KHẢO SÁT HOẠT TÍNH LIPASE THU NHẬN TỪ Aspergillus niger TRƯỚC VÀ SAU KHI CỐ ĐỊNH TRÊN NATRIALGINATE VÀ CHITOSAN

Bên cạnh đó để tăng hiệu suất thu nhận enzyme lipase và khả năng sử dụng được nhiều lần enzyme khá quan trọng này nhằm mang lại hiệu quả kinh tế cao nhất, chúng tôi tiến nuôi cấy và thử

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

******************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH LIPASE THU NHẬN TỪ

Aspergillus niger TRƯỚC VÀ SAU KHI CỐ ĐỊNH

TRÊN NATRIALGINATE VÀ CHITOSAN

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ HƯƠNG NHÀN

Niên khóa: 2005 – 2009

Tháng 08 năm 2009

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

******************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH LIPASE THU NHẬN TỪ

Aspergillus niger TRƯỚC VÀ SAU KHI CỐ ĐỊNH

TRÊN NATRIALGINATE VÀ CHITOSAN

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

TS VŨ VĂN ĐỘ NGUYỄN THỊ HƯƠNG NHÀN

CN ĐỖ THỊ TUYẾN

Tháng 08 năm 2009

Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp

Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho em trong suốt thời gian học tập và bồi dưỡng tại trường

Em vô cùng biết ơn sự dìu dắt và hướng dẫn nhiệt tình của toàn thể quý Thầy

Cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng quý Thầy Cô trực tiếp giảng dạy em trong suốt bốn năm qua, những người đã truyền thụ kiến thức quan trọng để em có thể thực hiện tốt khoá luận này

Em xin chân thành cảm ơn TS Vũ Văn Độ và Cô Đỗ Thị Tuyến đã tạo điều kiện cho em được thực tập tại viện Sinh Học Nhiệt Đới và đã tận tình hướng dẫn em trong suốt thời gian thực tập tại đây

Em cảm ơn các anh chị phụ trách phòng các hoạt chất có có hoạt tính sinh học thuộc viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp.HCM đã cung cấp nhiều kiến thức bổ ích

Cảm ơn toàn thể các bạn sinh viên cùng thực tập tại phòng các hoạt tính sinh học đã hết lòng giúp đỡ ủng hộ tôi trong thời gian làm đề tài

Chân thành cảm ơn toàn thể lớp DH05SH đã giúp đỡ, hỗ trợ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập và thực tập ở trường

Cuối cùng con xin gởi lòng biết ơn sâu sắc đến ba mẹ đã luôn ở bên con chăm sóc và động viên con trong suốt quá trình học tập

Lipase là một enzyme quan trọng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực công nghiệp: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dược, công nghiệp giặt tẩy, vân vân, và được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như thực vật, động vật, vi sinh vật Với ưu điểm là dễ nuôi cấy, sinh trưởng và phát triển nhanh cho nhiều enzyme trong

một thời gian ngắn Aspergillus niger được sử dụng phổ biến để nuôi cấy thu lipase

hiện nay

Bên cạnh đó để tăng hiệu suất thu nhận enzyme lipase và khả năng sử dụng được nhiều lần enzyme khá quan trọng này nhằm mang lại hiệu quả kinh tế cao nhất, chúng tôi tiến nuôi cấy và thử các tác nhân tủa để thu được hàm lượng lipase cao nhất

từ quá trình nuôi cấy Aspergillus niger đồng thời cố định enzyme thu được này trên

hai cơ chất Chitosan và Natrialginate để tìm ra cơ chất tối ưu cho quá trình cố định

Kết quả khảo sát thu được kết quả là với dung môi là muối (NH4)2SO4 thu được lượng lipase cao nhất, và ở nồng độ muối là 60%; với dung môi tủa là aceton cho lượng lipase ít hơn, và thu lượng lipase tối đa ở tỷ lệ tủa 1:5; với dung môi tủa là cồn cho lượng lipase thấp nhất, và thu lượng lipase tối đa ở tỷ lệ tủa 1:3

Sau đó thực hiện cố định lipase vừa thu nhận trên hai cơ chất Natrialginate và Chitosan bằng phương pháp nhốt enzyme Kết quả thu được hiệu suất cố định protein

và hiệu suất cố định hoạt tính lipase lần lượt là: 75% và 38,4% đối với cơ chất Natrialginate; 69% và 50,39% đối với cơ chất Chitosan Sau khi khảo sát tất cả các yếu

tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cố định nhận thấy độ ổn định về hoạt tính của enzyme cố định trên Chitosan là cao nhất (sau khi ủ 100 phút ở 40oC hoạt tính còn giữ lại khoảng 28,57%) cao hơn nhiều so với CPE thu được ( chỉ còn 2,4% sau khi ủ CPE

100 phút ở 40oC) Enzyme cố định trên cơ chất Natrialginate tuy không bền nhiệt bằng enzyme cố định trên cơ chất Chitosan nhưng lại có độ ổn định cao đối với pH cao (hoạt tính còn khoảng 555,333 UI/g ở pH12), điều này có ý nghĩa lớn việc ứng dụng lipase vào công nghiệp giặt tẩy

Lipase is an important enzyme which is applied in many industrial fields such

as food, pharmacy, detergent, etc Lipase was extracted from a lot of sources such as

animals, plants, or microorganisms Aspergillus niger grows very fast and easily grows

well in a culture medium So it is the best choice to extract lipase enzyme by growing

it in a culture medium process Besides, it is important to increase output and reuse this enzyme to get the highest efficiency Depending on those demands, we test some ways to precipitate enzyme and immobilize lipase enzyme on Natralginate and Chitosan by entrapment in gel method The result is:

The ways to precipitate:

- With (NH4)2SO4 solvent, we get the highest precipitation of 60% concentration

- With acetone solvent, we get the highest precipitation at the rate of 1:5

- With alcohol solvent, we get the highest precipitation at the rate of 1:3

Lipase was immobilized on Natralginate:

Trang

LỜI CẢM ƠN iii

TÓM TẮT iv

SUMMARY v

MỤC LỤC vi

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu 2

1.3 Mục đích 2

1.4 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về enzyme lipase 3

2.1.1 Định nghĩa 3

2.1.2 Các nguồn thu nhận enzyme lipase 5

2.1.2.1 Từ động vật 5

2.1.2.2 Từ thực vật 5

2.1.2.3 Từ vi sinh vật 5

2.1.3 Ứng dụng 6

2.1.3.1 Trong công nghiệp giặt tẩy 6

2.1.3.2 Trong công nghiệp thực phẩm 6

2.1.3.3 Trong công nghiệp giấy 7

2.1.3.4 Trong tổng hợp chất hữu cơ 7

2.1.3.5 Trong chuyển đổi sinh học trong môi trường nước 7

2.1.3.6 Trong chuyển đổi sinh học ở môi trường hữu cơ 7

2.1.3.8 Trong phản ứng acyl hoá đặc hiệu vị trí 8

2.1.3.9 Trong công nghiệp hóa dầu 8

2.1.3.10 Trong chế biến dầu và chất béo 8

2.2 Vi sinh vật tổng hợp lipase 9

2.3.1 Định nghĩa 10

2.3.2 Tính chất ưu nhược của enzyme cố định 11

2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme hòa tan 11

2.3.4.1 Phương pháp liên kết enzyme với vật liệu cố định (carrier binding) 12

2.3.4.2 Phương pháp hấp thụ vật lý (physical adsorption) 13

2.3.4.3 Phương pháp nhốt (entrapment) 14

2.3.4.4 Phương pháp khâu mạch (cross-linking) 15

2.3.5 Ứng dụng của Enzyme không hòa tan 15

2.3.5.1 Trong công nghiệp 15

2.3.5.2 Trong y học 15

2.3.5.3 Trong nghiên cứu khoa học 16

2.3.5.4 Trong bảo vệ môi trường 16

2.3.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 16

2.3.7 Vật lệu cố định, đại cương về Natrialginate và Chitosan 18

2.3.7.1 Những yêu cầu của một chất mang lý tưởng 18

2.3.7.2 Phân loại 18

2.4 Đặc điểm của Natrialginate và Chitosan 19

2.4.1 Đặc điểm, tính chất của Chitin và Chitosan 19

Chương 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành 23

3.2 Vật liệu 23

3.2.1 A niger 23

3.2.2 Natrialginate và Chitosan 23

3.2.3 Hóa chất 23

3.2.4 Môi trường 23

3.2.5 Thiết bị 26

3.3 Phương pháp nghiên cứu 26

3.3.1 Phương pháp giữ nấm mốc trên môi trường thạch nghiêng 26

3.3.2 Phương pháp nuôi nấm trên môi trường lúa 27

3.3.3 Phương pháp thu sinh khối nấm trên môi trường cảm ứng tạo enzyme lipase 27

3.3.4.1 Nguyên tắc 27

3.3.4.2 Phương pháp tủa enzyme bằng cồn 28

3.3.4.3 Phương pháp tủa enzyme bằng aceton 28

3.3.4.4 Phương pháp tủa enzyme bằng muối (NH4)2SO4 29

3.3.5.Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford……… 29

3.3.5.1 Nguyên tắc 29

3.3.5.2 Hoá chất 30

3.3.5.3 Thực hành 30

3.3.5.4 Tính kết quả 32

3.3.6 Phương pháp xác định hoạt tính của lipase 32

3.3.6.2 Các bước tiến hành 33

3.3.6.3 Tính kết quả 33

3.3.7 Xác định hàm lượng protein và hoạt tính lipase trong mẫu enzyme thu được 34

3.3.8 Phương pháp xác định hoạt tính riêng của enzyme 34

3.3.9 Phương pháp xác định hàm lượng protein trong 1g chất mang enzyme 34

3.3.10 Phương pháp xác định hiệu suất cố định protein của enzyme cố định 34

3.3.11 Phương pháp xác định hiệu suất cố định hoạt tính của enzyme cố định 35

3.3.12 Phương pháp cố định lipase trên cơ chất Natrialginate và Chitosan: 35

3.3.12.1 Cố định lipase trên Natrialginate bằng phương pháp nhốt 35

3.3.12.2 Cố định lipase trên chitosan bằng phương pháp nhốt 35

3.3.13 Xác định hàm lượng, hiệu suất cố định 36

3.3.14 Xác định hoạt tính và hoạt tính riêng của enzyme cố định 36

3.3.15 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến hoạt tính của enzyme lipase thu nhận36 3.3.15.1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 36

3.3.15.2 Khảo sát ảnh hưởng pH 36

3.3.15.3 Khảo sát độ bền nhiệt 36

3.3.16 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu đến hoạt tính của enzyme cố định 37

3.3.16.1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 37

3.3.16.2 Khảo sát ảnh hưởng pH 37

3.3.16.3 Khảo sát độ bền nhiệt 37

3.3.17 Khảo sát số lần tái sử dụng của lipase cố định 37

3.3.17.2 Khảo sát số lần tái sử dụng của lipase cố định trên Natrialginate 37

3.3.18 Phương pháp xử lý số liệu 38

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

4.1 Nghiên cứu quá trình tủa protein theo các tác nhân 39

4.1.1 Tủa protein trong dung môi cồn lạnh 39

4.1.2 Tủa protein trong dung môi aceton 39

4.1.3 Dịch chiết enzyme với tác nhân tủa là muối (NH4)2SO4 40

4.2 Hàm lượng, hoạt tính, hoạt tính riêng của CPE……… 42

4.3 Kết quả cố định lipase vào chất mang Natrialginate và Chitosan 42

4.4 Hàm lượng protein, hiệu suất cố định của enzyme lipase 43

4.5 Hoạt tính và hoạt tính riêng của lipase cố định 44

4.6 Hoạt tính lipase thu nhận theo nhiệt độ, pH và độ bền nhiệt .44

4.6.1 Khảo sát hoạt tính của enzyme thu nhận theo nhiệt độ 44

4.6.2 Khảo sát hoạt tính của enzyme thu nhận theo pH 45

4.6.3 Khảo sát hoạt tính của enzyme thu nhận theo thời gian ủ enzyme 46

4.7 Hoạt tính enzyme cố định trên Natrialginate theo nhiệt độ, pH và độ bền nhiệt 47

4.7.1 Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định trên Natrialginate theo nhiệt độ 47

4.7.2 Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định trên Natrialginate theo pH 48

4.7.3 Khảo sát hoạt tính enzyme cố định trên Natrialginate theo thời gian ủ 49

4.8 Hoạt tính của lipase cố định trên Chitosan theo nhiệt độ, pH và độ bền nhiệt 50

4.8.1 Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định trên Chitosan và theo nhiệt độ 50

4.8.2 Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định trên Chitosan và theo pH 51

4.8.3 Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định trên Natrialginate theo thời gian ủ 52

4.9 Khảo sát số lần tái sử dụng của enzyme cố định 53

4.9.1 Khảo sát số lần tái sử dụng của enzyme cố định trên Natrialginate 53

4.9.2 Khảo sát số lần tái sử dụng của enzyme cố định trên Chitosan 54

4.10 So sánh hoạt tính của enzyme trong Natrialginate và enzyme trong Chitosan 55

4.11 So sánh độ bền nhiệt của CPE ban đầu, enzyme cố định 56

5.1 Kết luận 58 5.2 Đề nghị 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO……….59 PHỤ LỤC

A niger Aspegillus niger

CBB Coomassie brilliant blue CPE Chế phẩm enzyme

Ctv Cộng tác viên DCE Dịch chiết enzyme

DD Degree of Deacetylation ELISA Enzyme link immunosorbent assay

IU (UI) Unit International, đơn vị quốc tế

HRP Horseradish Peroxidase HTR Hoạt tính riêng

Trang

Bảng 3.1 Thành phần môi trường PGA 24

Bảng 3.2 Thành phần môi trường Czapek 24

Bảng 3.3 Thành phần dinh dưỡng của cám gạo 25

Bảng 3.4 Tỷ lệ cồn tủa enzyme 28

Bảng 3.5 Tỷ lệ aceton tủa enzyme 28

Bảng 3.6 Tỷ lệ muối (NH4)2SO4 tủa enzyme 29

Bảng 3.7 Số liệu để dựng đường chuẩn albumin 30

Bảng 3.8 Bố trí thí nghiệm dựng đường chuẩn albumin 30

Bảng 4.1 Hoạt tính và hàm lượng enzyme lipase theo tỷ lệ cồn tủa enzyme 38

Bảng 4.2 Hoạt tính và hàm lượng enzyme lipase theo tỷ lệ aceton tủa enzyme 39

Bảng 4.3 Hoạt tính và hàm lượng enzyme lipase theo tỷ lệ muối (NH4)2SO4 39

Bảng 4.4 Hoạt tính cao nhất của lipase khi tủa với các dung dịch đệm 40

Bảng 4.5 Hàm lượng protein, hoạt tính lipase của CPE lipase ban đầu thu được 40

Bảng 4.6 Hiệu suất cố định và hàm lượng protein có trong 1g chất mang 42

Bảng 4.7 Hoạt tính riêng của lipase cố định 43

Bảng 4.8 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính CPE thu nhận 44

Bảng 4.9 Kết quả ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme lipase thu nhận 45

Bảng 4.10 Kết quả khảo sát hoạt tính của lipase theo thời gian ủ enzyme ở 40oC 46

Bảng 4.11 Kết quả hoạt tính lipase cố định trên Natrialginate theo nhiệt độ 47

Bảng 4.12 Kết quả hoạt tính của lipase cố định trên Natrialginate theo pH 48

Bảng4.13 Khảo sát hoạt tính của lipase trong Natrialginate theo thời gian ủ 49

Bảng 4.14 Kết quả hoạt tính của lipase cố định trên Chitosan theo nhiệt độ 50

Bảng 4.15 Kết quả khảo sát hoạt tính của lipase cố định trên Chitosan theo pH 51

Bảng 4.16 Kết quả hoạt tính của lipase cố định trên Chitosan theo thời gian ủ 51

Bảng 4.17 Hoạt tính của lipase cố định trên Natrialginate qua các lần tái sử dụng 52

Bảng 4.18 Kết quả hoạt tính của lipase trong Chitosan qua các lần tái sử dụng 53

Bảng 4.19 Kết quả so sánh số lần tái sử dụng của enzyme lipase cố định 54

Bảng 4.20 Kết quả so sánh độ bền nhiệt của enzyme lipase 55

Trang

Hình 2.1 Cấu trúc không gian của lipase 3

Hình 2.2 Sản phẩm quá trình thủy phân xúc tác bởi lipase .4

Hình 2.3 Aspergillus niger 9

Hình 2.4 Cấu trúc phân tử Chitin 19

Hình 2.5 Cấu trúc phân tử Chitosan 20

Hình 2.6 Cấu trúc đoạn phân tử Natrialginate và gốc acid cấu tạo nên chúng 21

Hình 4.2 Enzyme lipase được nhốt trong gel Chitosan………41

Hình 4.1 Enzyme lipase được nhốt trong gel Natrialginate……….41

Ở Việt Nam, ngành công nghiệp thực phẩm, công nghiệp giặt tẩy, công nghiệp hoá dầu cần nhiều enzyme đặc biệt là lipase nhưng chế phẩm lipase đang sử dụng hầu như là phải nhập khẩu hoàn toàn Do đó, việc nghiên cứu và triển khai sản xuất enzyme lipase trong nước đang được quan tâm Vi sinh vật có chu kỳ sinh trưởng và phát triển ngắn, tốc độ sinh sản nhanh, môi trường nuôi cấy đơn giản và dễ dàng kiểm

soát là một nguồn thu nhận enzyme lipase quan trọng Aspergillus niger là một trong

những vi sinh vật cho hàm lượng enzyme cao Tuy nhiên vi sinh vật cho hàm lượng enzyme cao là chưa đủ cần phải có phương pháp thích hợp để thu nhận được enzyme cao nhất

