.2 Ba dạng Cấu trúc chitin .4 Hình 1.3 Liên kết hydro nội phân tử chitin Hình 1.4 Liên kết hydro tinh thể α-chitin (a) β – chitin (b) Hình 1.5 Cấu trúc mạng tinh thể α-chitin theo mô tả Minke Blackwell Hình 1.6 Phân tích x – ray cấu trúc β – chitin (theo trục a, b) Hình 1.7 Cơ chế hoạt động chitinase 15 Hình 1.8 Cấu trúc hóa học GlcNAc 18 Hình 3.1 Hiệu suất thủy phân chitin tôm mũ ni, chitin tôm sú chitin mực 31 Hình 3.2 Ảnh hưởng kích thước chitin lên hiệu suất thủy phân 34 Hình 3.3 Ảnh hưởng chế độ siêu âm lên hiệu suất thủy phân chitin mũ ni 35 Hình 3.4 Kết sắc ký TLC từ dịch thủy phân chitin kích thước < 63µm .37 Hình 3.5 Ảnh hưởng siêu âm gián đoạn lên hiệu suất thủy phân 37 Hình 3.6 Khảo sát tác động siêu âm lên loại kích thước chitin mũ ni .38 Hình 3.7 Ảnh hiển vi điển tử quét loại nguyên liệu chứa chitin 39 Hình 3.8 Sắc ký đồ HPLC mẫu chuẩn 41 Hình 3.9 Sắc ký đồ HPLC dịch thủy phân 120 mẫu chitin 42 Hình 3.10 Ảnh hưởng nhiệt độ, áp suất lên hiệu suất thủy phân chitin mũ ni 44 Hình 3.11 Ảnh hưởng vi sóng lên hiệu suất thủy phân chitin mũ ni 45 Hình 3.12 Ảnh hưởng nhiệt, vi sóng lên hiệu suất thủy phân chitin mực 45 Hình 3.13 Ảnh hưởng nhiệt độ 1500C, áp suất 3,7 atm lên hiệu suất thủy phân .46 Hình 3.14 Ảnh hưởng hóa chất lên hiệu suất thủy phân chitin mũ ni thô 47 Hình 3.15 Ảnh hưởng hóa chất lên hiệu suất thủy phân chitin mũ ni nghiền 48 Hình 3.16 Ảnh hưởng hóa chất kết hợp siêu âm lên hiệu suất thủy phân 49 Hình 3.17 Ảnh hưởng xử lý vật lý lên hiệu suất thủy phân chitin gel 50 Hình 3.18 Ảnh hưởng hóa chất lên hiệu suất thủy phân chitin gel 50 Hình 3.19 Ảnh hưởng hóa chất lên hiệu suất thủy phân qua rửa chitin gel 51 Hình 3.20 Kết sắc ký TLC từ dịch thủy phân nguyên liệu gel 51 Luận văn thạc sĩ Hà Quang Tùng Các phương pháp siêu âm hóa học dùng Triton Urea không cải thiện hiệu suất thủy phân nguyên liệu chitin dạng gel KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu khảo sát thêm phương pháp xử lý nhiệt độ áp suất điều kiện xử lý cao hơn, hay áp dụng xử lý theo chế phương pháp nổ Công Nghệ Sinh Học 53 2013 - 2015 Luận văn thạc sĩ Hà Quang Tùng TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Đinh Minh Hiệp (2007), Hệ chitinase Trichoderma vai trò kiểm soát sinh học, Báo cáo chuyên đề nghiên cứu sinh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh Võ Thị Bích Viên (2009), Khảo sát đặc điểm sinh học số chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus Penicillium từ rừng ngập mặn cần TP Hồ Chí Minh, Luận văn thạc sĩ khoa học sinh học, Trường đại học sư phạm TP Hồ Chí Minh, tr.1-118 TIẾNG ANH 10 11 12 Abdulwadud Abdulkarim cộng (2013), "Extraction and Characterisation of Chitin and Chitosan from Mussel Shell", Civil and Environmental Research 3(2), tr 108 - 114 Adarsh K J Dr G Madhu (2014), "A Comparative Study on Metal Adsorption Properties of Different Forms of Chitosan", International Journal of Innovative Research in Science, Engineering and Technolog 3(2), tr 9609 - 9617 Aslak Einbu (2007), Characterisation of Chitin and a Study of its AcidCatalysed Hydrolysis, A thesis submittet inpartial fulfillment for the requirements for the academic title Ph.D, Department of Biotechnology, Norwegian University of Science and Technology, - 68 Azra Yuliana cộng (2012), The Effect of Sonication on The Characteristic of Chitosan, Proceeding of International