Tuyển chọn và khảo sát điều kiện nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí có khả năng thủy phân rơm

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết là tuyển chọn được dòng vi khuẩn phân lập từ dạ cỏ bò có khả năng thủy phân rơm hiệu quả cao; những yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi khuẩn và khả năng thủy phân rơm đều được tiến hành nghiên cứu.

TUYỂN CHỌN VÀ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VI KHUẨN KỴ KHÍ CĨ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN RƠM Tơ Thị Ngọc Anh TĨM TẮT 14 dịng vi khuẩn kỵ khí phân lập từ cị bỏ đem khảo sát hoạt tính mơi trường Delafield cải tiến, sử dụng bột rơm làm chất Kết chọn dòng cho thấy vi khuẩn 43 cho đường kính vịng trịn thủy phân lớn (13,0mm) môi trường nhuộm Congo-Red Dịng 43 vi khuẩn gram âm, cầu đơi, di động sinh trưởng khoảng pH rộng 5,0-10,0, nhiệt độ 25-40oC Tại pH 6,0, nhiệt độ 30oC, thời gian ủ ngày, dòng 43 cho hoạt độ thủy phân rơm cao với hàm lượng protein sinh 0,10mg/ml đường khử sinh 0,046µg/ml Từ khóa: cỏ bị, đường khử, kỵ khí, thủy phân, rơm ĐẶT VẤN ĐỀ Đồng Sông Cửu Long (ĐBSCL) vùng sản xuất lúa trọng điểm nƣớc, với diện tích trồng lúa chiếm 12,1% nhƣng sản lƣợng lúa chiếm 51,5% cung cấp 90% lƣợng xuất nƣớc Tƣơng đƣơng với lƣợng lúa gạo lƣợng rơm phát sinh lớn Ƣớc tính lƣợng rơm phát sinh năm 2011 toàn vùng ĐBSCL 26,23 triệu tấn, địa phƣơng khảo sát nhiều tỉnh An Giang (4,78 triệu tấn) thấp Cần Thơ (1,68 triệu tấn) (Tổng cục Thống kê, 2011) Khuynh hƣớng sử dụng rơm nông hộ là: đốt rơm đồng, vùi đất, trồng nấm, bán chăn nuôi cho rơm Theo báo cáo Trần Sỹ Nam (2014), hầu nhƣ tất ngƣời dân có khuynh hƣớng lựa chọn biện pháp đốt rơm đồng ruộng cho năm tiếp theo: 98,75% (vụ Đông Xuân), 96,5% (vụ Hè Thu) 91,25% (vụ Thu Đông) Đốt rơm rạ đồng ruộng tái tạo đƣợc phần chất dinh dƣỡng vô cho đất, nhƣng lại thúc đẩy rửa trôi chất dinh dƣỡng đất làm “chai đất” Hơn nữa, đốt rơm diện tích lớn ĐBSCL ảnh hƣởng lớn đến môi trƣờng đất, nƣớc không khí, ảnh hƣởng tới sức khỏe ngƣời, góp phần làm gia tăng biến đổi khí hậu (IPCC, 2007; Gadde et al., 2009) gây lãng phí nguồn tài nguyên sinh khối (Ngơ Thị Thanh Trúc, 2005) Do đó, nghiên cứu xử lý rơm rạ sau thu hoạch vấn đề cấp thiết, đặc biệt thời điểm ĐBSCL gánh chịu tác hại nặng nề biến đổi khí hậu (Đồn Thị Thu, 2014) Cellulase nhóm enzyme xúc tác phản ứng cắt đứt liên kết β 1-4 glucoside mạch phân tử cellulose, đƣợc ứng dụng nhiều lĩnh vực nhƣ xử lý phế phẩm nông nghiệp, ngành công nghiệp nhƣ sản xuất bia, chất tẩy, dệt, giấy, thực phẩm, nhiên liệu sinh học y dƣợc…(Kirk et al., 2002), (Cherry Fidantsef, 2003) Cellulase đƣợc sinh nấm, vi khuẩn, động vật nguyên sinh, thực vật động vật Nhiều nghiên cứu cho thấy nấm sợi có khả phân hủy tốt cellulase tự nhiên, nhiên, vi khuẩn có tốc độ sinh trƣởng cao nấm nên có tiềm lớn đƣợc dùng sản xuất