Bên cạnh đó việc nâng cao hiệu suất sử dụng enzyme lipase cũng đang được nghiên cứu Phương pháp cố định enzyme là một trong những hướng nghiên cứu nhằm nâng cao hiệu suất sử dụng enzyme Bằng cách cố định enzyme trong chất mang không tan trong nước enzyme có thể được tách ra khỏi cơ chất một cách dễ dàng sau phản ứng Thêm vào đó enzyme cố định được tái sử dụng nhiều lần khắc phục tình trạng khan hiếm enzyme như hiện nay Một vấn đề được đặt ra nữa là: làm thế nào tìm được cơ chất thích hợp cho sự cố định lipase để nâng cao hiệu suất cố định enzyme và tăng số lần tái sử dụng của enzyme cố định

2

Để đáp ứng được hai yêu cầu thiết thực và bức thiết này ở nước ta hiện nay

chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Thu nhận enzyme lipase từ Aspergillus niger,

khảo sát hoạt tính lipase trước và sau cố định trên hai cơ chất Natrialginate và Chitosan” Với đề tài này, chúng tôi hi vọng sẽ góp một phần nhỏ trong nghiên cứu

sinh hóa và phát triển phương pháp tối ưu thu nhận lipase từ Aspergillus niger đồng

thời góp phần nhỏ trong việc tìm được cơ chất thích hợp cố định enzyme lipase mang lại hiệu quả kinh tế cao

1.2 Mục tiêu

Thực hiện việc thu nhận enzyme lipase từ A niger trong phòng thí nghiệm Sử

dụng enzyme thu được để cố định trên hai cơ chất Natrialginate và Chitosan

1.3 Mục đích

Làm cơ sở nghiên cứu cho việc tìm ra phương pháp thu nhận được hàm lượng lipase cao nhất Đồng thời tìm ra cơ chất tối ưu cho việc cố định enzyme lipase để mang lại hiệu quả kinh tế cao nhất trong công nghiệp

1.4 Nội dung thực hiện

- Thu nhận enzyme lipase từ A niger trong phòng thí nghiệm

- Khảo sát các tác nhân tủa dịch chiết enzyme như: cồn, aceton, muối

- Dùng enzyme vừa thu nhận cố định trên hai cơ chất Natrialginate và Chitosan

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme thu nhận và enzyme cố định trên hai cơ chất Natrialginate và Chitosan

- Khảo sát số lần tái sử dụng của enzyme cố định

- Xác định hiệu suất cố định trên hai cơ chất Natrialginate và Chitosan

3

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về enzyme lipase

2.1.1 Định nghĩa

Lipase (triglyceride acyl hydrolase) thuộc nhóm enzyme thuỷ phân (Hydrolase),

là enzyme có khả năng xúc tác sự thuỷ giải các nối ester của triacylglyceride thành glycerol và acid béo tự do Mã số của enzyme lipase là EC 3.1.1.3

a Cấu trúc không gian

Phiến β màu xanh được bao quanh bởi các xoắn α màu vàng Nhóm serine hoạt động là các thanh màu đỏ và vùng nắp xoắn của enzyme cũng có màu đỏ

Cấu trúc chung của enzyme lipase gồm một phiến β ở giữa với nhóm serine hoạt động đặt trong một vòng (loop) gọi là cùi chỏ xúc tác (catalytic elbow) Trên serine là một khe kị nước (hydrophobic cleft) được hình thành sau sự hoạt hóa Khe ưa nước là một túi dài (elongated pocket) tùy theo cơ chất gắn khít vào

Hình 2.1 Cấu trúc không gian của lipase

( http://wikipedia.com )

b Cơ chất

Mỡ động vật và dầu thực vật là những nguồn cơ chất chính của enzyme lipase

Để phân tích hoạt tính của lipase người ta thường dùng cơ chất là triglyceride được tinh sạch hoặc tổng hợp Chẳng hạn như triolein tributyrin Các dạng triglyceride dễ

Hình 2.2 Sản phẩm quá trình thủy phân xúc tác bởi lipase

Sự phân tích muối của lipid dẫn xuất từ glycerol-1-oleate-2,3-dipalmitate và từ 1,2-dipalmitate-3-oleate đã cho thấy 2 vị trí ngoài là 1 và 3 được phân cắt với tốc độ như nhau Do đó, enzyme lipase từ động vật là enzyme lipase đặc hiệu vị trí 1, 3 Nếu các glyceride hiện diện dưới dạng nhũ hóa thì acid béo mạch ngắn sẽ được thủy giải nhanh hơn acid béo mạch dài

có khả năng nhũ hoá cơ chất Nhờ đó tăng cơ hội tương tác giữa enzyme và cơ chất

2.1.2.2 Từ thực vật

Enzyme lipase từ nguồn thực vật có nhiều trong các hạt dầu bao gồm: hạt đậu nành, đậu phộng, nhô, thầu dầu và hạt của các cây như cây mù tạt, cây cải dầu, cây bông, cây anh túc Enzyme lipase từ hạt này có thể xúc tác thuỷ giải dầu thực vật và cả

mỡ động vật Nhưng enzyme lipase này thuỷ giải các chất có thành phần đơn giản như ester của các acid béo với gốc methyl mạnh hơn là đối với các cơ chất là mỡ động vật hay dầu thực vật

Hầu hết các công trình nghiên cứu về những đặc tính của enzyme lipase từ thực vật đều khảo sát enzyme lipase từ hạt thầu dầu Nồng độ ion H+ thích hợp cho hoạt động của enzyme lipase này là khoảng pH5

2.1.2.3 Từ vi sinh vật

Enzyme lipase có thể tạo ra từ nhiều chủng vi khuẩn, nấm men và nấm mốc Khoảng 15 năm về trước thì enzyme này đã được dùng làm chế phẩm trong nghiên cứu khoa học Về sau các nhà sản xuất Nhật Bản mới bắt đầu thu enzyme lipase từ

giống Rhizopus và Aspegillus để ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm thay thế cho

nguồn enzyme lipase từ tụy tạng Do áp dụng những kỹ thuật công nghệ mới nên chế phẩm enzyme lipase từ nhiều chủng vi sinh vật khác nhau không ngừng tăng lên Với các đặc điểm thuận lợi như: tốc độ sinh sản nhanh, enzyme thu nhận có hoạt tính cao, hơn nữa điều kiện của quá trình nuôi cấy lại không phụ thuộc vào ngoại cảnh vi sinh vật là nguồn thích hợp cho việc sản xuất enzyme theo quy trình công nghiệp

6

Các loài vi nấm phân lập từ các mẫu đất ở Ai Cập được xác định là có khả năng

tạo enzyme lipase cao bao gồm: Asperills niger, A terreus, A oryzae, A fumigatus,

Penicilium chysogenum, P funiculosum, Fusarium solani, Fusarium moniliforme, Fusarium vasinfectum và Alternaria alternata Trong số đó, loài có khả năng tạo

enzyme lipase mạnh nhất là A niger tiếp theo sau là A terrus, A fumigatus, Fusarium

moniliforme Loài tạo enzyme lipase thấp nhất là P chysogenum

Mohawed và ctv, (1985) đã phân lập được 24 loài thuộc giống Aspegillus từ môi trường đất ở Ai Cập Trong đó loài có khả năng tạo lipase mạnh nhất là A niger

Điều này chứng tỏ hoạt động của enzyme lipase không chỉ khác nhau ở những giống khác nhau mà còn khác nhau ngay cả ở những loài khác nhau của cùng một giống

2.1.3 Ứng dụng

2.1.3.1 Trong công nghiệp giặt tẩy

Những ứng dụng của enzyme lipase mang lại giá trị thương mại chủ yếu là trong lĩnh vực chất tẩy rửa Có đến 32% tổng số enzyme lipase bán ra dùng trong công nghiệp giặt tẩy Ước tính khoảng 1000 tấn enzyme lipase dùng để sản xuất 13 tỉ tấn bột giặt mỗi năm (Jaeger và Reetz, 1998) Do có khả năng phân huỷ chất béo nên enzyme lipase được ứng dụng như là nhân tố chính trong công nghiệp giặt tẩy và chất tẩy rửa trong gia đình