Conference on Chemical and Material Engineering, - Bipin D Lade cộng (2014), "A Comprehensive Working, Principles and Applications of Thin Layer Chromatography", RJPBCS 5(4), tr 486-503 Black MM Schwarz HM (1950), "The estimation of chitin and chitin nitrogen in crawfish waste and derived products", Analyst 75, tr 185188 Boyer R F (1993), Modern experimental biochemistry, 2nd ed California, The Benjamin Cummings Publishing : 51-57 C P O’Donnell cộng (2010), "Effect of ultrasonic processing on food enzymes of industrial importance", Trends in Food Science and Technology 21(7), tr 358–367 C.K.S Pillai, Willi Paul Chandra P Sharma (2009), "Chitin and chitosan polymers: Chemistry, solubility and fiber formation", Progress in Polymer Science 34, tr 641-678 C.M Arnold Wu, Wayne A Bough J Ross Stevenson Effects of different species of crustaceans and spoilage conditions on the chemical and molecular weight characteristics of chitin/chitosan products, Marine Công Nghệ Sinh Học 54 2013 - 2015 Luận văn thạc sĩ 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Hà Quang Tùng Extension Service, University of Georgia and Department of Biological Sciences, Kent State University Charles A Haynes, Pedro Aloise Aimee Louise Creagh (1999), Process for producing N-acetyl-D-glucosamine, chủ biên, United States Patent, Patent Number: 5,998,173, tr - 26 Cheng-Ho Chen, Fang-Yu Wang Zu-Pei Ou (2004), "Deacetylation of beta-Chitin I Influence of the Deacetylation Conditions", Journal of Applied Polymer Science 93, tr 2416 -2422 Cohen-Kupiec cộng (1998), "The Molecular Biology of Chitin Digestion", Curr Opin Biotechnol 9, tr 270-277 D Raabe cộng (2007), "Preferred crystallographic texture of αchitin as a microscopic and macroscopic design principle of the exoskeleton of the lobster Homarus americanus", Acta Biomaterialia 3, tr 882-895 Debalina Basu Aditi Nag Chaudhuri (2013), "Purification and Characterization of chitinase from Thermophilic Staphylococcus sp", International journal of environmental sciences 4(4), tr 458 - 467 Eun Kyung Cho, In Soon Choi Young Ju Choi (2010), "Overexpression and characterization of thermostable chitinase from Bacillus atrophaeus SC081 in Escherichia coli", BMB reports, tr 193 198 Feisal Khoushab Montarop Yamabhai (2010), "Chitin Research Revisited", Marine Drugs 8, tr 1988-2012 Francisco J Alvarez (2014), "The Effect of Chitin Size, Shape, Source and Purification Method on Immune Recognition", Molecules 19, tr 4433-4451 Francisco Pires Avelelas (2013), Pilado add Value - valorisation of nontraditional marine resources, School of Tourism and Maritime Technology - Peniche, Polytechnic Institute of Leiria - Portugal, - 63 Fredrick Onyango Ogutu cộng (2015), "Ultrasonic Modification of Selected Polysaccharides-Review", J Food Process Technol 6(5), tr 1-8 Miller GL (1959), "Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar", Anal Chem 31, tr 426-428 Guadalupe Villa-Lerma cộng (2013), "Ultrasonication and steam-explosion as chitin pretreatments for chitin oligosaccharide production by chitinases ofLecanicillium lecanii", Bioresource Technology 146, tr 794-798 Hitoshi Sashiwa cộng (2003), "Enzymatic production of Nacetyl-D-glucosamine from chitin Degradation study of Nacetylchitooligosaccharide and the effect of mixing of crude enzymes", Carbohydrate Polymers 51, tr 391-395 Công