Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu nhằm khảo sát điều kiện nuôi cấy nấm Monascus pupureus nhằm thu nhận sinh khối giàu monacolin K. Nhiều nghiên cứu cho thấy nấm nonascus tạo ra sản phẩm trao đổi chất có giá trị thương mại như: Chất màu thực phẩm, monacolin K, kháng sinh và chất chống oxy hóa.
Trang 1KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VI NẤM MONASCUS PURPUREUS
ĐỂ THU SINH KHỐI GIÀU MONACOLIN K
Vũ Thanh Thảo*, Huỳnh Bái Nhi*, Cao Thị Hồng Gấm*, Trần Cát Đông*
TÓM TẮT
Mở đầu: Vi nấm Monascus được sử dụng từ rất lâu trong các thực phẩm truyền thống ở các nước Châu Á
để làm chất màu Nhiều nghiên cứu cho thấy nấm Monascus tạo ra sản phẩm trao đổi chất có giá trị thương mại như: chất màu thực phẩm, monacolin K, kháng sinh và chất chống oxy hóa
Mục tiêu: Khảo sát điều kiện nuôi cấy nấm Monascus pupureus nhằm thu nhận sinh khối giàu monacolin K Phương pháp: Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của chế độ nhiệt độ và độ ẩm ban đầu trên môi trường nền là
gạo đến hàm lượng monacolin K Tiếp theo khảo sát chất nền và sau đó tối ưu hóa môi trường nuôi cấy theo phương pháp Taguchi bằng cách khảo sát các nguồn dinh dưỡng bổ sung bao gồm nguồn carbon (ethanol, glucose), nguồn nitơ (NH 4 Cl, bột ngọt (MSG), NaNO 3 ), chất béo (glycerol, dầu đậu nành, dầu oliu) và muối khoáng (MgSO 4 , CaCO 3 , NaCl) Hàm lượng monacolin K trong sinh khối được đánh giá bằng phương pháp sắc
ký lỏng cao áp (HPLC)
Kết quả: Chế độ nhiệt thích hợp là nuôi Monascus purpureus là duy trì ở 30 o C trong 2 ngày đầu và ở 26 o C trong 14 ngày sau, độ ẩm thích hợp là 65% Môi trường tối ưu cho nấm sinh monacolin K cao là môi trường có chất nền là gạo, bổ sung thêm etanol 0,3%, NH 4 Cl 0,5%, glycerol 0,5% và NaCl 0,1%
Kết luận: Đã xác định được điều kiện tối ưu trên môi trường rắn để Monascus purpureus sản xuất
monacolin K với hàm lượng cao hơn gấp 3 lần so với phương pháp nuôi cấy truyền thống
Từ khóa: Monascus, monacolin K, lên men rắn, sắc ký lỏng cao áp
ABSTRACT
INVESTIGATION OF MONASCUS PURPUREUS CULTURE CONDITIONS
FOR PRODUCING MONACOLIN K RICH BIOMASS
Vu Thanh Thao, Huynh Bai Nhi, Cao Thi Hong Gam, Tran Cat Dong
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No 1 - 2011: 195 - 201
Background: Monascus has been used long time ago in traditional food products in Asia as food colouring
agent Many studies have shown that Monascus produce commercially valuable metabolites including food colorants, cholesterol-lowering agents, antibiotics and antioxidants
Objectives: To optimize the growth condition of Monascus purpureus for production of monacolin K-rich
biomass
Methods: Affect of temperature scheme and initial moisture on production of monacolin K were
investigated The basal subtrate and culture conditions including 4 factors carbon, nitrogen, oil and salt sources were optimized by Taguchi method for the production of monacolin K The monacolin K level were measuring by HPLC
Results: The optimal temperature scheme during solid-state fermentation is 30 o C for 2 days and maitained