2.1.3.2 Trong công nghiệp thực phẩm

Dầu và mỡ là thành phần quan trọng trong thức ăn Giá trị dinh dưỡng và giá trị cảm quan cùng với những tính chất vật lý của triglyceride được quyết định bởi nhiều yếu tố như: vị trí gắn vào khung glycerol của chuỗi axit béo, chiều dài của chuỗi acid béo và độ không bão hoà của nó Enzyme lipase có thể làm thay đổi những đặc tính của chất béo bằng cách thay đổi vị trí của chuỗi acid béo cũ bằng chuỗi acid béo mới Với cách này những loại lipid rẻ tiền và không mong muốn có thể được chuyển đổi thành lipid có giá trị cao hơn (Colman và Macrae, 1980)

Ngoài ra enzyme lipase còn dùng để làm tăng hương vị cho phomat chín, bánh

mì và thức uống Một khía cạnh khác, enzyme này cũng được dùng để loại bỏ chất béo

từ các sản phẩm thịt và cá

7

2.1.3.3 Trong công nghiệp giấy

Chất bã (pitch) hay thành phần kị nước của gỗ (chủ yếu là trigyceride và chất sáp) đã gây ra nhiều khó khăn trong quá trình sản xuất giấy (Jaeger và Reetz, 1998) Công ty sản xuất giấy công nghiệp Nippon tại Nhật Bản đã phát triển một phương

pháp kiểm soát “pitch” bằng cách dùng các enzyme lipase từ nấm candidi rugosa để

thuỷ giải đến 90% triglyceride trong gỗ Từ đó enzyme lipase thường được dùng để

loại bỏ các “pitch” từ bột giấy trong quá trình sản xuất giấy

2.1.3.4 Trong tổng hợp chất hữu cơ

Đây là một ứng dụng có ý nghĩa rất lớn trong ngành hoá học nói chung và tổng hợp chất hữu cơ nói riêng Enzyme lipase được dùng để xúc tác nhiều loại phản ứng chuyển đổi hoá học, đặc hiệu vùng và đặc hiệu không gian (www.sciencedirect.com)

2.1.3.5 Trong chuyển đổi sinh học trong môi trường nước

Enzyme lipase chuyển hoá acyl thu từ loài Candida parapsilosis có thể dùng xúc tác

sự tổng hợp sinh học các acid béo trong môi trường 2 pha nước và chất béo Những cơ chất trong phản ứng này là những chất acyl (acid béo hoặc ester giữa acid béo với gốc metyl) và hydroxylamine Sự chuyển hoá từ chất cho là ester cho đến hydroxylamine (aminolysis) được xúc tác chọn lọc hơn khi so sánh với cơ chất là acid béo tự do

Chính đặc điểm này làm cho enzyme lipase từ loài C parapsilosis xúc tác chọn lọc có

định hướng quá trình chuyển đổi sinh học trong môi trường nước (http://www.sciencedirect.com)

2.1.3.6 Trong chuyển đổi sinh học ở môi trường hữu cơ

Enzyme lipase hoạt động trong môi trường hữu cơ không có thành phần nước

tự do đã thể hiện một số đặc tính đáng chú ý Với những đặc tính này người ta đã thiết lập nên một hệ thống enzyme không cần dùng nước cho sự tổng hợp và biến đổi sinh học (Klibanoz, 1997)

2.1.3.7 Trong sự tổng hợp ester

Enzyme lipase đã mang lại những thành công trong việc xúc tác để tổng hợp nên những ester mới Những ester được tạo bởi chuỗi acid béo ngắn được dùng làm tăng hương vị trong công nghiệp thực phẩm Những ester giữa chuỗi acid béo dài với gốc metyl hoặc gốc etyl thì được dùng để làm giàu nhiên liệu diesel (Vulfson, 1994)

8

2.1.3.8 Trong phản ứng acyl hóa đặc hiệu vị trí

Enzyme lipase có khả năng acyl hoá nhiều loại steroid, đường và những dẫn xuất từ đường với sự đặc hiệu vùng cao Đường được acyl hóa 1 nhóm sinh ra trong môi trường pyridine khan từ các muối trietylcarboxylate và nhiều loại đường đơn

khác Ngược lại, Chen và ctv.(1995) đã sử dụng enzyme lipase từ Asperillus niger để

xúc tác phản ứng khử acyl có chọn lọc vị trí từ đường metyl-D-glucopyraside đã được acyl hóa từ trước Tương tự, sự khử gốc acetyl có tính đặc hiệu vị trí từ những dẫn xuất của đường monosaccharide đã được acyl hoá trước đó trong môi trường 1,1,1- trichloroethane bằng cách sử dụng enzyme lipase có bổ sung polyetylenglycol (PEG)

2.1.3.9 Trong công nghiệp hóa dầu

Việc ứng dụng enzyme lipase trong công nghiệp hóa dầu đã tiết kiệm năng lượng và giảm nhiệt độ xuống thấp nhất trong quá trình rượu hóa, acid hóa, thuỷ giải

và tạo glycerol (Vulfson, 1994)

Mặc dù enzyme lipase được tạo ra theo tự nhiên là dùng để thuỷ giải nối ester của triglyceride, nhưng bên cạnh đó nó còn xúc tác những phản ứng tổng hợp ester trong môi trường có lượng nước thấp Sự thuỷ giải và ester hóa có thể xảy ra đồng thời trong một quá trình được gọi là ester hóa nội (interesterification)

Dựa trên cơ chất mà enzyme thực hiện phản ứng, enzyme lipase có thể xúc tác phản ứng acid hóa (một acyl được sinh ra do phản ứng giữa một acylglycerol và acid carboxylic), hay phản ứng rượu hóa (một acyl được sinh ra do phản ứng giữa một acylglycerol và một rượu) và phản ứng chuyển ester hoá (2 gốc acyl được tạo ra do phản ứng trao đổi giữa acylglycerol)

2.1.3.10 Trong chế biến dầu và chất béo

Các quá trình thuỷ phân chất béo và dầu bằng chế phẩm enzyme lipase được phát triển rộng rãi trên thế giới, đặc biệt là ở Nhật Bản Hiện nay, có khoảng 34 công nghệ được ứng dụng trên toàn thế giới Các loại enzyme lipase chủ yếu được sản xuất

từ Candida cylindracea Trên thế giới có khoảng 10 triệu tấn dầu, chất béo đang được

xử lý bằng phương pháp enzyme Người ta thường tạo điều kiện tối ưu bằng tỷ lệ dầu (chất béo) và chất đệm là 70 : 30, duy trì pH5 - pH6 và nhiệt độ thuỷ phân là 300C với

enzyme từ nấm Candida cylindracea

9

2.2 Vi sinh vật tổng hợp lipase

Hình 2.3 Aspergillus niger

2.2.1 Khái quát về A niger

Aspergillus niger cấu tạo dạng sợi, sinh bào tử và không có diệp lục, sử dụng

nguồn hữu cơ có sẵn để sinh sống Aspergillus niger có trong đất, xác bã thực vật và

hoa quả vùng nhiệt đới

Van Tieghem là người đầu tiên phát hiện và phân lập chủng nấm mốc

Aspergillus niger từ quả, hạt, đặc biệt là hạt đậu phộng, bồ đào, dừa

2.2.2 Đặc điểm sinh học

Aspergillus niger sinh trưởng được ở nhiệt độ tối thiểu là 6 - 8oC, tối đa là 45 -

470C, tối ưu là 28 - 350C, sinh trưởng trong môi trường có độ ẩm tối thiểu là 23% Độ

ẩm môi trường thích hợp để lên men bán rắn là 60 - 65%, chỉ sinh trưởng và phát triển trong sự có mặt của O2 và pH tối ưu từ 4 - 6,5

Trên môi trường thạch Czapeck, Aspergillus niger mọc thưa, đường kính khuẩn

lạc khoảng 40mm

2.2.3 Đặc điểm sinh hóa

a Khả năng lên men đường

Aspergillus niger có khả năng đồng hóa tốt các lọai đường đơn và đường đôi

như glucose, maltose, saccharose

10

b Khả năng tổng hợp enzyme

Aspergillus niger có khả năng tổng hợp các lọai enzyme sau: Amylase,

Cellulose, Pectinase, Lipase

c Khả năng lên men rượu

Theo Menezes, một số loài Aspergillus niger có khả năng lên men rượu trong

điều kiện kị khí Người ta cũng đã tiến hành nghiên cứu sử dụng bã khoai mỳ để sản

xuất rượu etylic dựa vào khả năng lên men rượu của Aspergillus niger

2.2.4 Tác hại

Aspergillus niger được xếp vào loại an toàn thực phẩm không chứa độc tố

aflatoxin Tuy nhiên Aspergillus niger cũng làm hư hại trái cây tươi sau thu họach như: táo, lê, chanh, nho, vân vân, gây nhiễm phomat Aspergillus niger cũng sống bám

trên đồ gỗ, đồ da

Bệnh nấm ở cây do phần lớn Aspergillus niger gây ra như thối rữa chồi cây hoa

bông vải, thối rữa thân cây

Aspergillus niger cũng thường gây bệnh cho chim, chim con nhiễm bệnh

thường dễ chết, còn chim lớn thường không chết nhưng cũng sống yếu hơn những con chim không bệnh