Nghệ Sinh Học 55 2013 - 2015 Luận văn thạc sĩ 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 Hà Quang Tùng Inmaculada Aranaz cộng (2009), "Functional Characterization of Chitin and Chitosan", Current Chemical Biology 3, tr 203-230 Ipsita Roy, Kalyani Mondal Munishwar N Gupta (2003), "Accelerating Enzymatic Hydrolysis of Chitin by Microwave Pretreatment", Biotechnol Prog 19, tr 1648−1653 Ipsita Roy Munishwar Nath Gupta (2003), "Applications of microwaves in biological sciences", Current science 85, tr 1685 - 1693 Isao Karube cộng (1993), Enzymatic Decompostion Method Of Chitin-ConTaining Materials, chủ biên, United States Patent, Patent Number: 5,262,310 J Rodriguez, Copa Patino Perez Leblic (1995), "Purification and properties of a chitinase from Penicillium oxalicum autolystates", Letters in applied microbiology 20(1), tr 46-49 Jeen-Kuan Chen cộng (2011), "N-Acetyl Glucosamine Obtained from Chitin by Chitin Degrading Factors in Chitinbacter tainanesis", International Journal of Molecular Science 12, tr 11871195 Jeen-Kuan Chen, Chia-Rui Shen Chao-Lin Liu (2010), "NAcetylglucosamine: Production and Applications", Marine Drugs 8, tr 2493-2516 Jolanta Kumirska cộng (2010), "Application of Spectroscopic Methods for Structural Analysis of Chitin and Chitosan", Marine Drugs 8, tr 1567-1636 Jolanta Kumirska cộng (2011), "Biomedical Activity of Chitin/Chitosan Based Materials - Influence of Physicochemical Properties Apart from Molecular Weight and Degree of N-Acetylation", Polymers 3, tr 1875-1901 Jun-Ichi Kadokawa (2013), "Ionic Liquid as Useful Media for Dissolution, Derivatization, and Nanomaterial Processing of Chitin", Green and Sustainable Chemistry 3, tr 19-25 K Jamialahmadi cộng (2011), "Enzymatic Production of N Acetyl - Glucosamine from Chitin Using Crude Enzyme Preparation of Aeromonas sp PTCC1691", Biotechnology 10(3), tr 292 - 297 K Kurita cộng (2000), "Enzymatic degradation of beta-chitin: susceptibility and the influence of deacetylation", Carbohydrate Polymers 42, tr 19-21 Kasprzewska (2003), "Plant chitinase-Regulation and function", Cell Mol Biol Lett 8, tr 809-824 Keiko Shirai Matsumoto (2006), "Fungal chitinases", Advances in Agricultural and Food Biotechnology, tr 289-304 Kolla J.P Narayana Muvva Vijayalakshmi (2009), "Chitinase Production by Streptomyces sp ANU 6277", Braz J Microbiol 40(4 ), tr 725-733 Công Nghệ Sinh Học 56 2013 - 2015 Luận văn thạc sĩ 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 Hà Quang Tùng Lee cộng (1999), "Isolation and Characterization of Basic Exochitinase from Leaf Extract of Rehmannia glutinosa", Biosci Biotechnol Biochem 63, tr 1781-1783 Lee Yong-Hyun, Young-Ki Bae Eui-Jun Jeong (1996), "Enzymatic Hydrolysis of Crystalline Chitin in an Agitated Bead Reaction System and Its Reaction Characteristics", Journal of Microbiology and Biotechnology 6, tr 432-438 M.J Pianzzola, M Moscatelli S Vero (2004), "Characterization of Penicillium Isolates Associated with Blue Mold on Apple in Uruguay", Plant disease 88(1), tr 23-28 Maija Hakola (2013), Catalytic Pretreatments and Microwave Assisted Hydrolysis of Lignocellulosic Raw Materials, Laboratory of Inorganic Chemistry, Department of Chemistry, Faculty of Science, University of Helsinki, - 47 Marcin Wysokowski cộng (2015), "Poriferan Chitin as a Versatile Template for Extreme