at 26 o C for 14 days Initial moisture of the solid medium is best around 65% The optimum culture medium is rice with the addition of 0.3% ethanol, 0.5% NH 4 Cl, 0.5% glycerol and 0.1% NaCl
Trang 2Conclusion: The optimized solid-state fermentation conditions were defined Using optimal culture
conditions in cultivating, the yield of monacolin K in the fermentation process was three times higher than the traditional conditions
Keywords: Monascus, monacolin K, solid fermentation, HPLC
ĐẶT VẤN ĐỀ
Monascus hay “nấm gạo đỏ” đã được sử
dụng ở Trung Quốc và các nước Đông Nam Á
từ hàng ngàn năm nay Monascus được biết đến
với nhiều ứng dụng rộng rãi trong sản xuất màu
thực phẩm tự nhiên, dùng làm thuốc chữa bệnh
Các nghiên cứu cho thấy rằng tác dụng làm
thuốc của Monascus chủ yếu nhờ các sản phẩm
chuyển hóa thứ cấp của quá trình lên men
Monascus Trong đó sản phẩm bậc hai được chú
ý đến nhiều nhất là monacolin K (C24H36O5) với
3-hydroxy-3methylglutaryl-coenzym A reductase
(HMG-CoA reductase), enzym này xúc tác phản ứng
chuyển HMG-CoA thành mevalonat trong quá
trình tổng hợp cholesterol, đặc biệt là các
lipoprotein tỉ trọng thấp gây hại cho cơ thể
Monacolin K tồn tại ở 2 dạng chính: dạng
hydroxy acid và dạng lacton(3,7) Tỉ lệ dạng acid
và dạng lacton tùy thuộc vào loài Monascus, điều
kiện nuôi cấy và pH khác nhau(7,9) Dạng có hoạt
tính sinh học là dạng hydroxyl acid, còn dạng
lacton khi vào cơ thể sẽ được enzym chuyển hóa
thành dạng hyroxyl acid Năm 1998, Cục Quản
lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ (FDA) cho
phép ứng dụng monacolin K chiết xuất từ
Monascus trong dược phẩm, từ đó các nghiên
cứu về Monascus hướng đến việc nâng cao lượng
monacolin K tạo ra từ chủng nấm này Mục tiêu
của nghiên cứu này là khảo sát điều kiện nuôi
cấy nấm Monascus purpureus cũng như môi
trường tối ưu để thu sinh khối nấm giàu
monacolin K
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Hóa chất, dung môi, môi trường
Các loại dung môi: etanol, acetonitril, acid
trifloacetic (TFA) do Merck cung cấp
Hóa chất: NH4Cl, monosodium glutamat (MSG), NaNO3, glycerol, MgSO4, CaCO3, glucose do Xilong, Trung Quốc cung cấp
Chất chuẩn: monacolin K (Sigma)
Môi trường nuôi cấy: PDA (potato dextrose agar), PDB (potato dextrose broth) do Merck cung cấp
Gạo, củ từ tươi: được mua từ siêu thị tại địa phương
Nấm Monascus và nhân giống
Đối tượng nghiên cứu là chủng nấm
Monascus purpureus được phân lập từ gạo đỏ bởi
Phòng thí nghiệm Vi Sinh Công Nghệ Dược, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM Chủng nấm được duy trì trên thạch nghiêng PDA và được cấy truyền sau 30 ngày
Nhân giống cấp 1: Cấy nấm từ thạch đĩa PDA
(5x103 bào tử/ml) vào môi trường PDB, lắc 150 vòng/phút, trong 3 ngày
Chuẩn bị môi trường: Cân 100g gạo, ngâm
trong 9 giờ, cho vào mỗi hộp nuôi cấy, thêm một
ít nước rồi đem hấp tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút
Nuôi nấm tạo sản phẩm thứ cấp: Cấy giống cấp 1 (107 bào tử/ml) vào các hộp môi trường khảo sát ở tỷ lệ 10% (v/w)
Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm
Khảo sát độ ẩm của môi trường nuôi cấy từ