2.3 Sự cố định enzyme

2.3.1 Định nghĩa

Enzyme cố định (hay còn gọi là enzyme không hòa tan) là những enzyme chuyển động trong không gian bị giới hạn Sự giới hạn của enzyme đạt được bằng cách đưa nó vào một pha cách ly, tách rời khỏi pha dung dịch tự do mà ở đó nó vẫn có khả năng tiếp xúc được với phân tử cơ chất Pha chứa enzyme cố định thường không tan trong nước nhưng cũng có thể là các polymer ưa nước cao phân tử

Theo Michael Trevan, thuật ngữ cố định (immobilization enzyme, insoluble enzyme) được hiểu là đưa những phân tử enzyme vào những pha riêng rẽ Pha này được tách riêng với dung dịch tự do Pha enzyme thường không tan trong nước và được gắn với những polimer ưa nước có trọng lượng phân tử lớn

Theo Kalus Mosbach, các chất xúc tác sinh học cố định là enzyme, tế bào, cơ thể sống hoặc tổ hợp giữa chúng trong một trạng thái cho phép sử dụng lại và liên tục

11

2.3.2 Tính chất ưu nhược của enzyme cố định

Enzyme cố định ngày càng được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực là nhờ vào những đặc điểm nổi bật sau:

- Có thể tái sử dụng lặp đi lặp lại nhiều lần một lượng enzyme xác định trong một thời gian dài, do đó làm giảm giá thành sản phẩm, hiệu quả kinh tế cao, tiết kiệm enzyme, đặc biệt quan trọng đối với những enzyme đắt tiền Thuận lợi trong các quá trình tự động hóa và liên tục

- Tăng độ tinh sạch của sản phẩm vì enzyme được cố định ở những pha riêng rẽ, dễ dàng tách ra khỏi sản phẩm Do đó tránh được ảnh hưởng không tốt đến sản phẩm Điều này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng khi sử dụng enzyme cố định trong sản xuất dược phẩm, trong công nghiệp sản xuất hóa chất tinh khiết và trong phân tích

- Có thể dừng phản ứng ở bất cứ giai đoạn nào khi cần thiết, chỉ cần tách enzyme cố định ra khỏi cơ chất

- Kéo dài thời gian bảo quản và bền vững với chất kiềm hãm cũng như các tác nhân gây biến tính so với enzyme hòa tan

- Hoạt tính ổn định hơn so với enzyme tự do khi có những thay đổi của môi trường như: pH, nhiệt độ, nhờ vào các liên kết của enzyme với chất mang như liên kết cộng hóa trị, liên kết hydro, liên kết ion và các liên kết khác

Bên cạnh đó enzyme cố định cũng có những nhược điểm nhất định:

- Hạn chế khả năng tiếp xúc giữa cơ chất với enzyme cho nên hoạt tính riêng của enzyme thường thấp hơn so với enzyme tự do

- Một lượng enzyme đáng kể bị mất hoạt tính khi cố định bằng phương pháp cộng hóa trị là do chất hoạt hóa và do phản ứng gắn kết không đặc hiệu của các liên kết trên vật liệu cố định vào trung tâm hoạt động của enzyme

2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme hòa tan

Khi gắn lên chất mang, enzyme bị giới hạn trong một phạm vi môi trường xác định, cấu tạo không gian của phân tử có thể bị thay đổi, do đó làm biến đổi một số tính chất của enzyme ban đầu (enzyme hòa tan) Một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme không hòa tan là

- Bản chất và tính chất hóa học của chất mang

12

- Các tính chất lý học của chất mang như tính hòa tan, tính bền cơ học, độ trương, điện tích, tính háo nước và kị nước,…đều có ảnh hưởng nhất định đến lượng enzyme được liên kết, tính bền và hoạt tính sinh học của các dẫn xuất enzyme cố định Bản chất hóa học của các chất mang cũng có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng tạo thành dẫn xuất enzyme, và tới khả năng hấp thụ không đặc trưng các chất từ môi trường phản ứng

- Dẫn xuất enzyme không hòa tan thường có tính bền nhiệt cao so với enzyme tan do kết quả của sự định vị enzyme tạo nên Chất mang cũng có tác dụng hạn chế sự biến tính của enzyme trong các dung môi có khả năng làm đứt mối liên kết hydrogen

và liên kết kỵ nước

- Sự khuếch tán của cơ chất, sản phẩm và các phân tử khác

- Tốc độ khuếch tán của cơ chất, sản phẩm và các chất phụ khác

2.3.4 Các phương pháp cố định enzyme

Để thu được chế phẩm enzyme cố định có hoạt tính cao và ổn định thì việc

lựa chọn vật liệu cố định cũng như phương pháp cố định là hết sức quan trọng

Dựa vào liên kết giữa chất mang và enzyme, người ta chia làm hai phương pháp cố định: phương pháp vật lý (liên kết vật lý) và phương pháp hóa học (liên kết đồng hóa trị) Theo Scouten và Gerhartz có bốn phương pháp cố định enzyme

- Phương pháp liên kết enzyme với vật liệu cố định (carrier binding)

- Phương pháp hấp thụ vật lý (physical adsorption)

- Phương pháp nhốt (entrapment)

- Phương pháp khâu mạch (cross – linking)

2.3.4.1 Phương pháp liên kết enzyme với vật liệu cố định (carrier binding)

Nguyên tắc của phương pháp này là enzyme được nối với chất mang thông qua cầu nối Cầu nối phải có kích thước không lớn và có hai đầu, một đầu gắn chất mang còn đầu kia gắn với enzyme, đảm bảo liên kết vững chắc của enzyme với chất mang

Quá trình kết hợp với enzyme xảy ra một giai đoạn nếu chất mang có chứa các nhóm có khả năng tham gia trực tiếp với nhóm amin của protein enzyme Trường hợp ngược lại là quá trình xảy ra với hai giai đoạn

13

- Giai đoạn đầu để hoạt hóa chất mang bằng cách đưa vào các nhóm có khả năng phản ứng hơn

- Giai đoạn gắn kết enzyme vào chất mang đã được hoạt hóa

Tùy từng chất mang khác nhau mà ta sử dụng chất hoạt hóa nào cho phù hợp như hoạt hóa bằng cyanogen bromide cho vật liệu cố định có nhóm (-OH) được thể hiện đầu tiên bởi Axen và Porath (1967), hoặc là hoạt hóa bằng acid với các vật lệu cố định nhóm chức (-COOH) được thực hiện đầu tiên bởi Mitz và các cộng sự (1961)

Phương pháp này thì enzyme không bị rửa trôi khỏi chất mang trong quá trình sử dụng, do liên kết chặt chẽ với vật liệu cố định bằng liên kết cộng hóa trị nên tăng khả năng ổn định với sự thay đổi nhiệt độ Nhưng do liên kết chặt chẽ enzyme với chất mang, nên cản trở hoạt động của phân tử enzyme, làm giảm khả năng tiếp xúc giữa enzyme với cơ chất, kết quả làm giảm hoạt tính của enzyme cố định Vật liệu cố định thường không tái sử dụng được, vì vậy phương pháp này chỉ thích hợp với những enzyme đắt tiền và ổn định hoạt tính khi cố định

2.3.4.2 Phương pháp hấp thụ vật lý (physical adsorption)

Phương pháp này khá đơn giản, được sử dụng sớm nhất và được ứng dụng rộng rãi để cố định enzyme Quá trình cố định là trộn lẫn dung dịch enzyme với vật liệu cố định rồi ủ một thời gian cho phép rồi lọc, rửa phần enzyme không hấp thụ Enzyme được cố định trên chất mang nhờ các liên kết yếu như: liên kết ion, liên kết hydro, liên kết Van der Wall…Trong phương pháp hấp thụ vật lý thì hoạt tính enzyme cố định thường cao, từ 50 đến 100% Tuy nhiên, hoạt tính không ổn định lâu dài, enzyme dễ bị hấp phụ do sự thay đổi pH, nhiệt độ, nồng độ enzyme

14

2.3.4.3 Phương pháp nhốt (entrapment)

a Nhốt trong cấu trúc mạng gel (entrapment in gel)