Biomimetics", Polymers 7, tr 235-265 Marguerite Rinaudo (2006), "Chitin and chitosan: Properties and applications", Prog Polym Sci 31, tr 603-632 Marina Duarte Pinto Lobo cộng (2013), "Expression and efficient secretion of a functional chitinase from Chromobacterium violaceum in Escherichia coli", BMC Biotechnology, tr (14726750/13/46) May Bente Brurberg cộng (2000), Chitinases from Serratia marcescens, The Norwegian Crop Research Institute, Agricultural University of Norway, University of Dundee, Dundee, Scotland Md Monarul Islam cộng (2011), "Preparation of Chitosan from Shrimp Shell and Investigation of Its Properties", International Journal of Basic & Applied Sciences 11(1), tr 77 - 80 Mohammad Amin T H Flowers (2004), "EVALUATION OF KJELDAHL DIGESTION METHOD ", J res Sci 15(2), tr 159-179 Mohammad J Taherzadeh Keikhosro Karimi (2008), "Pretreatment of Lignocellulosic Wastes to Improve Ethanol and Biogas Production: A Review", International Journal of Molecular Sciences 9, tr 1621-1651 Murat Kaya cộng (2014), "Bat guano as new and attractive chitin and chitosan source", Kaya et al Frontiers in Zoology 11:59, tr - 10 Narayanan Karthik cộng (2014), "Production, purification and properties of fungal chitinases-A review", Indian Journal of Experimental Biology 52, tr 1025-1035 Pankaj Patidar cộng (2005), "Optimisation of process parameters for chitinase production by soil isolates of Penicillium chrysogenum under solid substrate fermentation", Process Biochemistry 40, tr 2962-2967 Công Nghệ Sinh Học 57 2013 - 2015 Luận văn thạc sĩ 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 Hà Quang Tùng Parameswaran Binoda cộng (2005), "Production and purification of extracellular chitinase from Penicillium aculeatum NRRL 2129 under solid-state fermentation", Enzyme and microbital technology 36(7), tr 880-887 Phakapob SETTHAKASET cộng (2008), "Preparation of Nacetyl-D-Glucosamine Using Enzyme from Aspergillus sp", Journal of Metals, Materials and Minerals 18(2), tr 53-57 Qingsong Zhu cộng (2008), "Functional specialization among insect chitinase family genes revealed by RNA interference", PNAS 105(18), tr 6650 - 6655 R Di Giambattista cộng (2001), "The chitinolytic activity of Penicillium janthinellum P9: purification, partial characterization and potential applications", Journal of Applied Microbiology 91, tr 498-505 Rath Pichyangkura Application of chitin - chitosan from marine byproducts in Thailand, Biochemistry Department, Faculty of Science, Chulalongkorn University, Bangkok, Thailand, 70 - 75 Raveendran Sindhu cộng (2012), "A novel surfactant-assisted ultrasound pretreatment of sugarcane tops for improved enzymatic release of sugars", Bioresource Technology, tr - Reetarani S Patil, Vandana Ghormade Mukund V Deshpande (2000), "Chitinolytic enzymes: an exploration", Enzyme and Microbial Technology 26, tr 473- 483 Riccardo A A Muzzarelli, Mohamad El Mehtedi Monica MattioliBelmonte ( 2014), "Emerging Biomedical Applications of Nano-Chitins and Nano-Chitosans Obtained via Advanced Eco-Friendly Technologies from Marine Resources", marine drugs 12, tr 5468-5502 Richard Lucius cộng (2006), Molecular and immunological characterisation of Acanthocheilonema viteae chitinase, Prasident in Vertretung der Humboldt-Universitat zu Berlin, - 144 Roberts WA Selitrennikoff CP (1998), "Plant and bacterial chitinases