cellulase Động vật nhai lại có khả tiêu hóa thức ăn có thành phần cellulose nhờ hệ vi sinh vật phong phú, đa dạng cộng sinh cỏ: nấm, vi khuẩn nguyên sinh vật Trong đó, nấm vi khuẩn đóng góp 80% tiêu hóa thức ăn cỏ, nguyên sinh vật chiếm 20% (Dijkstra Tamminga, 1995) Nghiên cứu Cheng cộng (1991), Forsberg Cheng (1992) Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus flavefaciens Ruminococcus albus vi khuẩn có vai trị phân giải tế bào thực vật cỏ Một số nghiên cứu enzyme đƣợc sinh chủng Pseudomonas aeruginosa, Bacillus, Penicillium, Aspergillus, Mucor Fusarium sp., phân lập từ cỏ bị, cừu dê ứng dụng phân giải switchgrass, nguồn nhiên liệu tái tạo Nghiên cứu Krushna Chandra Das Wensheng Qi (2012) cho thấy vi khuẩn Butrivibrio fibrisolvens, Streptococcus sp., Clostidium aminophilum phân lập từ dịch cỏ gia súc sinh cellulase hoạt tính cao Từ tiền đề sở cho thấy đƣợc tiềm to lớn việc sử dụng vi khuẩn phân lập từ cỏ bò phân giải rơm rạ sau thu hoạch để sản xuất cellulase Biện pháp không nghiên cứu hƣớng xử lý nguồn rơm thải bỏ mà tận dụng nguồn tài nguyên sinh khối dồi ĐBSCL, đem lại hiệu kinh tế Mục tiêu đề tài: tuyển chọn đƣợc dòng vi khuẩn phân lập từ cỏ bị có khả thủy phân rơm hiệu cao Những yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng vi khuẩn khả thủy phân rơm đƣợc tiến hành nghiên cứu VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu Rơm: Mẫu rơm thu đƣợc huyện Cờ đỏ, quận Ơ Mơn, thành phố Cần Thơ Rơm đƣợc xử lý rửa chất bẩn, sấy khô nghiền thành bột mịn để làm chất nuôi vi khuẩn Nguồn vi khuẩn: 14 dịng vi khuẩn kỵ khí phân lập từ cỏ trâu bò, đƣợc đánh số 30, 31, 32, 33, 36, 37, 38, 39, 42, 43, 49, 50, 51, 52 Vi khuẩn đƣợc trữ glycerol 20%, nhiệt độ -20oC, phịng thí nghiệm Sinh hóa, Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, trƣờng Đại học Cần Thơ 2.2 Phƣơng pháp ni cấy vi khuẩn kỵ khí Cấy vi khuẩn môi trƣờng thạch Delafield (2002) cải tiến, thành phần 5g/l CMC (Carboxymethyl Cellulose), 1g/l (NH4)2SO4, 1g/l K2HPO4, 0,5g/l MgSO4.7H2O, 0,001g/l NaCl Vi khuẩn đƣợc ủ bình hút ẩm bên có đặt lửa đèn cầy để loại bỏ hồn tồn oxy bình, nhiệt độ phòng, ngày Cấy chuyền vi khuẩn qua nhiều lần thu nhận đƣợc dịng vi khuẩn Tiến hành mơ tả hình thái khuẩn lạc, nhuộm Gram, quan sát hình dạng chuyển động vi khuẩn 2.3 Xác định khả thủy phân rơm 14 dòng vi khuẩn Thử khả thủy phân rơm 14 dòng vi khuẩn phân lập Thí nghiệm đƣợc bố trí hồn tồn ngẫu nhiên, lặp lại lần cho dòng vi khuẩn Cấy vi khuẩn sang dịch môi trƣờng Delafield (2002) cải tiến bổ sung 0,5% bột rơm để ổn định nhiệt độ phòng ngày Cấy vi khuẩn sang môi trƣờng agar Delafield 0,5% bột rơm, ủ ngày, nhiệt độ phịng Sau đó, đĩa petri đƣợc với nhuộm Congo Red để đánh giá khả thủy phân cellulose có rơm dịng vi khuẩn kỵ khí thơng qua độ lớn đƣờng kính vịng trịn thủy phân Việc kiểm tra hoạt tính cellulase việc đo đƣờng kính vịng