50, 55, 60, 65, 70, 75%, với môi trường nền là gạo Hấp tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút Sau khi hấp tiến hành điều chỉnh độ ẩm cần khảo sát Nuôi nấm ở nhiệt độ 30oC trong 2 ngày, sau đó duy trì ở 26oC trong 14 ngày Định lượng monacolin K từ các mẫu này, chọn độ ẩm cho lượng monacolin K cao nhất(9)
Trang 3Khảo sát ảnh hưởng của chế độ nhiệt độ
khác nhau
Khảo sát sự ảnh hưởng của 5 chế độ nhiệt độ
khác nhau đến sự sản sinh chất chuyển hóa của
nấm M purpureus trên môi trường chất nền là
gạo: (I): Nuôi ở 30oC trong 16 ngày.(II): Nuôi ở
26oC trong 16 ngày (III): Nuôi ở 30oC trong 2
ngày, sau đó duy trì ở 26oC trong 14 ngày (IV):
Nuôi ở 32oC trong 2 ngày, sau đó duy trì ở 26oC
trong 14 ngày (V): Nuôi ở 28oC trong 2 ngày, sau
đó duy trì ở 26oC trong 14 ngày Nuôi nấm ở
điều kiện độ ẩm tối ưu đã khảo sát Định lượng
monacolin K từ các mẫu này, chọn chế độ nhiệt
độ thích hợp nhất(9)
Khảo sát cơ chất nền
Theo các tài liệu tham khảo(4,5), gạo và củ từ
là hai chất nền để nuôi cấy Monascus Trong đó,
chất nền là gạo được sử dụng phổ biến và lâu đời Và gần đây chất nền là dioscorea cũng được chứng minh thích hợp cho cho việc sản xuất monacolin K Do đó chúng tôi tiến hành khảo sát trên hai loại chất nền này ở nhiệt độ và độ ẩm tối
ưu Sau đó định lượng monacolin K để chọn chất nền tối ưu
Khảo sát các chất bổ sung ảnh hưởng đến việc tạo monacolin K
Bảng 2 Thành phần môi trường thử nghiệm
(A) Nguồn Cacbon Yếu tố
Cấp độ Ethanol Glucose (B) Nguồn Nitơ 0,5% (C) Chất béo 0,5% (D) Muối khoáng 0,1%
Áp dụng phương pháp Taguchi(2) để tối ưu
hóa môi trường nuôi cấy cho M purpureus sinh
monacolin K Các nhân tố khảo sát gồm các
nguồn carbon (ethanol, glucose), nguồn nitơ
(NH4Cl, MSG, NaNO3), chất béo (glycerol, dầu
đậu nành, dầu oliu) và chất khoáng (MgSO4,
CaCO3, NaCl) được bổ sung với các nồng độ
khác nhau (Bảng 1) vào chất nền tốt nhất đã
khảo sát ở trên Sau đó tiến hành nuôi nấm ở
nhiệt độ và độ ẩm tối ưu Đây là các nguồn
sinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và sản
sinh chất chuyển hóa thứ cấp của nấm
Monascus sp.(1)
Tiến hành 9 thí nghiệm với sự bố trí theo
phương pháp Taguchi (Bảng 2), và dựa vào tỉ
lệ S/N của các cấp độ để xác định điều kiện tối
ưu cho M purpureus sinh monacolin K Với 2
loại nguồn carbon bổ sung (ethanol và
glucose) có tổng cộng 18 thử nghiệm tương
ứng với 18 môi trường
Bảng 3 Bố trí thí nghiệm theo phương pháp
Taguchi (2)
Thử nghiệm
A (hay A’) Nguồn carbon
B Nguồn Nitơ
C Chất béo
D Khoáng
Trong đó: Nguồn carbon: A1 =ethanol 0,3%; A2 =ethanol 0,5%; A3 =ethanol 0,7%; A’1 =glucose 0,5%; A’2 =glucose 1%; A’3 =glucose 2%; Nguồn nitơ 0,5%: B1 = NH 4 Cl, B2
= MSG, B3 = NaNO 3; Chất béo 0,5%: C1 = glycerol, C2 = dầu đậu nành, C3 = dầu oliu.; Khoáng 0,1%: D1 = MgSO 4 , D2 = CaCO 3 , D3 = NaCl
Với 9 cách phối hợp theo phương pháp Taguchi, chúng tôi có 9 môi trường thử nghiệm
Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N ratio, η) của mỗi môi trường được tính toán từ các dữ liệu thí nghiệm theo công thức sau:
Trang 4Trong đó: y i là giá trị của môi trường thử nghiệm lần thứ
i; n là số lần lặp lại thử nghiệm (n=2).