differ in antifungal activity", J Gen Microbiol 134, tr 169-176 S E DARMON K M RUDAL (1950), Infra-red and x-ray studies of chitin, University of Leeds Saboki Ebrahim, K.Usha Bhupinder Singh (2011), Pathogenesis Related (PR) Proteins in Plant Defense Mechanism, Indian Agricultural Research Institute, New Delhi, India, 1043 - 1054 Sania M B de Andrade cộng (2012), "The Use of Exoskeletons of Shrimp (Litopenaeus vanammei) and Crab (Ucides cordatus) for the Extraction of Chitosan and Production of Nanomembrane", Materials Sciences and Applications 3, tr 495-508 Sanjeev Kumar, Rohit Sharma Rupinder Tewari (2011), "Production of N-Acetylglucosamine Using Recombinant Chitinolytic Enzymes", Indian J Microbiol 51(3), tr 319-325 Công Nghệ Sinh Học 58 2013 - 2015 Luận văn thạc sĩ 69 70 71 72 73 74 Hà Quang Tùng Seung Gon Wi, Yoon Gyo Lee Jae Chang Lee (2009), "Purification and properties of a chitinase from Penicillium sp LYG 0704", Protein Expression and Purification 65(2), tr 244-250 Shadia M Abdel-Aziz, Foukia E Mouafi Abeer A Keera (2012), "Extracellular Metabolites Produced by a Novel Strain Bacillus alvei NRC-14: Molasses-Based Growth for High Production of Nacetylglucosamine", Australian Journal of Basic and Applied Sciences 6(6), tr 251-261 Tim Staufenberger (2012), Chitinases in the tree of life Ecological, kinetic and structural studies of archaeal and marine bacterial chitinases, Zur Erlangung des Doktorgrades , der MathematischNaturwissenschaftlichen Fakultat, der Christian-Albrechts-Universitat zu Kiel, - 87 Tsuyoshi Ohno cộng (1996), "A Modular Family 19 Chitinase Found in the Prokaryotic Organism Streptomyces griseus HUT 6037", Journal of Bacteriology 178(17), tr 5065-5070 Tsuyoshi Uehara James T Park (2004), "The N-Acetyl-DGlucosamine Kinase of Escherichia coli and Its Role in Murein Recycling", JOURNAL OF BACTERIOLOGY 186(21), tr 7273-7279 Yoshihiro Shigernasa cộng (1994), "Enzymatic degradation of chitins and partially deacetylated chitins", Int J Biol Macromol 16(1), tr 43-49 Công Nghệ Sinh Học 59 2013 - 2015 Luận văn thạc sĩ Hà Quang Tùng PHỤ LỤC Xây dựng đƣờng chuẩn N-acetyl-D-glucosamine DNS N-acetyl-D-glucosamine tinh khiết (Sigma ,St.Louis, MO, USA) pha thành nồng độ khác thực phản ứng DNS với tỷ lệ DNS : mẫu : Phản ứng thực so màu bước sóng 540 nm Bảng PL1 Kết xây dựng đường chuẩn N-acetyl-D-glucosamine STT Nồng độ đường (mg/ml) Giá trị OD 540 nm 1 1,294 0,9 1,2 0,8 1,05 0,7 0,935 0,6 0,774 0,5 0,659 0,4 0,523 0,3 0,362 0,2 0,256 10 0,1 0,131 Công Nghệ Sinh Học 60 2013 - 2015 Luận văn thạc sĩ Hà Quang Tùng Hình PL1 Phương trình đường chuẩn N-acetyl-D-glucosamine Xây dựng đƣờng chuẩn BSA (bovin serum albumin) Hình PL2 Phương trình đường chuẩn BSA Công Nghệ Sinh Học 61 2013 - 2015 Luận văn thạc sĩ Hà Quang Tùng Thành phần số loại môi trƣờng Bảng PL2 Môi trường PDA (Nhân giữ giống) Thành phần Khối lượng (g/l) Potato extra 5,0 Saccarose 30 Agar 20 Bảng PL3 Môi trường czapeck (môi trường hoạt hóa) Thành phần Khối lượng (g/l) NaNO3 3,0 K2HPO4 1,0 KCl 0,3 MgSO4.7H2O 0,5 Saccaroza 30 FeSO4 0,01 Bảng PL4 Môi trường MS chitin (môi trường lên men) Thành phần Khối lượng (g/l) Chitin 4,0 Cao nấm men 10 K2HPO4 4,0 KH2PO4 2,0 MgSO4.7H2O 1,4 NaCl 1,0 KCl 1,0 CaCl2 0,1 Công Nghệ Sinh Học 62 2013 - 2015 Luận văn thạc sĩ Hà Quang Tùng Nghiên cứu ảnh hƣởng phƣơng pháp tiền xử lý đến