trịn thủy phân đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp miêu tả Laurent et al (2000) 2.4 Khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến dòng vi khuẩn tuyển chọn đƣợc 2.4.1 pH nhiệt độ Thử nghiệm tƣơng tác nhiệt độ pH đến phát triển dòng vi khuẩn tuyển chọn hiệu suất thủy phân rơm Tiến hành bố trí hồn tồn ngẫu nhiên, nhân tố, lặp lại lần cho dòng vi khuẩn tuyển chọn Cấy vi khuẩn môi trƣờng agar 0,5% bột rơm, pH môi trƣờng 4,0-11,0 pH đƣợc điều chỉnh dung dịch NaOH 5M HCl 6M Ủ đĩa petri điều kiện nhiệt độ 25-50oC, ngày tiến hành so sánh đƣờng kính đƣờng trịn thủy phân để xác định pH nhiệt độ thích hợp 2.4.2 Thời gian nuôi cấy Thử nghiệm ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến phát triển dòng vi khuẩn rơm để đạt đƣợc hiệu thủy phân cao Tiến hành thí nghiệm thời gian ngày, lần lặp lại cho dòng vi khuẩn khảo sát Vi khuẩn đƣợc nuôi 24 ống falcon 50ml môi trƣờng Delafield (2002) cải tiến bột rơm 0,5% Sau ngày lấy ống để đo mật số vi khuẩn, hàm lƣợng protein đƣờng khử sinh hoạt tính CMCase 2.4.3 Bố trí thí nghiệm phân tích thống kê Tất số liệu thu đƣợc đề tài đƣợc phân tích thống kê ANOVA (Analysis of Variance) dƣới bố trí thí nghiệm hồn tồn ngẫu nhiên CRD (Completely Randomized Design) Tất thí nghiệm đƣợc lặp lại lần Giá trị trung bình đƣợc so sánh việc kiểm tra thống kê khác biệt có ý nghĩa LSDT (Least Significant Difference Test) phần mềm Statgraphic version 3.0 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Khảo sát đặc tính sinh học 14 dịng vi khuẩn Mƣời bốn dòng vi khuẩn phân lập cầu khuẩn Gram âm, kết thành chuỗi (kết đám), bắt cặp riêng lẻ, đa số dịng có khả chuyển động ngoại trừ ba dịng 30, 32, 39, 42 Trên mơi trƣờng thạch, khuẩn lạc có ba dạng: trắng sữa, vàng cam vàng nhạt, bề mặt khuẩn lạc nhày, riêng dòng dịng 39 có dạng sần cứng Kết khảo sát đƣợc thể Hình Bảng Hình Hình thái vi khuẩn Bảng Hình thái khuẩn lạc 14 dòng vi khuẩn phân lập 3.2 Tuyển chọn dịng vi khuẩn kỵ khí có khả thủy phân rơm cao Mƣời bốn dòng vi khuẩn tạo đƣợc đƣờng trịn thủy phân mơi trƣờng CMC 1% có bổ sung Congo red Ind, cho thấy 14 dịng vi khuẩn phân lập có khả sinh cellulase để sử dụng cellulose (Võ Chí Đức, 2010) Hình Đƣờng kính đƣờng trịn thùy phân Tuy nhiên, thử nghiệm dòng 51 43 sau ngày ủ mơi trƣờng thạch rơm, có hai dịng 43 51 tạo đƣợc đƣờng trịn thủy phân (Hình 2) Đƣờng trịn thủy phân dịng 51 có đƣờng kính 23,00mm Đƣờng kính đƣờng trịn thủy phân dịng 43 ba lần lặp lại 13,00, 12,00 14,00mm Kết thống kê cho thấy khơng có khác biệt ý nghĩa 5% đƣờng kính đƣờng trịn thủy phân hai dòng 43 51 Tuy nhiên, dòng 51 tạo đƣợc đƣờng tròn thủy phân thí nghiệm lần lặp lại, ổn định so với dịng 43 Do đó, dịng 43 đƣợc chọn để khảo sát thí nghiệm 3.3 Khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến phát triển dòng vi khuẩn 43 pH nhiệt độ pH nhiệt độ nhân tố quan trọng ảnh