Đây là phương pháp khá đơn giản, enzyme ít bị thay đổi qua quá trình cố định Để gói enzyme vào trong khuôn gel người ta tiến hành trùng hợp hóa các gel khi có mặt đồng thời của enzyme Sau khi hoàn thành quá trình trùng hợp ta thu được enzyme bị nhốt trong các lỗ gel Gel đã có enzyme có thể nghiền nhỏ bằng cách đồng hóa hoặc ép qua rây có lỗ nhỏ rồi đem sấy khô ở nhiệt độ thấp Dẫn xuất enzyme loại này lần đầu tiên do Bernfeld (1933) thu được bằng cách trùng hợp acrylamide với N, N-metylenbisacrylamide Phương pháp này thường dùng gần đây do chất trùng hợp dễ tạo thành hạt và tùy vào điều kiện tiến hành mà gel

có độ xốp khác nhau

Alginate và caraghehan lấy từ rong biển thường có khả năng tạo gel tốt, thuận lợi để gói enzyme và tế bào Canxialginate là một trong những vật liệu thích hợp cho phương pháp nhốt enzyme Hỗn hợp enzyme và alginate được nhỏ xuống dung dịch CaCl2 để tạo hạt

b Dạng các sợi tổng hợp (liposome)

Phương pháp này được thực hiện bằng trộn enzyme vào trong chất mang, tạo dịch lỏng, cho dịch lỏng này chảy tuần hoàn bên trong sợi do đó hạn chế sự phân cực bề mặt và sự bịt lấp thường gặp ở các màng Phương pháp này được Dinelli (1972) tiến hành giống như tạo sợi xelluloza trong công nghiệp dệt Một nhũ tương của xelluloza triacetate trong metylen clorua và enzyme dạng dung dịch trong đệm có chứa glycerol được ép qua một khuôn lọc dưới áp suất của nitơ Các sợi ra khỏi khuôn được nhúng vào trong một cái bể đông tụ có chứa toluen, sau đó được làm khô trong chân không

c Dạng bao vi thể (microcapsul)

Enzyme được nhốt trong bao vi thể có màng bán thấm, màng này được tạo

ra từ các polymer có kích thước lỗ đủ nhỏ để ngăn cản sự khuếch tán ra ngoài Vì enzyme hoạt động trong môi trường dung dịch nên khả năng tiếp xúc giữa enzyme

và cơ chất lớn hơn, vì vậy mà hoạt tính enzyme cố định cao hơn so với nhốt trong cấu trúc mạng gel

15

d Dạng màng siêu lọc

Phương pháp này đơn giản, tương tự như nhốt trong bao vi thể Enzyme được giữ trong màng siêu lọc Màng bán thấm này cho phép các cơ chất và sản phẩm có trọng lượng phân tử lượng thấp qua lại tự do nhưng giữ lại enzyme có trọng lượng phân tử cao

2.3.4.4 Phương pháp khâu mạch (cross-linking)

Những chất có hai hoặc đa nhóm chức năng như: diisocyanate, glutaraldehyde, hexamethylen diisocyanate được dùng làm cầu nối khâu mạch các phân tử enzyme Những enzyme được khâu mạch tạo thành mạng lưới không tan trong nước Theo phương pháp này thì hoạt tính của enzyme cố định thường thấp,

do các hợp chất khâu mạch có thể liên kết không đặc hiệu vào trung tâm hoạt động của enzyme và enzyme bị liên kết tạo thành một khối kém linh động

2.3.5 Ứng dụng của Enzyme không hòa tan

2.3.5.1 Trong công nghiệp

Ngày nay, nhiều quy trình ứng dụng enzyme cố định trong công nghiệp như công nghiệp sản xuất rượu bia, nước giải khát, chế biến sữa, sản xuất da

- Trong sản xuất rượu bia: Các enzyme amylase, tế bào nấm men cố định enzyme được sử dụng ở qui mô lớn

- Trong công nghiệp chế biến sữa: Enzyme lactase cố định để thủy phân lactose trong sữa

- Một số thành tựu khác như: Năm 1969 Wilson đã sản xuất glucose bằng glucoseamylase cố định Năm 1971 đã dùng Chimotrypsin liên kết cộng hóa trị với carboximethyl cellulase làm đông tụ sữa thay cho renin đắt tiền

Enzyme cố định còn được dùng trong chuẩn đoán bệnh Ngoài các ứng dụng điện cực enzyme trong phân tích các chỉ tiêu sinh hóa của máu như ham

16

lượng: glucose, urea, cholesterol, Enzyme Horseradish peroxidase cố định trên polystyren cùng với kháng thể, giúp y học chuẩn đoán nhanh và chính xác hơn (kỹ thuật ELISA)

Enzyme L-asparaginase có khả năng ức chế sự phát triển của u ác tính, nếu đưa trực tiếp enzyme này vào cơ thể sẽ bị đưa ra ngoài nhanh chóng và gây nên hiện tượng di ứng, nhưng nếu đưa các vi tiểu cầu có gắn enzyme vào cơ thể sẽ có hiệu quả cao hơn

2.3.5.3 Trong nghiên cứu khoa học

Năm 1967, điện cực enzyme đầu tiên đã được chế tạo để xác định nồng độ glucose nhờ glucooxydase cố định Điện cực enzyme là điện cực oxy trên bề mặt gel polyacryamide Nhúng điện cực vào dung dịch có glucose thì cơ chất và oxy

sẽ khuyếch tán vào gel chứa enzyme Như vậy sự biến đổi dòng điện trong hệ thống điện cực phụ thuộc vào tốc độ phản ứng và nồng độ glucose

- Kaetsu (1979), dùng điện cực urease để đo nồng độ urese trong máu, dùng cholesterol oxidase đo nồng độ cholesterol

- Ngoài ra enzyme cố định còn có thể được dùng vào nhiều mục đích khác nhau như: hoạt hóa enzyme zymogen, nghiên cứu cấu trúc phân tử protein, sử dụng trong phương pháp sắc ký ái lực để tinh chế một số chất có khả năng liên kết đặc biệt với enzyme Ngày nay có nhiều qui trình sử dụng tế bào cố định để xử lý nước thải đạt hiệu quả

2.3.5.4 Trong bảo vệ môi trường

Trong công nghiệp chế biến thực phẩm, rượu, bia, chế biến đường…chất thải, phế phụ liệu của những nhà máy này là nguồn ô nhiễm nặng do giàu chất hữu cơ Do đó có thể sử dụng enzyme cố định để xử lý nước thải sinh học nhằm làm giảm thiểu hàm lượng hữu cơ trước khi đưa ra ngoài môi trường bên ngoài

2.3.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.3.6.1 Tình hình nghiên cứu nước ngoài

Nghiên cứu enzyme cố định bắt đầu từ năm 1916 khi Nelson và Griffin quan sát và cho thấy rằng enzyme invertase của nấm men khi hấp thụ vào than có khả năng thủy phân đường saccharose Sau đó trên thế giới xuất hiện nhiều báo cáo về khả năng cố định các enzyme bằng liên kết đồng hóa trị trên chất mang

17

Năm 1953, Grubhofer và Schleith đã tiến hành cố định được một số enzyme như carboxy peptidase, diastase, pepsine và ribonuclease trên polyaminostyrene bằng liên kết đồng hóa trị và các nghiên cứu trên mới bắt đầu thử nghiệm ứng dụng ở qui mô pilot

Năm 1963, Bernfeld và Wan đã thí nghiệm thành công việc nhốt các enzyme như amylase, trypsin, papain, ribonuclease và polyacryamide

Năm 1969, Wilson đã xây dựng thành công xưởng thực nghiệm để sản xuất glucose bằng glucoseamylase cố định Cũng trong năm này Chibata và những người cộng tác ở công ty Tanabe Seiyaku – Nhật đã là những người đầu tiên thực hiện thành công việc áp dụng enzyme không hòa tan vào sản xuất công nghiệp

Từ những thành công bước đầu này đã mở ra những ứng dụng to lớn của enzyme và tế bào vào công nghiệp một trong những bằng chứng thuyết phục là sử dụng enzyme glucoisomerase cố định trong sản xuất fructose từ glucose ở qui mô công nghiệp Theo số liệu thống kê 1988 có khoảng 7 triệu tấn siro fructose/năm được sản xuất trên thế giới nhờ công nghệ này

Năm 1970, Mosbach đã tiến hành cố định 3 loại enzyme: β-galactosidase, hexokinase, glucophosphatase bằng liên kết cộng hóa trị với các hạt sephadex

Năm 1973, Chibata và ctv là những người đầu tiên thành công trong việc cố định tế bào vi sinh vật để sản xuất L-aspartate từ amonium fumarate bằng gel

acrylamide Tế bào E.coli chứa trong gel có hoạt tính aspartase rất cao

2.3.6.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Nghiên cứu cố định enzyme chỉ mới bắt đầu ở Việt Nam trong vài năm gần đây, kết quả thu được cũng còn nhiều hạn chế