hiệu thủy phân Bảng PL5 Ảnh hưởng kích thước chitin lên hiệu suất thủy phân Mẫu thủy phân Hiệu suất thủy 425µm < Mũ ni < 215µm < Mũ ni < Mũ ni thô 600µm 300µm 24 7,64 ± 2,10 24,64 ± 2,19 30,60 ± 1,89 48 11,62 ± 1,64 48,48 ± 2,33 59,36 ± 2,13 72 19,69 ± 1,38 54,69 ± 1,81 67,63 ± 1,23 96 25,24 ± 1,57 72,82 ± 1,54 79,98 ± 0,64 120 37,21 ± 2,71 80,83 ± 1,17 81,52 ± 1,35 phân (%) Bảng PL6 Ảnh hưởng chế độ siêu âm lên hiệu suất thủy phân chitin mũ ni Mẫu thủy phân Hiệu suất thủy Mũ ni < Mũ ni < Mũ ni < Mũ ni < Mũ ni < 63µm + siêu 63µm + 63µm + siêu 63µm + 63µm âm 60 phút enzyme + âm 120 phút enzyme + + enzyme siêu âm 60 + enzyme siêu âm 120 phân (%) phút phút 24 16,36 ± 0,30 19,58 ± 0,47 21,71 ± 0,67 19,87 ± 0,43 25,36 ± 0,80 72 41,03 ± 0,41 120 54,04 ± 0,35 57,98 ± 0,80 66,26 ± 0,89 62,69 ± 0,50 57,37 ± 0,64 168 69,49 ± 0,50 71,49 ± 0,43 74,52 ± 0,60 76,46 ± 0,52 75,34 ± 0,78 216 77,61 ± 0,35 80,06 ± 0,60 80,19 ± 0,95 83,82 ± 0,39 84,56 ± 0,36 Công Nghệ Sinh Học 47,90± 0,43 56,78 ± 0,78 47,99 ± 0,55 43,89 ± 0,65 63 2013 - 2015 Luận văn thạc sĩ Hà Quang Tùng Bảng PL7 Ảnh hưởng siêu âm gián đoạn lên hiệu suất thủy phân Mẫu thủy phân Hiệu suất thủy phân (%) 600µm < mũ ni < 600µm < mũ 600µm < mũ ni < 2mm + enzyme + siêu 2mm + enzyme + siêu ni < 2mm âm 60 phút âm 15 phút x lần 24 13,47 ± 0,71 16,04 ± 0,85 13,74 ± 0,95 72 26,93 ± 0,64 29,44 ± 0,71 34,67 ± 0,96 120 43,85 ± 0,64 46,23 ± 0,86 52,49 ± 1,00 168 46,56 ± 0,91 49,90 ± 0,91 55,40 ± 0,73 Bảng PL8 Khảo sát tác động siêu âm lên loại kích thước chitin mũ ni Hiệu suất thủy phân (%) Mẫu thủy phân 120 mũ ni thô 16,81 ± 0,96 mũ ni thô + enzyme + siêu âm 20 phút x lần 20,26 ± 1,05 600µm < Mũ ni < 2mm 33,27 ± 0,88 600µm < Mũ ni < 2mm + enzyme + siêu âm 20 phút x lần 44,7 ± 1,37 425µm < Mũ ni < 600µm 38,70 ± 0,98 425µm < Mũ ni < 600µm + enzyme + siêu âm 20 phút x lần Công Nghệ Sinh Học 59,19 ± 1,46 64 2013 - 2015 Luận văn thạc sĩ Hà Quang Tùng Bảng PL9 Ảnh hưởng hóa chất lên hiệu suất thủy phân chitin mũ ni thô Hiệu suất thủy phân (%) 72 96 120 14,13 ± 0,77 18,56 ± 1,04 20,26 ± 1,37 19,71 ± 1,88 24,07 ± 1,73 26,94 ± 1,14 24,79 ± 1,50 29,21 ± 1,32 32,84 ± 1,56 24,41 ± 1,62 29,58 ± 1,68 32,67 ± 1,82 121 độ, P = 1atm / 20 phút 24,68 ± 1,43 30 ± 1,30 32,97 ± 1,25 425µm < Mũ ni < 600µm 37,02 ± 1,84 39,18 ± 1,85 41,58 ± 1,04 Mẫu thủy phân mũ ni thô mũ ni thô + enzyme + siêu âm 20 phút x lần mũ ni thô + Triton 2% + khuấy nhiệt 100 độ / 60 phút mũ ni thô + Urea 2M + khuấy nhiệt 100 độ / 60 phút mũ ni thô + 0,1% H2SO4 + T = Bảng PL10 Ảnh hưởng xử lý vật lý lên hiệu suất thủy phân chitin gel Mẫu thủy phân Hiệu suất thủy phân (%) 24 28 gel không xử lý 92,52 ± 3,34 93,12 ± 2,15 gel + vi sóng 60 giây 91,51 ± 3,20 93,32 ± 2,77 gel + enzyme + siêu âm 20 phút x lần 92,28 ± 3,31 93,84 ± 2,10 gel + T = 100 độ / 20 phút 91,19 ± 4,00 93,10 ± 2,73 gel + T = 121 độ, P = 1atm / 20 phút 91,8 ± 3,44 93,48 ± 3,00 Công Nghệ Sinh Học 65 2013 - 2015 Luận văn thạc sĩ Hà Quang Tùng Bảng PL11 Ảnh hưởng hóa chất lên hiệu suất thủy phân chitin gel Mẫu thủy phân Hiệu suất thủy phân (%) 24 28 gel không xử lý 92,52 ± 3,34 93,12 ± 2,15 gel chứa Urea 0.2 M 80,86 ± 2,46 82,45 ± 1,62 gel chứa Urea 0.1 M 85,95 ± 1,89 86,87 ± 1,50 gel chứa Urea 0.05 M 89,77 ± 2,24 92,18 ± 1,21 Một số phân đoạn chitin sau xử lý nghiền Hình PL3 Các loại kích thước nguyên liệu chitin mũ ni A Mũ ni thô C 425µm