Dựa vào giá trị S/N (η) của từng môi trường
để tính giá trị S/N của từng cấp độ theo phương
pháp Taguchi
Thu sinh khối và chiết tách monacolin K
Sau 16 ngày nuôi cấy, tiến hành đông khô
sinh khối nấm, tán thành bột mịn, bảo quản sinh
khối ở 4oC đến khi chiết monacolin K
Qui trình chiết (6): Cân 0,5g bột sinh khối, thêm
8 ml ethanol 75%, tán trong bể siêu âm 30 phút,
sau đó ly tâm ở tốc độ 3000 rpm trong 10 phút,
hút lấy dịch nổi Chiết lại thêm 2 lần gộp dịch
nổi của 3 lần chiết vào bình định mức 25 ml, bổ
sung ethanol 75% vừa đủ 25ml Đem lọc qua
màng 0,45µm rồi phân tích bằng sắc ký lỏng cao
áp (HPLC)
Định lượng monacolin K
Điều kiện sắc ký
Cột Europher RP 18 (150 x 4,6mm, 5µm), đầu
dò UV-vis, thể tích bơm mẫu 20 µl, tốc độ dòng
1 ml/phút Pha động: gradient tiệm tiến của
acetonitril (dung môi A) và TFA 0,1% (dung môi
B) như sau: 20 phút đầu tăng từ 35-75% A, phút 20-28 giữ nguyên 75% A, sau đó giảm về 35% A Tổng thời gian phân tích là 35 phút Bước sóng phát hiện 237 nm(6)
Dựng đường chuẩn monacolin K
Để định lượng monacolin K trong mẫu nấm, tiến hành dựng đường chuẩn của 2 dạng monacolin K chuẩn (Sigma): dạng lacton và dạng hydroxyl acid theo giai nồng độ từ 0 – 200 mg/L Phương trình thu được từ hai dạng đường chuẩn trình bày trong bảng sau:
Bảng 4 Phương trình tuyến tính của monacolin K
dạng lacton và hydroxyl acid
Dạng monacolin
K Phương trình tuyến tính Hệ số tương quan (R 2 )
Hydroxyl acid y = 96,117x 0,9867
KẾT QUẢ Định lượng monacolin K
Từ sắc ký đồ monacolin K chuẩn (Hình 1) cho thấy, monacolin K dạng hydroxyl acid chuẩn có thời gian lưu là 12,1 phút, và monacolin K dạng lacton chuẩn có thời gian lưu
là 15,7 phút
Đ
(a)
1
0 0,2 0,4 0,6 0,8
MK hydroxyl acid
0 0,2 0,4 0,6
0,8
MK hydroxyl acid
MK lacton
Thời gian (phút)
(b)
Hình 3 Sắc ký đồ của monacolin K (MK) chuẩn (a), và sắc ký đồ định lượng monacolin K từ mẫu nấm (b)
Trang 5Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm
Dựa vào đồ thị hình 2, chúng tôi nhận thấy,
hàm lượng monacolin K tăng dần từ độ ẩm 50%
đến 65% và sau đó giảm dần từ độ ẩm 65% đến
75%, như vậy độ ẩm thấp (dưới 60%) hoặc cao
(trên 70%) đều làm giảm hàm lượng monacolin
K Hàm lượng này đạt giá trị cao ở khoảng độ
ẩm 60-65%, trong đó cao nhất ở độ ẩm 65%
(965,65 µg/g sinh khối khô (SKK))
204,60
479,35
868,55 965,65
511,06 405,46
0
200
400
600
800
1000
1200
50 55 60 65 70 75
Độ ẩm (%)
Hình 4 Ảnh hưởng của độ ẩm đến hàm lượng
monacolin K
Khảo sát ảnh hưởng của chế độ nhiệt độ
khác nhau
Nấm Monascus purpureus được nuôi cấy ở
các chế độ nhiệt độ khác nhau, trên môi trường
nền là gạo với độ ẩm tối ưu là 65% Hàm lượng
monacolin K trong sinh khối nấm ở các chế độ
nhiệt khác nhau được trình bày trong hình 3
331,36
711,71
979,08
823,19
538,67
0
200
400
600
800
1000
1200
Hình 5 Ảnh hưởng của chế độ nhiệt độ đến hàm lượng
monacolin K (I): Nuôi ở 30 o C trong 16 ngày; [II]: Nuôi ở
26 o C trong 16 ngày; (III): Nuôi ở 30 o C trong 2 ngày sau đó
duy trì ở 26 o C trong 14 ngày; (IV): Nuôi ở 32 o C trong 2
ngày, sau đó duy trì ở 26 o C trong 14 ngày; (V): Nuôi ở
Dựa vào hình 3, hàm lượng monacolin K
chênh lệch đáng kể khi nuôi M purpureus ở các
chế độ nhiệt khác nhau Ở chế độ nhiệt III,
Monascus tạo monacolin K cao nhất (979,08 µg/g
SKK), tiếp theo là chế độ nhiệt IV (823,19 µg/g SKK), II (711,71 µg/g SKK), V (538,67 µg/g SKK),
và thấp nhất ở chế độ nhiệt I (331,36 µg/g) Như vậy, yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng nhiều đến sự tạo monacolin K
Khảo sát chất nền tối ưu
Khảo sát hàm lượng monacolin K trên 2 loại chất nền gạo và củ từ Kết quả được trình bày trong Hình 4 Ta nhận thấy khi nuôi nấm trên môi trường gạo thì hàm lượng monacolin K thu được (973,58 µg/g SKK) cao hơn gấp 3 lần so với
củ từ (319,09 µg/g SKK) Do đó, chúng tôi chọn
là gạo làm chất nền để khảo sát môi trường dinh dưỡng tối ưu theo phương pháp Taguchi
973,58
319,09
0 200 400 600 800 1000 1200
Chất nền
Hình 6 Hàm lượng monacolin K trên 2 loại chất nền
Khảo sát các nguồn dinh dưỡng bổ sung
Dựa vào phương pháp Taguchi, với 2 loại nguồn carbon bổ sung (ethanol và glucose), tiến hành 18 thử nghiệm tương đương với 18 môi trường được trình bày trong bảng sau:
Bảng 5 Hàm lượng monacolin K và tỉ lệ S/N tương
ứng của các môi trường
Nguồn C ethanol Nguồn C glucose STT
Lượng ( μg/g) S/N STT Lượng ( μg/g) S/N
Trang 6Nguồn C ethanol Nguồn C glucose
STT
Lượng ( μg/g) S/N STT Lượng ( μg/g) S/N
Bảng 6 Tỉ lệ S/N của các cấp độ trong thử nghiệm
trên các môi trường
Tỉ lệ S/N của monacolin K Yếu tố Cấp độ
Ethanol Glucose
A1 (ethanol 0,3%) 68,07 *
A2 (ethanol 0,5%) 66,03 *
A3 (ethanol 0,7%) 63,67 *
A’1 (glucose 0,3%) * 66,26
A’2 (glucose 0,5%) * 66,59
A
(nguồn
carbon
0,5% )
A’3 (glucose 0,7%) * 67,83
B
(nguồn
nitơ
C1 (glycerol) 65,94 66,56
C2 (dầu đậu nành) 66,05 67,13
C (chất
béo
0,5%) C3 (dầu oliu) 65,79 67
D
(muối
khoáng
TB: 65,92 TB: 66,89
Dựa vào đồ thị biểu diễn kết quả thử nghiệm
Taguchi (hình 5), các nhân tố B, C, D tương ứng
với các nguồn nitơ, chất béo và muối khoáng
đều có xu hướng như nhau khi thử nghiệm trên
2 nguồn carbon khác nhau Nguồn nitơ thì
NH4Cl (B1) có tác động tốt nhất đối với monacolin K ở cả 2 thử nghiệm Trong khi đó, chất béo không ảnh hưởng nhiều đến quá trình sinh monacolin K Trong 3 loại muối khoáng thì NaCl (D3) có ảnh hưởng tốt nhất đối với sự tạo monacolin K Còn đối với nguồn C là ethanol, khi nồng độ ethanol giảm (A3→A2→A1) thì hàm lượng monacolin K tăng, ethanol 0,3% (A1) cho hàm lượng monacolin K cao nhất, đến ethanol 0,5% (A2), thấp nhất là ethanol 0,7% (A3) Ngược lại, khi nguồn C là glucose, nồng độ glucose tăng (A1→A2→A3) thì làm tăng hàm lượng monacolin K
Như vậy, nguồn carbon bổ sung là ethanol
và glucose đều kích thích nấm tạo nhiều monacolin K Kết quả này tương tự với nghiên cứu của tác giả Wang và cộng sự, 2003(8) ; Lee và cộng sự, 2007(4) Tuy nhiên, nguồn C là ethanol 0,3% (A1) thì kích thích nấm tạo ra monacolin K nhiều hơn so với nguồn C là glucose 0,7% Ngoài
ra, theo Lee (2007)(4), ethanol còn có tác dụng làm giảm lượng citrinin (một độc tố do Monacus sinh
ra trong quá trình phát triển) Vì vậy, chúng tôi
chọn môi trường nuôi cấy tối ưu cho Monascus
purpureus sinh monacolin K là các yếu tố: A1
(ethanol 0,3%), B1 (NH4Cl), C1 (glycerol), D3 (NaCl)
Monacolin K
62,00
64,00
66,00
68,00
70,00
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 D1 D2 D3
Các cấp độ của thử nghiệm
Monacolin K
62,00 64,00 66,00 68,00 70,00
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 D1 D2 D3
Các cấp độ của thử nghiệm
Nguồn C là Ethanol
Nguồn C là Glucose
,