- Năm 1994 - 1995, Viện sinh học Nhiệt Đới Thành Phố Hồ Chí Minh nghiên cứu cố định enzyme glucoisomerase trên các hạt Silochrom B2 hoạt hóa bằng glutaraldehyde

- Nguyễn Quang Tâm (2002) đã nghiên cứu cố định pectinase thu thập từ các chủng nấm mốc, Nguyễn Quyết (2004) đã nghiên cứu cố định α – amylase thu

nhận từ vi khuẩn Bacillus subtilis

18

- Vỏ Tấn Thiện (1995), nghiên cứu cố định enzyme glucoamylase lên giá thể polyhydroxy ethyl metrhcryla (PHEMA) bằng phương pháp polymer hóa bức xạ ở nhiệt độ thấp

- Lê Văn Hiệp (1995), cố định vi khuẩn tả (Vibrio cholerea) lên giá thể PHEMA bằng kỷ thuật bức xạ, Nguyễn Quốc Hiến (1996) đã nghiên cứu chế tạo chế phẩm hormon progesteron thải chậm bằng kỷ thuật bức xạ

- Lê Quang Luân (1997) đã cố định vi khuẩn Pseudomonas maltophlla để xử lý chất hữu cơ nước

- Nguyễn Anh Dũng (1999) đã nghiên cứu cố định enzyme trypsin trong gel copolymer hóa ghép chitosan – PHEMA

2.3.7 Vật liệu cố định, đại cương về Natrialginate và Chitosan

2.3.7.1 Những yêu cầu của một chất mang lý tưởng

Theo Trevan một chất mang lý tưởng cần có những tính chất sau

- Một chất mang lý tưởng sử dụng trong cố định enzyme điều trước hết là phải rẽ tiền Điều này liên quan tới hiệu quả kinh tế của qui trình công nghệ, đặc biệt có ý nghĩa khi qui trình đó ứng dụng ở qui mô công nghiệp

- Chất mang phải có tính chất cơ lý bền vững, ổn định, nhờ đó mà chịu được điều kiện của môi trường như khuấy trộn, áp lực trong quá trình sản xuất

- Về mặt hóa học, chất mang phải bền vững, không tan trong môi trường phản ứng Chất mang không được làm mất hoạt tính enzyme, không gây ra những phản ứng hấp thụ không đặc hiệu

- Chất mang phải có tính kháng khuẩn cao, bền vững với sự tấn công của vi sinh vật trong môi trường phản ứng

- Chất mang phải có độ trương tốt, có diện tích tiếp xúc bề mặt lớn Tính chất này của chất mang vừa tăng khả năng tiếp xúc của cơ chất với enzyme, nhờ

đó làm tăng hoạt tính của enzyme cố định và số lần tái sử dụng

- Chất mang có thể có cấu trúc lỗ xốp, siêu lỗ, có thể ở dạng hạt, dạng màng, dạng phim mỏng

2.3.7.2 Phân loại

Tất cả các chất mang dùng trong cố định enzyme được chia thành hai nhóm la: chất mang polymer và chất mang vô cơ

19

a Chất mang polymer: gồm polymer tổng hợp và polymer tự nhiên

Chất mang là các polymer tổng hợp (synthetic polymer): polyacryamide, polyester, polyvinylacetate, polyacryalic, polyhydroxyethylacrylate Ưu điểm chung của polymer tổng hợp là bền, tính chất cơ lý tốt, không bị tấn công của vi khuẩn, độ trương tốt, một số polymer có thể điều chỉnh kích thước siêu lỗ Tuy nhiên nó cũng có một số nhược điểm nhất định là một số giá thành cao, và một nhược điểm quan trọng nữa là do quá bền vững, không thể phân hủy trong tự nhiên vì nó gây ô nhiễm môi trường

Chất mang là polymer tự nhiên (natural polyme): cellulose, alginate, tinh bột, polysaccharide, protein

- Chất mang là protein: thường dùng là gelatin, albumin, keratin, vật liệu thường dễ tạo màng, tạo hạt

- Chất mang polysaccharide: là nhóm chất mang đang thịnh hành và được

sử dụng thương mại rộng rãi nhất hiện nay đó là cellulose, alginate, agarose, chitin, chitosan và các dẫn xuất của chúng

b Chất mang vô cơ: Ngoài các polymer được sử dụng làm chất mang Còn

một số chất mang vô cơ đã được sử dụng thương mại như: sợi bông thủy tinh, silicum oxide, alluminium oxide, kaolin Đây là những dạng oxide có cấu trúc lỗ xốp và có khả năng hấp thụ tốt

2.4 Đặc điểm của Natrialginate và Chitosan

2.4.1 Đặc điểm, tính chất của Chitin và Chitosan

a Chitin

Chitin là polisaccarit mạch thẳng, có thể xem như là dẫn xuất của xenlulozơ, trong đó nhóm (-OH) ở nguyên tử C(2) được thay thế bằng nhóm axetyl amino (-NHCOCH3) (cấu trúc I) Như vậy Chitin là poli (N-axety-2-amino-2-deoxi-b-D-glucopyranozơ) liên kết với nhau bởi các liên kết b-(C-1-4) glicozit

Trong đó các mắt xích của Chitin cũng được đánh số như của glucozơ:

Hình 2.5 Cấu trúc phân tử Chitosan

(http://www.hoahocvietnam.com)

c Tính chất của Chitosan

- Trọng lượng phân tử của Chitosan tùy thuộc vào điều kiện sản xuất thường nằm trong khoảng 10.000 – 1000.000 dalton với mức độ deacetyl hóa thường 70% - 90%

- Chitosan ở thể rắn, màu trắng ngà, không mùi không vị, không tan trong nước, kiềm và acid đậm đặc, nhưng tan trong acid loãng (0,5% - 1,5%) tạo thành dung dịch keo, trong suốt Lợi dụng tính chất này của Chitosan để thực hiện cố định enzyme bằng phương pháp nhốt

21

- Nhiệt độ nóng chảy là 309oC - 311oC

- Chitosan có cấu trúc siêu lỗ, dễ tạo màng, tạo hạt, khả năng hấp thụ tốt, tính chất cơ lý bền vững, ổn định, thường được dùng để cố định enzyme qua cầu nối glutaraldehyde

- Ngoài ra, Chitosan còn được xem là nguồn nguyên liệu vô cùng quí giá để cho ra các dẫn xuất Chitosan rất hấp dẫn trong các lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, sinh học và bảo vệ môi trường

2.4.2 Đặc điểm, tính chất của Natrialginate

Là chuỗi polymer mạch thẳng không phân nhánh, là dẫn xuất của alginic kết hợp với cation của kim loại natri Na+, cấu trúc của alginate gồm hai acid hợp thành: acid α-L-guluronic (gọi tắc là G) và acid β-D-manuronic (gọi tắc là M) qua liên kết 1-

4 glycosit Natrialginate có nguồn gốc từ một loại tảo nâu có các tính chất sau

Hình 2.6 Cấu trúc đoạn phân tử Natrialginate và gốc acid cấu tạo nên chúng

(www.fao.org/docrep/W6355E/w6355e1w.gif)

a Khả năng tạo độ nhớt

Khi muối Natrialginate hòa tan vào trong nước, tạo ra một dung dịch đặc (gia tăng độ nhớt của dung dịch trong nước) Độ nhớt của Natrialginate tùy thuộc vào từng loại rong biển, vào từng giai đoạn sinh trưởng của rong và đặc điểm quan trọng hơn là phương pháp tách chiết rong Để gia tăng độ nhớt, trong quá trình tách chiết alginate, người ta thường bổ sung một số phụ gia để thu được sản phẩm có độ nhớt mong muốn

Bên cạnh đó độ nhớt của Natrialginate còn phụ thuộc vào quá trình bảo quản Natrialginate ở dạng bột, để sau một thời gian thì độ nhớt giảm đáng kể Do đó người

ta thường thêm vào một lượng canxi sao cho chưa đến ngưỡng tạo gel

22

b Khả năng tạo gel của Natrialginate

Trong điều kiện bình thường, các gốc -COO của các phân tử guluronic sẽ hình thành liên kết hidro với ion Na+ có trong dung dịch Khi đưa vào môi trường các ion kim loại như Ca2+, Ba2+, Sr2+, các cation này sẽ thay thế vào vị trí của Na+, nối các chuỗi guluronic lại với nhau sẽ hình thành cấu trúc mạng lưới không tan trong nước, cấu trúc này được gọi là gel

Khả năng tạo gel của Natrialginate với các cation là khác nhau, độ bền của gel tăng dần theo thứ Ca2+<Sr2+<Ba2+ Trong đó Ca2+ là tác nhân tạo gel được sử dụng nhiều nhất và không gây độc hại

Để tạo gel Natrialginate không cần sức nóng, đây là sự tương phản so với gel agar (sử dụng sức nóng khoảng 80oC để hòa tan agar và hình thành gel dưới 40oC)

Tỉ lệ M/G là hai đơn vị cơ bản trong chuỗi có thể thay đổi từ những loài rong biển khác nhau Hàm lượng G cao tạo gel bền nhưng giòn và dễ tan chảy, hàm lượng M cao giúp cho gel đàn hồi và ít bị tan chảy

c Khả năng tạo màng

Khi tạo gel nước sẽ thoát ra ngoài cấu trúc của gel Để có khả năng này, trọng lượng của phân tử Natrialginate phải lớn hơn trọng lượng phân tử nước Tính chất này được ứng dụng trong việc tạo nên một lớp phủ bên ngoài

Ngoài ra Natrialginate còn có một số tính chất khác như tan được trong nước, tạo độ phồng

23

Chương 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành

Natralginate mua ngoài thị trường

Chitosan: được cung cấp bởi Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp.HCM

3.2.3 Hóa chất

a Hóa chất nuôi và thu nhận enzyme lipase

- Các hoá chất dùng để chuẩn bị môi trường giữ giống và bổ sung vào môi trường lên men bán rắn gồm: (NH4)2SO4, KH2PO4, urea, glucose, peptone, CaCl2, MgSO4.7H2O, FeSO4.7H2O, MnSO4.H2O, ZnSO4, CoCl2

- Các hoá chất dùng pha dung dịch đệm: NaHPO4, KH2PO4

- Cồn 960

b Hóa chất để cố định enzyme là: đệm phosphate pH7, CaCl2, acid acetic1%, Tripolyphosphate (TTP 3%)

c Hóa chất để xác định hoạt tính của enzyme

Các hoá chất dùng xác định hàm lượng protein: albumin, thuốc thử Bradford (Coomassie Brilliant Blue, Ethanol tuyệt đối, Acid phosphoric)

Các hoá chất dùng để xác định hoạt tính enzyme: HCl, NaOH, Aceton, Ethanol tuyệt đối, dầu olive, dung dịch PVA

3.2.4 Môi trường

a Môi trường giữ giống PGA (Potato glucose agar)

b Môi trường Czapek (bổ sung cho môi trường lên men bán rắn)

Bảng 3.2 Thành phần môi trường Czapek Thành phần Khối lượng (g)

A: cơ chất nuôi cấy (g)

B: độ ẩm muốn bổ sung vào môi trường (%)

C: độ ẩm trong cơ chất A (chiếm 10% khối lượng cơ chất A) (%)

100: độ ẩm 100%

F: lượng nước cần bổ sung vào môi trường để đạt độ ẩm thích hợp (ml)

c Môi trường cảm ứng tạo enzyme và thu nhận enzyme

- Dung dịch dinh dưỡng dựa theo môi trường Mandel có thành phần (%): (NH4)2SO4 0,14; KH2PO4 0,2; Urea 0,03; CaCl2 0,03; MgSO4.7H2O 0,03; peptone 0,075 và 10 ml dung dịch khoáng vi lượng có nồng độ như sau: FeSO4.7H2O 1,275 (g/l); MnSO4.H2O 0,465 (g/l); ZnSO4 0,415 (g/l); CoCl2 0,5 (g/l)

= F

25

Tiến hành pha riêng từng loại hoá chất có trong thành phần của môi trường Mandel dưới dạng các dung dịch mẹ, hút chính xác thể tích từng loại dung dịch mẹ để đạt từng loại phần trăm bằng với nồng độ có trong môi trường Mandel

- Cám gạo: là sản phẩm phụ của quá trình xay xát và chế biến gạo Cám được thu hồi dưới 2 dạng là cám thô và cám ướt Cám gạo thường có dạng bột, mềm và mịn Cám gạo chiếm khoảng 10 - 12% khối lượng lúa chưa xay xát

Bảng 3.3 Thành phần dinh dưỡng của cám gạo

(theo http://www.nutritiondata.com/)

Thành phần Khối lượng/100g

Calori Tổng số lipit Chất béo bảo hòa Chất xơ tiêu hóa được Carbohydrat

Đường Protein Vitamin E Vitamin B6 Canxi

316 KJ 21g

4 g 21g

28 g 0,9 g 13,3 g 4,9 mg 4,1 mg

57 mg

- Bã đậu nành có hàm lượng xơ cao, bao gồm chất xơ hoà tan và chất xơ không hoà tan Chất xơ không hoà tan có tác động chống táo bón, ngăn ngừa ung thư ruột kết, ung thư đại tràng, giảm nguy cơ trĩ, chống béo phì và bệnh tiểu đường Chất xơ hoà tan có khả năng tan trong nước thành dung dịch keo Bã đậu nành cùng với cám gạo tạo môi trường bán rắn, môi trường cảm ứng tạo enzyme lipase tốt nhất

Máy xay sinh tố

Các dụng cụ thủy tinh thông dụng

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp giữ nấm mốc trên môi trường thạch nghiêng

Khoai tây sau khi gọt vỏ, rửa sạch, cắt lát đem đi nấu với nước cất trong 30 phút sau đó lọc chiết lấy nước Cho agar vào nấu, trong quá trình nấu khuấy đều Cho glucose vào và khuấy đều Cho môi trường vào ¼ các ống nghiệm, sau đó đem khử trùng ở 1210C, 1 atm trong 20 phút sau đó đem làm thạch nghiêng

Đốt nóng miệng của 2 ống nghiệm trên đèn cồn Đưa que cấy (được khử trùng) vào ống canh trường và lấy một ít canh trường vi sinh vật rồi đưa đầu que cấy vào tận đáy ống môi trường Nhẹ nhàng hoà giọt canh trường vi sinh vật vào giọt nước ngưng

tụ ở đáy, kéo đầu que cấy phía trên mặt thạch từ đáy lên trên theo đường zíczắt

Rút que cấy ra, đốt miệng ống nghiệm và nút bông rồi đậy lại Để các ống nghiệm vào giá, đốt que cấy trên đèn cồn rồi để vào chỗ cũ

Tất cả các thao tác cấy đều được thực hiện trong buồng cấy vô trùng

Ủ ở nhiệt độ phòng (280C) 2 - 3 ngày

Sau khi cấy chuyền ống giống phải được bảo quản ở điều kiện lạnh 4 - 70C Sau thời gian định kỳ khoảng 15 ngày hay một tháng sẽ phải cấy chuyền lại Công việc cấy chuyền theo định kỳ được thực hiện liên tục

27

3.3.2 Phương pháp nuôi nấm trên môi trường lúa

Đối với Asperillus niger độ ẩm thích hợp khi nuôi cấy trong môi trường lúa là

55% (được tính theo công thức nêu ở mục 3.2.4)

Môi trường lúa gồm: 20g lúa, 9 ml nước, khoáng bổ sung gồm các hóa chất theo môi trường Czapek

Tiến hành hút dịch chứa nấm mốc từ ống nghiệm cấy chuyền chuyển sang môi trường lúa Để môi trường lúa ở điều kiện phòng từ 3 đến 5 ngày Tiếp tục chuyển dịch sinh khối nấm sang môi trường cảm ứng tạo enzyme

3.3.3 Phương pháp thu sinh khối nấm trên môi trường cảm ứng tạo enzyme

Đối với môi trường cảm ứng tạo enzyme thì độ ẩm thích hợp là 65% (được tính

theo công thức được nêu ở mục 3.2.4)

Tỷ lệ cơ chất trong môi trường cám gạo: Cám gạo : bã đậu nành : trấu = 1 : 2 : 1 Chuyển 20g bã đậu nành : cám mì : cám gạo theo tỷ lệ trên vào các erlen có dung tích 250 ml

Cho môi trường Mandel dùng để nuôi cấy nấm sợi A niger vào các erlen trên

sau đó bổ sung thêm môi trường Czapek

Sau đó tiến hành điều chỉnh theo độ ẩm, pH, nồng độ môi trường, thời gian nuôi cấy, tỷ lệ giống

Khử trùng môi trường ở 1210C trong 20 phút, làm nguội

Chuyển huyền phù bào tử của nấm sợi trên vào các bình tam giác trên, nuôi ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian 48 giờ, tiến hành thu nhận enzyme

3.3.4 Phương pháp tủa enzyme

1:4 khuấy 40 phút, đem lọc, ly tâm 6000 vòng/10phút thu được dịch chiết enzyme thô

Dịch chiết enzyme thô được đem đi tủa enzyme bằng 3 phương pháp: tủa bằng cồn 96o, aceton, muối (NH4)2SO4 (% độ bảo hòa)