hƣởng đến tốc độ tăng trƣởng vi khuẩn hoạt tính cellulase Biểu đồ cho thấy dịng 43 khơng tạo đƣờng trịn thủy phân sau ngày ủ môi trƣờng pH 4,0 11,0 Tại pH 10,0, đƣờng trịn thủy phân khơng xuất nhiệt độ ủ 25, 25 50oC Khả thủy phân rơm vi khuẩn tăng pH 5,0, 6,0 giảm khoảng pH 7,0-10,0 Về ảnh hƣởng nhiệt độ, thay đổi đƣờng kính thủy phân tƣơng tự nhƣ với ảnh hƣởng giá trị pH Giá trị trung bình đƣờng kính vòng tròn thủy phân đạt cao nhiệt độ 30oC sau giảm dần nhiệt độ cịn lại với giá trị pH thay đổi Tóm lại, kết thí nghiệm có ảnh hƣởng tƣơng tác nhân tố pH nhiệt độ đến khả sinh tổng hợp cellulase dòng vi khuẩn 52 Giá trị pH 6,0 nhiệt độ 30oC (ứng với đƣờng kính đƣờng trịn thủy phân 26,33mm) đƣợc chọn bố trí cho thí nghiệm khảo sát Biểu đồ Ảnh hƣởng pH nhiệt độ đến đƣờng kính đƣờng trịn thủy phân dịng vi khuẩn 43 Ảnh hƣởng thời gian ni cấy Kết nghiên cứu cho thấy dòng vi khuẩn 43 tăng trƣởng chậm (Biểu đồ 2a) Giai đoạn tiềm phát kéo dài ngày, mật số vi khuẩn giảm từ 4,5x108 CFU/ml (ngày 0) 3x108 CFU/ml (ngày 2) Tại ngày 3, vi khuẩn bƣớc vào giai đoạn pha số, mật số vi khuẩn tăng lên 2x109 CFU/ml đạt đƣợc cao 4,5x1010 CFU/ml (ngày 4) Mật số vi khuẩn giảm nhẹ ngày 2,8x1010CFU/ml Lƣợng đƣờng khử sinh hoạt tính CMCase ngày 1, 2, đo đƣợc (Biểu đồ 2b, c) Hàm lƣợng đƣờng khử hoạt tính CMCase tăng tuyến tính ngày 4, đạt đƣợc giá trị cao ngày 0,054µg/ml, 0,006 U/ml Tại ngày 6, 7, vi khuẩn bƣớc vào pha suy vong, mật số vi khuẩn, hàm lƣợng đƣờng khử sinh hoạt tính CMCase đo đƣợc giảm mạnh (Biểu đồ 2a, b) Tại ngày 5, mật số vi khuẩn đạt 2,8x1010 CFU/ml thấp ngày 4; nhiên, hàm lƣợng đƣờng khử sinh hoạt tính CMCase đạt cao 0,054µg/ml 0,006 U/ml Do đó, thời gian ủ thích hợp cho hiệu suất thủy phân rơm cao dòng 43 ngày Biểu đồ 2a Đƣờng cong tăng trƣởng dòng vi khuẩn 43 Biểu đồ 2b Lƣợng đƣờng khử sinh theo thời gian KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Trong 14 dịng vi khuẩn kỵ khí khảo sát, đề tài chọn đƣợc dịng vi khuẩn 43 có khả sinh cellulase cao môi trƣờng rơm Việc sinh enzyme cellulase dòng 43 tốt nhật điều kiện nhiệt độ 30oC, pH 6,0 với thời gian ủ ngày 4.2 Đề nghị Tiến hành định danh dòng vi khuẩn 43 Khảo sát nhân tố ảnh hƣởng đến hiệu thủy phân rơm vi khuẩn: phƣơng pháp xử lý rơm, nồng độ rơm, mật độ vi khuẩn ban đầu để làm sở tiến hành tách chiết tinh enzyme cellulase TÀI LIỆU THAM KHẢO Abhaykumar, V.K and H.C Dube, (1992) Cellulases of Vibrio agar-liquefaciens isolated from sea mud Microbiol and Biotechl (8): 313-315 Abidin, and T.J.Kempton (1981) Effects of treatment of barley straw with anhydrous ammonia and supplementation with heattreated protein meals on feed intake and liveweight performance of growing lambs Anim Feed Sci Technol., 6:145:155 Akin, D E., and R Benner (1988) Degradation of polysaccharides and lignin by ruminal bacteria and fungi Appl Environ.Microbiol, 54:1117-1125 