Hình 7 Ảnh hưởng của các nhân tố môi trường đến khả năng sinh monacolin K Nguồn C: A1=ethanol
0,3%, A2=ethanol 0,5%, A3=ethanol 0,7%; A’1= glucose 0,3%, A’2=glucose 0,5%, A’3=glucose 0,7% Nguồn Nitơ: B1=NH 4 Cl, B2=MSG, B3=NaNO 3 Chất béo: C1=glycerol, C2=dầu đậu nành, C3=dầu oliu Muối: D1=MgSO 4 , D2=CaCO 3 , D3=NaCl
Trang 7So sánh hàm lượng monacolin K trong
điều kiện nuôi cấy tối ưu và truyền thống
Phương pháp nuôi cấy nấm Monascus truyền
thống là nuôi trên chất nền gạo và không bổ
sung thêm các nguồn dinh dưỡng khác, chính là
điều kiện nuôi cấy nấm trong quá trình khảo sát
nhiệt độ và độ ẩm Theo kết quả của khảo sát
nhiệt độ và độ ẩm ở trên thì ở độ ẩm 65% và chế
độ nhiệt III (30ºC trong 2 ngày đầu và duy trì
26ºC trong 14 ngày sau) hàm lượng monacolin K
thu được khoảng 970 (μg/g)
Bảng 7 Hàm lượng monacolin K thu được ở điều
kiện nuôi cấy tối ưu hóa và truyền thống
Phương pháp nuôi cấy Monacolin K ( μg/g)
Như vậy, quá trình tối ưu hóa điều kiện nuôi
cấy nấm M purpureus đã làm tăng hàm lượng
monacolin K lên gấp 3 lần so với phương pháp
nuôi cấy truyền thống
KẾT LUẬN
Tóm lại, kết quả thử nghiệm cho thấy điều
kiện nuôi cấy tối ưu cho Monascus purpureus sinh
monacolin K cao nhất (2972,11 μg/g) là trên môi
trường nền là gạo có bổ sung thêm ethanol 0,3%,
NH4Cl 0,5%, glycerol 0,5% và NaCl 0,1% với độ
ẩm ban đầu là 65%, nuôi ở nhiệt độ 30 oC trong 2
ngày đầu và duy trì ở 26 oC trong 14 ngày sau
Các thông số khảo sát này sẽ là tiền đề cho việc ứng dụng sản xuất ở quy mô lớn sau này
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 A Illanes, Ruiz A., et al (1990) Immobilization of lactase for the continuous hydrolysis of whey permaete Bioprocess Engineering ( 5): 257- 262
2 Chung C C., Chen H H (2007) Application of the Taguchi
method to optimize Monascus spp Culture Food Process
Engineering 30: 241-254
3 Endo A (1979) Monacolin K, a new hypocholesterolemic
agent produced by a Monascus species J Antibiotics 32:
852-854
4 Lee C L., Hung H K., et al (2007) Improving the ratio of
monacolin K to citrinin production of Monascus purpureus
NTU 568 under dioscorea medium through the mediation of
pH value and ethanol addition J Agric Food Chem 55(16): 6493-502
5 Lee C L., Wang J J., et al (2006) Monascus fermentation of
dioscorea for increasing the production of cholesterol-lowering monacolin K and antiinflammation agent monascin Appl Microbiol Biotechnol 72(6): 1254-62
6 Li Y G., Liu H., et al (2005) A validated stability-indicating HPLC with photodiode array detector (PDA) method for the
stress tests of Monascus purpureus - fermented rice, red yeast
rice J Pharm Biomed Anal 39(1-2): 82-90
7 Singer I I., Scott S., et al (1988) Lovastatin, an inhibitor of cholesterol synthesis, induces hydroxymethylglutaryl-coenzym A reductase directly on membranes of expanded smooth endoplasmic reticulum in rat hepatocytes Proc Natl Acad Sci USA 85(14): 5264-5268
8 Wang J J., Lee C L., et al (2003) Improvement of monacolin
K, gamma-aminobutyric acid and citrinin production ratio as
a function of enviroment conditions of Monascus purpureus
NTU 601 J Ind Microbiol Biotechol 30: 669-676
9 Wang L., Mo H., et al (1999) Production of lovastatin with
solid-state fermentation of Monascus ruber (Chinese) Chinese
Journal of Antibiotics 24: 96-98