Adebowale, E.A., Orskov, E.R and P.M Hoten (1989) Rumen degradation of straw 8: Effect of alkaline hydrogen peroxide on degradation of straw using either sodium hydroxide or gaseous ammonia as source of alkali Anim Feed Sci Technol., 6:145:155 Abou-Taleb, A.A Khadiga, W.A Mashhoor, A Sohair, M.S Sharaf and H.M Hoda, (2009) Nutritional and Environmental Factors Affecting Cellulase Production by Two Strains of Cellulolytic Bacilli Australian Journal of Basic and Applied Sciences 3(3): 2429-2436 Amtul, J S., (1989) Purification and Characterization of Microbial Cellulolytic Enzymes Ph.D Thesis, Institute of Chemistry, University of the Punjab Lahore – 1, Pakistan, pp: 176 Ariffin, H, N Abdullah, M.S.U Kalsom, Y Shirai, M.A Hassan, (006) Production and characterization of cellulase by Bacillus pumilus EB3 Int J Eng Tech 3(1):47-53 Azzaz, H.H., (2009) Effect of cellulolytic enzymes addition to diets on the productive performance of lactating goats M.Sc Thesis, Faculty of Agriculture, Cario University, Egypt, pp: 141 Badhan, A.K., B.S Chadha, K.G Sonia, H.S Saini and M.K Bhat, (2004) Functionally diverse multiple xylanases of thermophilic fungus Myceliophthora sp IMI 387099 Enz and Microbiol Technol 35, 460–466 Bahkali, A.H., (1996) Influence of various carbohydrates on xylanase production by V tricorpus Bioresource Technol 33(3): 265 - 268 Bauchop, T (1979) The rumen anaerobic fungi: colonizers of plant fibre Ann Rech Vet 10:246-248 Bauchop, T (1981) The anaerobic fungi in rumen fibre digestion Agric Environ 6:339-348 Cherry, J.R and Fidantsef, A.L (2003) Directed evolution of industrial enzymes: An update.Current Opinion in Biotechnology, vol 14, no 4, p 438-443 Kirk, O.; Borchert, T.V and Fuglsang, C.C (2002) Industrial enzyme applications Current Opinion in Biotechnology, vol 13, no 4, p 345-351 Trần Sỹ Nam, Nguyễn Thị Huỳnh Nhƣ, Nguyễn Hữu Chiếm, Nguyễn Võ Châu Ngân, Lê Hoàng Việt Kjeld Ingvorsen, (2014) ƢỚC TÍNH LƢỢNG VÀ CÁC BIỆN PHÁP XỬ LÝ RƠM RẠ Ở MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG SƠNG CỬU LONG Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, Phần A: Khoa học Tự nhiên, Công nghệ Môi trường: 32 (2014): 87-93 ... động vi khuẩn 2.3 Xác định khả thủy phân rơm 14 dòng vi khuẩn Thử khả thủy phân rơm 14 dịng vi khuẩn phân lập Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, lặp lại lần cho dịng vi khuẩn Cấy vi khuẩn. .. Tuyển chọn dịng vi khuẩn kỵ khí có khả thủy phân rơm cao Mƣời bốn dịng vi khuẩn tạo đƣợc đƣờng tròn thủy phân mơi trƣờng CMC 1% có bổ sung Congo red Ind, cho thấy 14 dịng vi khuẩn phân lập có khả. .. đề tài: tuyển chọn đƣợc dòng vi khuẩn phân lập từ cỏ bị có khả thủy phân rơm hiệu cao Những yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng vi khuẩn khả thủy phân rơm đƣợc tiến hành nghiên cứu VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG