NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH ENZYME GLUCOSE OXIDASE TRÊN CẢM BIẾN NANO SINH HỌC ĐỂ KIỂM TRA VÀ ĐỊNH LƯỢNG GLUCOSE

TÓM TẮT Đề tài “Nghiên cứu cố định enzym glucose oxidase trên cảm biến nano sinh học để kiểm tra và định lượng glucose” được thực hiện từ tháng 9/2008 đến tháng 7/2009 tại phòng thí ngh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH ENZYME GLUCOSE OXIDASE TRÊN CẢM BIẾN NANO SINH HỌC ĐỂ KIỂM TRA

VÀ ĐỊNH LƯỢNG GLUCOSE

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH ENZYME GLUCOSE OXIDASE TRÊN CẢM BIẾN NANO SINH HỌC ĐỂ KIỂM TRA

VÀ ĐỊNH LƯỢNG GLUCOSE

PGS TS NGUYỄN TIẾN THẮNG

Tháng 07/2009

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Đặng Mậu Chiến, Giám đốc phòng thí nghiệm Công Nghệ Nano-Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh, đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để em hoàn thành đề tài

Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã tư vấn em tiếp cận với lĩnh vực công nghệ Nano và giúp đỡ trong chuyên môn

để hoàn thành đề tài này

Em cũng xin gởi lời cảm ơn đến TS Tống Duy Hiển, trưởng nhóm nghiên cứu Biosensor Người đã chỉ bảo cho tôi cách làm việc và nghiên cứu khoa học một cách nghiêm túc và hết mình

Trong thời gian thực hiện đề tài, KS Lê Thị Thanh Tuyền đã quan tâm theo sát

và tận tình hướng dẫn em, những ý kiến đóng góp quý báu của chị là nguồn động lực giúp em hoàn thành khóa luận này Em xin chân thành cảm ơn chị

Em xin chân thành cảm ơn các bạn và các anh chị nghiên cứu viên, anh Phạm Xuân Thanh Tùng-nhóm Biosensor- đã giúp đỡ em trong thời gian hoàn thành luận văn này

Xin cảm ơn quý thầy cô trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã truyền đạt những kiến thức cho em trong suốt những năm đại học

Anh cảm ơn em đã ở bên cạnh, động viên và hỗ trợ anh vào những thời điểm khó khăn nhất trên chặng đường đã qua

Con xin cảm ơn cha mẹ, gia đình đã nuôi dạy và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho việc học tập của con Con biết ba mẹ đã luôn dõi theo những bước con đi, an ủi, động viên con những lúc khó khăn, con đã tự nhủ sẽ cố gắng hết sức mình và đây là thành quả của con, con muốn được chia sẻ nó với mọi người

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2009

Trần Phú Duy

TÓM TẮT

Đề tài “Nghiên cứu cố định enzym glucose oxidase trên cảm biến nano sinh học để kiểm tra và định lượng glucose” được thực hiện từ tháng 9/2008 đến tháng 7/2009 tại phòng thí nghiệm Công nghệ Nano - Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh với vật liệu nghiên cứu là các sợi nano Platin và enzym glucose oxidase

Khóa luận gồm hai phần chính Phần cố định enzyme lên sợi nano Platin bao gồm quá trình khảo sát đặc tính của các loại màng trước khi cố định Các loại màng được tạo ra bằng nhiều phương pháp khác nhau sau đó tiến hành khảo sát đặc tính bằng kính hiển vi kim loại học và kính hiển vi điện tử Quá trình cố định enzyme được tiến hành trên ba thế hệ cảm biến Ở cảm biến thế hệ 1, enzyme được cố định thông qua các màng Còn cảm biến thế hệ 2, enzyme được cố định dựa vào lớp trung gian trong khi cảm biến thế hệ 3 enzyme được cố định qua sự gắn kết với nhóm chức hóa học trên bề mặt sợi nano Platin

Phần kiểm tra định lượng Glucose sẽ trình bày quá trình khảo sát các đặc tính sợi nano Platin bằng cách quét trong dung dịch PBS buffer, dung dịch Glucose và dung dịch H2O2 bằng máy điện hóa Autolab Cảm biến sau khi cố định enzyme được kiểm tra bằng cách định lượng dung dịch Glucose có nồng độ từ 0 – 16 mM bằng phương pháp quét thế dòng tuần hoàn

Tiếp tục sử dụng phương pháp quét thế vòng tuần hoàn để tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định enzyme như nhiệt độ, độ pH, nồng độ dung dịch PBS buffer Kiểm tra độ ổn định và độ lặp lại của cảm biến sau mỗi 10 ngày tồn trữ Trích xuất dữ liệu, vẽ đồ thị bằng phần mềm Autolab và Microsoft Office Excel 2007

Kết quả quá trình tạo màng và khảo sát đặc tính màng cho thấy phương pháp phủ phun tạo màng Chitosan và màng kết hợp Gelatin và SiO2 có độ rỗ bề mặt cao, màng phẳng, mịn, các lỗ có kích thước từ 6-10 μM rất thích hợp cho quá trình cố định enzyme Quá trình kiểm tra định lượng Glucose bằng các loại cảm biến đã cố định cho thấy cường độ dòng gia tăng tuyến tính với nồng độ Glucose với hệ số tương quan R2

= 0,9916 chứng tỏ enzyme đã được cố định thành công

Kết quả quá trình kiểm tra định lượng Glucose của cảm biến sau cố định cho thấy ngưỡng phát hiện Glucose là 60 μM, xác định được đỉnh oxi hóa khử tổng hợp tại thế +0,8 V Quá trình cố định lý tưởng nên có nồng độ PBS buffer 100 mM, pH dung dịch 6,8 đến 7,2 và nhiệt độ dung dịch là 20 – 300C Sau hơn 30 ngày tồn trữ cảm biến

độ ổn định của cảm biến còn 63,35% và có độ lặp lại khá cao

Với những kết quả đạt được, đề tài nghiên cứu cố định enzyme Glucose trên cảm biến nano sinh học là bước khởi đầu trong cả quá trình chế tạo thiết bị đo hàm lượng Glucose trong máu người

The thesis “Study on the immobilization of glucose oxidase on bio-nanosensors for glucose quantitative analysis” was carried out at laboratory for Nanotechnology – National University, Ho Chi Minh City from 9/2008 to 7/2009 The main materials using for this study are nanowires and glucose oxidase

Our thesis consists of two major parts The immobilization of enzyme on Platinum nanowires part include the membrane creation and check out the membrane characteristics prior to the enzyme immobilization We synthesize membrane in many different procedures and check their properties by using metal microscope and scanning electron microscope (SEM) Enzyme immobilization was carry out in three generation glucose sensors In the first generation glucose sensor, enzymes were immobilized via membrane however in the next generation enzymes were linked by the mediator In the third generation, enzymes were immobilized on the nano platinum surface directly through many functional chemical groups

In the next part, the glucose quantitating process includes many experiments to study the nanowire properties by using Autolab machine mode Cyclic Voltametry to scan these wires in PBS buffer solution, glucose solution and peroxide hydro solution The main experiment in this part is the process of scanning immobilized sensors in different glucose solution from 0 to 16 mM

Continuing using Cyclic Voltametry mode in Autolab machine, we scan the immobilized sensors in different solution to test any major elements which affect the immobilizing like solution temperature, pH level and PBS buffer concentration After that, we test the durability and repetitiveness of sensors in each 10 days storage Extracting and calculating the data by using specific Autolab sofware and Microsoft Office Excel 2007

The experiment results show that spraying method is suitable for the synthesis

of Chitosan membrane and Gel-SiO2 composite membrane due to the high porous in the membrane surface Moreover, pores dimension around 6– 10 μm express the ideal membrane for enzyme immobilizing

The experiment results of the immobilized-chip have proved the succeed of Glucose oxidase immobilization on nano platinum surface The current increases when

we add more glucose in the PBS solution is the key factor for the calibration of current diagram as a linear line with R2=0,9916

The immobilized-chips also demonstrate their ultra sensitive when they detected a hyper sparse solution up to 60 µM glucose concentration Moreover, the experiment results also express the specific oxidation peak at +0,8 V which is useful for the signal analysis in later times The suitable media for glucose immobilization includes an approximately pH level from 6.8 to 7.2 in the PBS buffer solution, the optimization temperature solution around 20-300C and 100 mM PBS buffer solution concentration After 30 days storage, the immobilized sensors also keep their characteristics up to 63,35% in durability and show a high level of repetitiveness

The thesis “Study on the immobilization glucose oxidase on bio-nanosensors for glucose quantitative analysis” is a minor step in a whole process of studying about Glucose meter for Glucose detection in Human blood

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP iii

VÀ ĐỊNH LƯỢNG GLUCOSE iii

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC iii

Tháng 07/2009 iii

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP iv

VÀ ĐỊNH LƯỢNG GLUCOSE iv

Hướng dẫn khoa học: Sinh viên thực hiện: iv

PGS TS ĐẶNG MẬU CHIẾN TRẦN PHÚ DUY iv

PGS TS NGUYỄN TIẾN THẮNG iv

Tháng 07/2009 iv

LỜI CẢM ƠN iii

TÓM TẮT iv

DANH SÁCH CÁC BẢNG xviii

DANH SÁCH CÁC HÌNH xix

Chương 1 1

1.1 ĐặT VấN Đề 1

1.2 MụC TIÊU CủA Đề TÀI 2

1.3 MụC ĐÍCH 2

1.4 NộI DUNG THựC HIệN 2

Chương 2 3

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 NGUYÊN LÝ LÀM VIệC CủA CảM BIếN GLUCOSE DựA TRÊN CấU TRÚC SợI NANO PLATIN 3

2.1.1 Cảm biến sinh học (Biosensor) 3

2.1.1.1 Tổng quan về cảm biến sinh học 3

2.1.1.2 Cấu tạo chung của cảm biến sinh học 3

2.1.1.3 Một số ứng dụng của cảm biến sinh học trên thế giới 4

2.1.2 Các loại cảm biến Glucose 4

2.1.2.1 Cảm biến glucose thế hệ 1 (First-generation glucose sensor) 5

2.1.2.2 Cảm biến glucose thế hệ 2 (Second-generation glucose sensor) 6

2.1.2.3 Cảm biến Glucose thế hệ 3 (Third-generation glucose sensor) 6

2.1.3 Cảm biến glucose dựa trên cấu trúc sợi nano Platin 7

2.1.3.1 Sợi nano platin (platinum nanowire) 8

2.1.3.2 Enzyme glucose oxidase (GOx) 9

2.2 MộT Số PHƯƠNG PHÁP DÙNG CHO QUÁ TRÌNH Cố ĐịNH ENZYME VÀ KIểM TRA CảM BIếN SAU Cố ĐịNH 14

2.2.1 Các phương pháp tạo màng dùng cho cảm biến glucose 14

2.2.1.1 Phương pháp phủ nhúng (dip coating) 14

2.2.1.2 Phương pháp phủ quay (spin coating) 15

2.2.1.3 Phương pháp phủ phun (spray coating) 16

2.2.1.4 Phương pháp polymer điện hóa (electropolymerization) 17

2.2.1.5 Phương pháp tạo màng có tăng cường plasma 17

2.2.1.6 Phương pháp lắng đọng hơi hóa học có tăng cường Plasma (PECVD) 18

2.2.2 Chất trung gian (mediator) và kĩ thuật tổng hợp chất trung gian 18

2.2.3 Các phương pháp cố định enzyme glucose oxidase 20

Khi cố định enzyme lên bề mặt Platin thì điều quan trọng là phải chọn phương pháp gắn kết ngăn chặn việc mất hoạt tính của enzyme bằng cách không thay đổi cấu trúc hoá học hoặc nhóm phản ứng trong vị trí liên kết của enzyme Một vị trí gắn kết sẽ được bảo vệ trong suốt quá trình gắn kết cũng như được loại bỏ sau đó mà không làm mất hoạt tính của enzyme 20

Trong một vài trường hợp bề mặt enzyme cố định có khả năng duy trì cấu trúc thông qua liên kết hydrogen hoặc thông tin của phức hợp chuyển điện tử Những liên kết này sẽ ngăn ngừa sự rung động của enzyme và do đó sẽ gia tăng sự ổn định với nhiệt Bề mặt của enzyme và môi trường có một sự tích điện nên gây ra sự thay đổi pH tối ưu của enzyme lên đến 2 đơn vị pH Điều này tạo ra một khoảng rộng pH trong vùng làm việc của enzyme, cho phép mỗi enzyme có vùng hoạt động chuyên biệt 20

20

2.2.3.2 Phương pháp hấp phụ 20

Trộn enzyme với một chất hấp phụ phù hợp, trong điều kiện tối ưu về pH, nồng độ ion, rồi cho hấp phụ lên bề mặt điện cực trong khoảng thời gian nhất định, sau đó rửa để loại đi những enzyme liên kết yếu hay không liên kết Lực liên kết ở đây do sự kết hợp giữa hiệu ứng kị nước và sự tạo thành liên kết muối trên phân tử enzyme .20

Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, ứng dụng rộng rãi và có thể cố định được nhiều enzyme .21

Nhược điểm là liên kết vật lý giữa enzyme và chất mang thường mạnh nhưng cũng có thể bị khử bởi nhiều tác nhân chẳng hạn sự gia tăng lượng cơ chất hay sự thay đổi pH hoặc lực ion .21

2.2.3.3 Phương pháp bẫy 21

2.2.3.4 Phương pháp liên kết ngang (Cross-link) 22

2.2.3.5 Phương pháp liên kết cộng hóa trị (covalent binding) 22

2.2.4 Kĩ thuật tạo lớp đơn tự ghép (self-assembled monolayer SAMs) 23

2.2.4.1 Tổng quan về lớp đơn tự ghép (SAMs) 23

2.2.4.2 Nguyên lí của sự hình thành SAMs 23

2.2.4.3 Đặc tính của lớp đơn tự ghép 23

2.2.5 Kỹ thuật quét thế dòng tuần hoàn (CV – cyclic voltammetry) 24

2.2.5.1 Tổng quan về kỹ thuật quét thế dòng tuần hoàn 24

2.2.5.2 Nguyên lí tiến hành 25

2.2.5.4 Đặc điểm của quét thế dòng tuần hoàn 27

2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ QUÁ TRÌNH Cố ĐịNH ENZYME .28

2.3.1 Kính hiển vi điện tử quét (SEM) 28

2.3.2 Hệ thiết bị phân tích điện hóa đa năng Autolab 30

Chương 3 32

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

3.1 THờI GIAN VÀ ĐịA ĐIểM TIếN HÀNH 32

3.1.1 Thời gian 32

3.1.2 Địa điểm 32

3.2 VậT LIệU VÀ THIếT Bị THÍ NGHIệM 32

3.2.1 Hóa chất 32

3.2.2 Vật liệu thí nghiệm 32

Sợi nano platin: Cảm biến glucose trên nền sợi nano Platin phần thiết kế chế tạo sợi nano (nano fabrication) đã được tiến hành bởi Tiến sĩ Tống Duy Hiển và cộng tác viên Vì thiết kế sợi nano Platin không nằm trong phạm vi nghiên cứu của đề tài nên chúng tôi cũng chỉ trích dẫn một vài nét chính về đặc điểm sợi nano và phương pháp chế tạo: 32

3.2.3 Thiết bị 33

3.3 NộI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CứU 34

3.3.1 Nội dung 34

3.3.2 Chuẩn bị hóa chất và vật liệu thí nghiệm 34

3.3.2.1 Chuẩn bị hóa chất 34

3.3.2.2 Chuẩn bị vật liệu thí nghiệm 36

3.3.2.3 Tạo màng và khảo sát các đặc tính của màng 36

3.3.2.4 Khảo sát đặc tính của sợi nano platin 39

3.3.2.5 Cố định enzyme theo thế hệ cảm biến và kiểm tra định lượng Glucose 41

3.3.2.6 Khảo sát độ ổn định, lặp lại và các yếu tố ảnh hưởng quá trình cố định enzyme 46

3.3.2.7 Quá trình phân tích và xử lý số liệu 47

Chương 4 48

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48

4.1 KếT QUả TạO MÀNG VÀ KHảO SÁT CÁC ĐặC TÍNH CủA MÀNG 48

4.1.1 Màng Chitosan và màng Chitosan kết hợp SiO 2 48

Chitosan là sản phẩm biến tính của chitin, là một chất rắn nhẹ, hình vảy, có màu trắng ngà, không tan trong nước, dung dịch kiềm nhưng tan trong axit loãng (pH 6), tạo dung dịch keo trong, có khả năng tạo màng tốt Nhằm tăng cường độ xốp bề mặt màng và gia tăng độ đồng đều chúng tôi tiến hành pha tạp SiO 2 vào màng Chitosan Các kết quả của màng Chi và Chi kết hợp SiO 2 qua ba phương pháp tạo màng thể hiện ở các hình 4.1, 4.2 và hình 4.3 48

48

48

49 Thông qua các hình ảnh chụp được về màng Chitosan và màng kết hợp Chitosan SiO 2 Chúng tôi nhận xét các kết quả thí nghiệm trên như sau: 49 + Màng Chi tạo ra thường có bề mặt ít bằng phẳng và có các rãnh chạy dọc theo phương nhúng (DC-C01) hay có bề mặt phân tán tạo cụm (SPN-C01, DC-C02) đó là do kết quả của quá trình bay hơi không đồng đều trên bề mặt màng Quá trình này xảy ra khi bề mặt màng có độ dày mỏng chênh lệch nhau thêm vào đó khi xuất hiện sự thay đổi về nhiệt độ (lúc cho vào tủ lạnh và lúc rã đông) các màng có bề dày khác nhau sẽ

co dãn khác nhau dẫn đến hiện tượng phân tán trên bề mặt màng Thông thường màng tạo bằng phương pháp phủ nhúng thường dày hơn so với màng tạo bằng

phương pháp quay và phun Cho nên màng tạo bởi ba nghiệm thức trên không thích hợp cho việc chế tạo cảm biến thế hệ 1 49 + Màng Chi tạo ra bằng phương pháp phủ phun (SP-C01), màng kết hợp Chi SiO 2 tạo bằng hai phương pháp quay và phun (SPN-C02, SP-C02) có bề mặt tương đối bằng phẳng do hiệu ứng giữa các hạt SiO 2 và các chuỗi polymer Hạt SiO 2 được tổng hợp từ TEOS (Si(OC 2 H 5 ) 4 ) theo phương trình sau: 49 Si(OC 2 H 5 ) 4 + 2 H 2 O → SiO 2 + 4 C 2 H 5 OH 50 Trong quá trình tạo hạt SiO 2 các phân tử ethanol tạo ra hòa tan vào dung dịch phủ lên chip thì ethanol bốc hơi nhanh nên kéo theo các phân tử nước khiến cho bề mặt khô đi một cách nhanh chóng Thêm vào đó sự có mặt của SiO 2 góp phần trong việc tạo ra tính đồng nhất khi xuất hiện hiện tượng co giãn do nhiệt 50 + Đối với màng Chi tạo bằng phương pháp phủ phun (SP-C01) thì quá trình xảy ra tương

tự Dưới điều kiện áp suất cao khí thóat ra khỏi van của súng phun sẽ tạo một áp lực âm lên bề mặt chất lỏng trong bình chứa khiến các phân tử phân tán thành từng khối cầu dung dịch Chi cực nhỏ bám vào bề mặt chip Khi đó lớp màng tạo thành sẽ rất mỏng và rất đồng đều do nước bốc hơi gần như lập tức để lại cấu trúc màng mỏng khá bằng phẳng thể hiện trên hình 4.4A Trong khi đó màng SP-C02 do độ dày màng quá mỏng và nhiều lỗ nên khi co giãn theo nhiệt độ và quá trình gel hóa đã xảy ra hiện tượng đứt gãy

4.1.2 Màng Gelatine và màng Gelatine kết hợp SiO 2 50

Gelatin là polymer tự nhiên được tạo thành từ sự phân hủy collagen Đặc tính của gelatin là khả năng tạo thành dạng gel có tính đàn hồi khi dung dịch được làm lạnh Tính bền dẻo và độ rỗ (porous) bề mặt tăng khi ta pha tạp thêm SiO 2 50

50

51

4.2 KếT QUả KHảO SÁT ĐặC TÍNH CủA SợI NANO PLATIN 52

4.2.1 Đặc tính sợi nano Platin trong dung dịch PBS 52

Khi quét cảm biến trong hệ điện hóa bao gồm dung dịch điện ly PBS với nồng độ lần lượt là 25, 50 và 100 mM với hệ điện cực WE là sợi nano Platin, RE là Ag/AgCl, CE là dây Pt Các thông số quét không đổi suốt quá trình thao tác Chúng tôi có kết quả như sau: 52

53

4.2.2 Đặc tính sợi nano Platin trong dung dịch Glucose pha trong nước 53 Trong quá trình điện hóa thì hệ điện ly giữ một vai trò rất quan trọng Hệ điện ly có thể hoạt động như chất điện môi hay các kênh vận tải chuyển các chất hòa tan đến vùng làm việc Khi kiểm tra phản ứng của sợi Pt với dung dịch Glucose pha trong nước chúng tôi có được đồ thị như hình 4.11 53

54 4.2.3 Đặc tính sợi nano Platin trong dung dịch Glucose pha trong PBS 54

Để kiểm tra đặc tính của sợi nano Platin đối với dung dịch Glucose chúng tôi tiến hành quét cảm biến sạch trong dung dịch PBS có pha các nồng độ Glucose khác nhau và được kết quả như sau: 54

54 4.2.4 Đặc tính sợi nano Platin trong dung dịch Peroxide Hydro (H 2 O 2 ) 55 Peroxide Hydro là sản phẩm của quá trình oxi hóa Glucose dưới sự xúc tác của GOx Nói cách khác khoảng thế oxi hóa của Glucose cũng chính là khoảng thế hình thành H 2 O 2 55 Phát hiện khoảng thế tại đó tạo ra H 2 O 2 sẽ giúp ích rất nhiều cho việc biện luận kết quả cũng như tối ưu hóa qui trình đo đạc và cố định enzyme Đồ thị của quá trình quét thế

H O được thể hiện như hình 4.13 55

55

Qua đồ thị chúng tôi nhận thấy có sự gia tăng đáng kể về cường độ dòng theo nồng độ H 2 O 2 tuy nhiên chúng tôi không thấy xuất hiện đỉnh đặc trưng cho H 2 O 2 tại thế +0,6 V đến +0,7 V Sau một thời gian nghiên cứu chúng tôi kết luận như sau: đỉnh (peak) H 2 O 2 không xuất hiện một cách đặc trưng mà xuất hiện dưới dạng peak tổng hợp trong hệ dung dịch Đó là kết quả tác động cộng hợp của nhiều yếu tố 55

+ Khi chế tạo sợi nano Platinum trên đế Silic (Si) vì Pt bám dính kém trên Si nên phải tạo một lớp Crôm (Cr) nano dày khoảng 10 – 20 nm làm vật liệu bám dính cho Pt nên tính chất điện của Pt trong dung dịch không còn đặc trưng riêng của Pt mà là sự kết hợp của hai loại kim loại 55

+ Peroxyde hydro phân hủy nhanh trong nước khi được các ion tải chuyển đến bề mặt điện cực sinh ra Oxy nguyên tử và nước Quá trình phân tách này sinh ra điện tử trên bề mặt Pt Oxy nguyên tử này một phần sẽ kết hợp để chuyển sang dạng khí bền vững, một phần khác sẽ Oxy hóa lớp Cr và lớp keo epoxy dùng gắn đường dẫn Quá trình này sẽ nhận điện tử Nếu vùng làm việc là một lớp Pt nguyên chất thì chỉ có quá trình phân tách H 2 O 2 thành oxy nguyên tử và nước do đó sẽ xuất hiện một peak đặc trưng cho quá trình này Trong trường hợp này peak đặc trưng ấy lại kết hợp với một một hoặc nhiều peak khác tạo nên hiệu ứng tổng hợp khiến cho đồ thị thể hiện dưới dạng peak không đặc trưng tại thế +0,8 V – 1 V 56

4.3 KếT QUả QUÁ TRÌNH Cố ĐịNH ENZYME VÀ KIểM TRA ĐịNH LƯợNG GLUCOSE 56

4.3.1 Cảm biến Glucose thế hệ 1 56

4.3.1.1 Phương pháp tạo màng kết hợp Gelatin và SiO 2 56

56

4.3.1.2 Phương pháp tạo màng Chitosan 58

59

59

Qua quá trình khảo sát định lượng cảm biến Glucose thế hệ 1 với nhiều nồng độ Glucose Chúng tôi có một số nhận xét như sau: 59

4.3.2.1 Kết quả quá trình cố định enzyme 61

4.3.2.2 Quá trình kiểm tra và định lượng Glucose 62

4.3.3 Cảm biến thế hệ 3 66

4.3.3.1 Kết quả quá trình cố định enzyme 66

4.3.3.2 Quá trình kiểm tra và định lượng Glucose 68

69

4.3.4 Khảo sát độ ổn định, độ lặp lại và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định enzyme 71

4.3.4.1 Độ ổn định và độ lặp lại sau thời gian tồn trữ của cảm biến 71

71

72

4.3.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định enzyme 72

Chương 5 75

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 75

5.1 KếT LUậN 75

5.2 Đề NGHị 75

TÀI LIỆU THAM KHẢO 76

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT A: Ampe CE: Counter Electrode

Chi: Chitosan

Ctv: Cộng tác viên

CV: Cyclic Voltametry

Cglc: Nồng độ Glucose

Da: Dalton

DC: Dip-coat

DI: De-ion

FAD : Flavin Adenin Dinucleotide

Gel: Gelatin

GOx: Glucose Oxidase

Ipeak: Cường độ dòng thu nhận trên đơn vị diện tích

NAD: Nicotine Adenine Dinucleotide

PB: Prussian Blue

PBS: Phosphate Buffer Saline

Pt: Platin

RE: Reference Electrode

SAMs: Seft-assembled Monolayer

SEM: Scanning Electron Microscope

SPN: Spinner

SP: Spray

V: Volt

WE: Working Electrode

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Bảng bố trí thí nghiệm tạo màng 37

Bảng 4.1 Cường độ peak tổng hợp của sợi nano Pt 57

Bảng 4.2 Cường độ peak tổng hợp của sợi nano Pt cố định 59

Bảng 4.3 Cường độ peak tổng hợp của cảm biến Glucose thế hệ 2 63

Bảng 4.4 Cường độ peak tổng hợp của cảm biến Glucose thế hệ 3 68

Bảng 4.5 Mối tương quan giữa cường độ dòng theo thời gian 71

Bảng 3.1 Bảng bố trí thí nghiệm tạo màng 37

Bảng 4.1 Cường độ peak tổng hợp của sợi nano Pt cố định bằng màng Gel kết hợp trong dung dịch glucose pH 7, nồng độ 016 mM, vận tốc quét 200 mV/s, điện thế khảo sát từ -1~1 V 57

Bảng 4.2 Cường độ peak tổng hợp của sợi nano Pt cố định bằng màng Chi trong dung dịch glucose pH 7, nồng độ 2 - 16 mM, vận tốc quét 200 mV/s, điện thế khảo sát từ -1~1 V 59

Bảng 4.3 Cường độ peak tổng hợp của cảm biến Glucose thế hệ 2 trong dung dịch glucose pH 7,0 nồng độ 30 μM -12 mM, vận tốc quét thế 200 mV/s, điện thế khảo sát từ +0,2 - 0,8 V 63

Bảng 4.4 Cường độ peak tổng hợp của cảm biến Glucose thế hệ 3 trong dung dịch

glucose pH 7, nồng độ 2-10 mM, vận tốc quét thế 200 mV/s, điện thế khảo sát từ 0V~ +1 V

68

Bảng 4.5 Mối tương quan giữa cường độ dòng theo thời gian ở cảm biến thế hệ 2 71

DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Cảm biến glucose thế hệ 1 và nguyên tắc hoạt động (Bao-Yan Wu, Shi-Hua Hou, Feng Yin, Jing Li, 2007) .5

Hình 2.2 Nguyên tắc hoạt động của cảm biến Glucose thế hệ 2 (Bao-Yan Wu, 6

Shi-Hua Hou, Feng Yin, Jing Li, 2007) .6

Hình 2.3 Nguyên tắc hoạt động của cảm biến Glucose thế hệ 3 (Cheng-Wei 6

Liao a, Jung-Chuan Chou 2007) 6

Hình 2.4 Sợi nano chế tạo bởi nhiều phương pháp khác nhau (A); Đơn sợi nano với kích

thước 40-50 nm (B); Sợi nano với hai điện cực nối ra mạch điều khiển bên ngoài (C) (Tống

Duy Hiển và ctv, 2007) .7

Hình 2.5 Ảnh SEM của sợi nano được chế tạo (A sợi nano 50 nm với độ phóng đại 500.000 lần; (B) sợi với các điện cực; (C) sợi nano platin với độ phóng đại siêu cao 720.000 lần (Tống Duy Hiển và ctv, 2007) .9

Hình 2.6 Cấu trúc không gian 3 chiều của phân tử GOx (Jianzhong Zhu, Ziqiang Zhu, 2002). 10

Hình 2.7 Một số hình ảnh về cấu trúc GOx (A) Hình thái của phân tử enzyme đồng đẳng (B) Cấu trúc nhân FAD của GOx (phần bắt màu đỏ) .11

Hình 2.8 Phản ứng oxi hóa β-D-glucose thành D-glucono-1,5-lactone và hydrogen peroxide (Linqiu Cao, 2002) 11

Hình 2.9 Cấu trúc hóa học của coenzyme FAD Riboflavin (vitamin B2) bao gồm đường alcohol D-ribitol gắn vào 7,8-dimethyl-isoalloxazine (Linqiu Cao, 2002) .12

Hình 2.10 Chu trình phản ứng khử của riboflavin thành ihydroriboflavin (Matsumoto và cs, 2002) 13

Hình 2.11 Chuỗi phản ứng quá trình oxi hóa trở lại của FADH2 Phản ứng xảy ra thông qua trung gian 4a-hydroperoxy FAD (Matsumoto và cs, 2002) .13

Hình 2.12 Vài phương pháp tạo màng từ dung dịch 14

(R.Garjonyte và A.Malinauskas, 2000) .14

Hình 2.13 Mô hình cơ bản tạo màng bằng phương pháp nhúng 15

(Wei-Jen Hoa, Chiun-Jye Yuan, Ohara Reiko, 2006) .15

Hình 2.14 Mô hình cơ bản tạo màng bằng phương pháp phủ quay (R.Garjonyte, A.Malinauskas 2000) 15

Hình 2.15 Hệ máy phun tại phòng thí nghiệm CN Nano 16

(hình chụp ngày 23/4/2009) .16

Hình 2.16 Mô hình thiết bị tăng cường Plasma cho màng 17

(R.Garjonyte, A.Malinauskas, 2000) 17

Hình 2.17 Nguyên lý chung của phương pháp tạo màng bằng PECVD 18

(S Frretti, S Paynter, D Russell, K Sapsford, D Richardson, 2000) 18

Hình 2.18 Đường cong thế khi tạo màng PB và cấu trúc của PB 19

(Jianzhong Zhu1, 2002) .19

Hình 2.19 Những phương pháp cố định cơ bản (Matsumoto và ctv, 2002) .20

Hình 2.20 Enzyme hấp phụ vào bề mặt đế 21

(Luciano Caselia, David S Santos Jr Mauricio Foschini, 2006) .21

Hình 2.21 Enzyme bị bẫy trong hệ sợi 21

(A.Nikolas, Chaniotakis, 2004) .21

Hình 2.22 Liên kết ngang giữa enzyme và chất gắn kết 22

(A.Nikolas, Chaniotakis 2004) .22

Hình 2.23 Liên kết cộng hóa trị giữa enzyme và đế 22

(A.Nikolas, Chaniotakis, 2004) .22

Hình 2.24 Minh họa sự kết gắn phối tử của vào màng SAMs 24

Hình 2.25 Đồ thị quét thế CV theo thời gian .25

Hình 2.26 Quan hệ dòng-điện thế trong quét thế vòng thuận 26

nghịch (R.Garjonyte, A.Malinauskas, 2000) .26

Hình 2.27 Đồ thị CV của quá trình oxi hóa (A) bất thuận nghịch, (B) giả 27

thuận nghịch, (C) thuận nghịch (Jianzhong Zhu1, Ziqiang Zhu, 2002) 27

Hình 2.28 Kính hiển vi điện tử quét SEM (hình chụp tháng 4/2009) 28

Hình 2.29 Sơ đồ nguyên lý hoạt động của máy SEM (S Frretti, S Paynter 29

D Russell, K Sapsford, D Richardson, 2000) 29

Hình 2.30 Hệ điện cực của máy Autolab (a) WE: điện cực làm việc 31

chip nano Platin (b) CE: điện cực đo lường sợi Pt (c) RE: điện cực đối Ag/AgCl (d) Cốc chứa dung dịch (hình chụp tháng 4/2009) .31

Hình 2.31 Hệ đo điện hóa Autolab (hình chụp tháng 4/2009) 31

Hình 3.1 Các thông số sợi nano Platin (A) Sợi nano Platin nhìn dưới kính hiển 33

vi điện tử phóng đại 200000 lần (B) Phóng đại 150000 lần,(C) Đặc trưng tính chất điện I-V của

sợi nano Pt-series 1-2-3 là số lần lặp lại,(Tống Duy Hiển, 2007) .33

Hình 3.2 Hình ảnh nghiệm thức trong thí nghiệm tạo màng (04/ 2009) .37

Hình 3.3 Máy phủ nhúng DIPCOATING (04/2009) .38

Hình 3.4 Máy phủ quay DELTA 6RC (04/2009) .39

Hình 3.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm quét thế vòng 39

Hình 3.6 Cảm biến sợi nano platin (A) Hình dạng chung cảm biến với 40

(a) vùng tiếp xúc đồng,(b) đường dẫn mạ vàng và phủ SiO 2 ,(c) Vùng chứa sợi nano Pt, (d) đế silic;(B) Phóng đại vùng chứa sợi 500 lần;(C) phóng đại vùng chứa sợi 1500 lần; (D) sợi nano Pt phóng đại 100.000 lần 40

Hình 3.7 Hình sơ đồ qui trình cố định enzyme .42

Hình 4.1 Màng Chi tạo bằng phương pháp phủ nhúng quan sát bằng kính hiển vi kim loại học độ phóng đại 1500 lần (A) Màng Chitosan (DC-C01), (B) Màng Chitosan kết hợp Gelatin (DC-C02) .48

Hình 4.2 Màng Chi tạo bằng phương pháp phủ quay quan sát bằng kính hiển vi kim loại học độ phóng đại 1500 lần (A) Màng Chitosan (SPN-C01), (B) Màng Chitosan kết hợp SiO 2 (SPN-C02) 48

Hình 4.3 Màng Chi tạo bằng phương pháp phủ phun quan sát bằng kính hiển vi kim loại học độ phóng đại 1500 lần (A) Màng Chitosan (SP-C01), (B) Màng Chitosan kết hợp SiO 2 (SP-C02) .49

Hình 4.4 Màng Chi nhìn bằng kính hiển vi điện tử (A) màng Chi (SP-C01-phóng đại 2000 lần), (B)Màng kết hợp Chi SiO 2 (SP-C02-phóng đại 1500 lần) .49

Hình 4.5 Màng Gel tạo bằng phương pháp phủ nhúng quan sát bằng kính hiển vi 50

kim loại học độ phóng đại 1500 lần (A) Màng Gelatine (DC-G01), (B) Màng kết hợp 50

Gelatine SiO 2 (DC-G02) 50

Hình 4.6 Màng Gel tạo bằng phương pháp phủ quay quan sát bằng kính hiển vi 51

kim loại học độ phóng đại 1500 lần (A) Màng Gelatine (SPN-G01),(B) Màng kết hợp Gelatine SiO 2 (SPN-G02) 51

Hình 4.7 Màng Gel tạo bằng phương pháp phủ phun quan sát bằng kính hiển vi 51

kim loại học độ phóng đại 1500 lần (A) Màng Gelatine (SP-G01),(B) Màng kết hợp Gelatine SiO 2 (SP-G02) 51

Hình 4.8 Màng Gelatine kết hợp SiO2 tạo bởi phương pháp phủ phun quan sát 51

bằng kính hiển vi điện tử (A) Ảnh chụp dưới độ phóng đại 1500 lần, (B, C) Ảnh chụp với độ phóng đại 5000 lần, lỗ màng có kích thước từ 6-10 m 51

Hình 4.9 Bề mặt màng nano Platin quan sát dưới kính hiển vi điện 52

tử độ phóng đại 50000 lần (Tống Duy Hiển và ctv, 2007) 52

Hình 4.10 Đồ thị phản ứng của sợi nano Pt với các nồng độ PBS (a) PBS 53

nồng độ 50 mM (b) PBS nồng độ 100 mM (c) PBS nồng độ 25 mM 53

Hình 4.11 Đồ thị ảnh hưởng của dung dịch Glucose không PBS (a) 40 mM 54

Glucose, (b) 20 mM, (c) 10 mM, (d) 5 mM, (e) 2,5 mM (f) 0 mM .54

Hình 4.12 Đồ thị ảnh hưởng của dung dịch glucose trong PBS lên cảm 54

biến sợi Nồng độ Glucose tương ứng a – b - c: 2 – 4 – 6 mM .54

Hình 4.13 Đồ thị phản ứng của sợi nano Pt trước sự thay đổi nồng độ H2 O 2 55

Hình 4.14 Đồ thị CV của cảm biến Glucose thế hệ 1 cố định bằng màng Gel 56

kết hợp trong dung dịch Glucose pH 7,0, nồng độ Glucose tương ứng a – b – c – d – e – f: 16 – 8 – 4 – 2 – 0 mM .56

Hình 4.15 Đường chuẩn cường độ theo nồng độ glucose của cảm 57

biến thế hệ 1 cố định bằng màng Gel kết hợp .57

Hình 4.16 Đường chuẩn cường độ theo nồng độ glucose 2-6 mM của 57

cảm biến thế hệ 1 cố định bằng màng Gel kết hợp .57

Hình 4.17 Đồ thị CV của cảm biến Glucose thế hệ 1 cố định bằng màng 59

Chi trong dung dịch Glucose pH 7,0, nồng độ Glucose tương ứng a – b – c – d – e: 0 – 2 – 4 – 8 - 16 mM 59

Hình 4.18 Đường chuẩn cường độ theo nồng độ glucose 2-6 mM của cảm biến thế hệ 1 cố định bằng màng Chi 59

điện tử (A) Đồ thị quá trình tạo màng PB bằng phương pháp điện hóa (B và E) bề mặt cảm

biến trước lúc tạo màng độ phóng đại 2000 lần, (C và D) bề mặt màng PB sau khi mạ điện hóa độ phóng đại 20000 lần .61

Hình 4.20 Quá trình gắn cố định enzyme trên cảm biến thế hệ 2 .62 Hình 4.21 Đồ thị quét thế của cảm biến thế hệ 2 trong dung dịch Glucose .63

Hình 4.26 Đồ thị khử Pt bằng acid H2 SO 4 loãng Peak khử xuất hiện ở -0,3 V .67

Hình 4.27 Đồ thị quét thế sợi nano Pt (A) Quét trong dung dịch tạo chất trung gian 67

(Prussian Blue) (B) Quét trong dung dịch H 2 SO 4 Với: (a) Điện cực Pt sạch, (b) điện cực Pt sau khi gắn gốc chức năng 67

Hình 4.28 Đồ thị quét thế của cảm biến thế hệ 3 trong dung dịch Glucose 68

Nồng độ Glucose lần lượt là 0 - 2 - 4 - 6 - 8 - 10 mM \ 68

Hình 4.29 Đường chuẩn cường độ dòng theo nồng độ glucose từ 69

2-10 mM của cảm biến thế hệ 3 69

Hình 4.30 Hình so sánh kết quả định lượng Glucose của cảm biến thế hệ 2 70

(A) Kết quả của nhóm Jianzhong Zhu1, Ziqiang Zhu 2002 (B) Kết quả của nhóm Garjonyte, Malinauskas 2000 (C) Kết quả của chúng tôi .70

Hình 4.31 Đồ thị kiểm tra độ ổn định cảm biến thế hệ 2 trong dung dịch 71

Glucose 3 mM ở ngày thứ 0 – 10 – 20 – 30 71

Hình 4.32 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa cường độ dòng theo thời 72

gian tồn trữ của cảm biến Glucose thế hệ 2 .72

Hình 4.33 Mối tương quan giữa cường độ dòng và pH dung dịch .73

73

Hình 4.34 Mối tương quan giữa nhiệt độ và cường độ dòng 73

Hình 4.35 Mối tương quan giữa cường độ và nồng độ PBS 74

Trên thế giới thị trường cảm biến glucose có tổng giá trị bán ra khoảng 6 tỉ/năm

và chiếm 90% thị trường của tất cả các loại cảm biến sinh học (Sensor Market Report, 2005) Do đó hiện nay nhiều công ty và viện nghiên cứu đang đầu tư, nghiên cứu nhằm phát triển thiết bị phân tích, chẩn đoán glucose thế hệ mới, với mong muốn: phân tích nhanh, nâng cao độ nhậy, độ tin tưởng, giảm giá thành chế tạo thiết bị

Hiện nay, ngành công nghệ nano sinh học đang phát triển rất nhanh chóng và tạo ra một cuộc cách mạng trong những ứng dụng y sinh học nhờ vào những khả năng giúp con người can thiệp tại kích thước nanomet (1nanomet bằng 1/triệu mm) trong chẩn đoán và điều trị bệnh

Việc ứng dụng công nghệ nano cho quá trình phát hiện, định lượng nhanh sự thay đổi nồng độ glucose trong máu bệnh nhân tiểu đường sẽ tạo ra một thế hệ cảm biến mới siêu nhanh, siêu nhạy, dễ bảo quản, có thể tái sử dụng và trên hết là giá thành

hạ phù hợp với điều kiện Việt Nam Trên cơ sở đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu cố định enzyme glucose oxidase trên cảm biến nano sinh học để kiểm tra và định lượng glucose” dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Đặng Mậu Chiến và PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng Qua đề tài này chúng tôi mong chúng tôi mong muốn được tiếp xúc với ngành công nghệ nano sinh học và từng bước ứng dụng trong công tác chăm sóc sức khỏe cộng đồng tại Việt Nam

1.2 Mục tiêu của đề tài

Cố định enzyme glucose oxidase vào sợi nano Platin theo nhiều phương pháp khác nhau

Xây dựng đường chuẩn theo nồng độ glucose dựa trên sợi nano Platin đã cố định

lượng hàm lượng glucose trong máu bệnh nhân tiểu đường

1.4 Nội dung thực hiện

Xây dựng qui trình cố định enzyme glucose oxidase trên bề mặt sợi nano-Platin theo từng thế hệ cảm biến

Thử nghiệm hoạt tính enzyme sau khi cố định, kiểm tra độ nhạy, ngưỡng phát hiện glucose, độ ổn định và độ lặp lại của cảm biến trên dung dịch glucose

Phân tích những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định enzyme glucose oxidase khi cố định trên bề mặt sợi

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Nguyên lý làm việc của cảm biến glucose dựa trên cấu trúc sợi nano Platin 2.1.1 Cảm biến sinh học (Biosensor)

2.1.1.1 Tổng quan về cảm biến sinh học

Theo IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry, 2000), cảm biến sinh học (biosensor) là một thiết bị tích hợp có khả năng cung cấp thông tin phân tích định lượng hoặc bán định lượng đặc trưng, bao gồm phần tử nhận biết sinh học (bioreceptor) kết hợp trực tiếp với một phần tử chuyển đổi Cảm biến sinh học là thiết

bị sử dụng các tác nhân sinh học như enzyme, các kháng thể để phát hiện, đo đạc hoặc phân tích hoá chất, các mẫu bệnh phẩm và chất độc Vì tính đặc hiệu cao của các thụ thể sinh học (DNA, kháng thể, enzyme) nên cảm biến sinh học nhạy hơn nhiều so với cảm biến hóa học trong các đánh giá sinh học

2.1.1.2 Cấu tạo chung của cảm biến sinh học

Cấu tạo chung của một cảm biến sinh học bao gồm bốn bộ phận chính (Xueji Zang và ctv, 2008)

Đầu thu sinh học (Biological Receptor): Đầu thu sinh học là những phần phản ứng

trực tiếp với các tác nhân cần phát hiện và có nguồn gốc từ các thành phần sinh học Đầu thu sinh học thường là các enzyme hoặc kháng thể oligonucleotid hay các chất có nguồn gốc sinh học thực hiện một số chức năng cụ thể trong cơ thể sống Nhiều cảm biến sinh học sử dụng sự kết hợp của các tác nhân sinh học để có thể phát hiện được nhiều chỉ tiêu cùng lúc Thông qua các phương pháp điện hoá có thể phát hiện một số chất như kháng nguyên hay cơ chất của enzyme, các sản phẩm chuyển hóa trong cơ thể Dựa vào các tác nhân sinh học sử dụng người ta chia ra thành một số loại đầu thu như sau: đầu thu làm từ enzyme, đầu thu làm từ các kháng thể/kháng nguyên, đầu thu làm từ các axit nucleic, đầu thu kết hợp, đầu thu làm từ tế bào

Tác nhân cố định: Các tác nhân cố định là một phần rất quan trọng trong cảm biến

sinh học Các tác nhân này có nhiệm vụ gắn kết các đầu thu sinh học lên trên đế Nói một cách khác đây là bộ phận trung gian có tác dụng liên kết các thành phần sinh học

Bộ phận chuyển đổi: Đây là một trong những bộ phận thiết yếu trong cảm biến sinh

học Bộ phận chuyển đổi có nhiệm vụ biến đổi tín hiệu thu nhận được thành dạng tín

hiệu khác có thể phân tích được Có nhiều dạng chuyển đổi trong bộ phận này như

chuyển đổi điện hoá, chuyển đổi quang, chuyển đổi nhiệt, chuyển đổi bằng tinh thể áp

điện hoặc chuyển đổi bằng các hệ vi cơ

Chuyển đổi điện hoá: bao gồm chuyển đổi dựa trên điện thế (potentiometric),

dòng điện (amperometric) và độ dẫn (conductometric)

Chuyển đổi nhiệt: hoạt động dựa trên hiện tượng thay đổi entanpi khi hình

thành hoặc phá vỡ các liên kết hóa học trong các phản ứng của enzyme

Chuyển đổi bằng tinh thể áp điện (piezoelectric): chuyển đổi hoạt động dựa trên

nguyên lý: tinh thể sẽ thay đổi tần số dao động khi lực tác dụng lên nó thay đổi

Bộ phận xử lý, đọc tín hiệu ra: bộ phận này có tác dụng chuyển thành các tín hiệu

điện để máy tính và các thiết bị khác có thể xử lý

2.1.1.3 Một số ứng dụng của cảm biến sinh học trên thế giới

Phát hiện protein ở nồng độ 10 pM (Cui và ctv, 2001)

Phát hiện đột biến gen ở nồng độ femtor mole (Hahm và ctv, 2004)

Phát hiện nhanh, siêu nhạy chỉ thị ung thư (biocancer markers) và prostate specific antigen (PSA) ở nồng đọ siêu thấp 0,9 pg/ml (Zheng và ctv, 2005)

Độ nhậy này cao hơn 1000-10000 lần công nghệ truyền thống hiện nay (cho

phép phát hiện sớm ung thư)

Thời gian phát hiện nhanh (vài phút)

2.1.2 Các loại cảm biến Glucose

Hiện nay thiết bị để đo đạc, phân tích lượng glucose trong máu rất đa dạng,

phong phú, và dựa trên các nguyên lý làm việc rất khác nhau, từ phương pháp cổ điển

như DCCT (diabetes control and omplications), chỉ thị màu (colorimetric test strips),

đến các phương pháp phát triển rất gần đây như cảm biến sinh học điện hóa

(electrochemical biosensors) và cảm biến quang (optical sensors) (Niemeyer, 2001)

Mỗi loại thiết bị có những ưu nhược điểm khác nhau

Phương pháp chỉ thị màu: đơn giản, rẻ tiền nhưng giấy hiển thị bị ảnh hưởng

bởi nhiệt độ, độ pH của môi trường, do đó làm giảm độ chính xác của phép đo

Phương pháp quang học: không cần lấy máu trực tiếp, nhưng thiết bị phức tạp,

đắt tiền và độ mẫn cảm với môi trường trung gian (da người) cũng cao

Phương pháp sinh học điện hóa: sử dụng enzyme làm xúc tác cho phản ứng oxi hóa glucose, do đó độ nhạy và độ chính xác của phép đo phụ thuộc rất nhiều vào hoạt tính của enzyme Do đó hiện nay nhiều công ty và viện nghiên cứu đang đầu tư, nghiên cứu nhằm phát triển thiết bị phân tích, chẩn đoán glucose thế hệ mới, với mong muốn: phân tích nhanh, nâng cao độ nhạy, độ tin tưởng, giảm giá thành chế tạo thiết bị cũng như phân tích

Hiện nay theo bản phân loại của Xueji Zhang, Huangxian Ju và Joseph Wang,

2008, cảm biến sinh học có thể được chia thành 3 thế hệ dựa vào thời gian nghiên cứu

và đặc điểm của phương pháp cố định

2.1.2.1 Cảm biến glucose thế hệ 1 (First-generation glucose sensor)

Cảm biến dựa trên cơ sở điện cực oxi Oxi hóa β-D glucose thành gluconolactone và giải phóng H2O2 Cơ chế của phản ứng như sau:

β-D-glucose + GOx (FAD) → Glucono-δ-lactone + GOx(FADH2)

GOx(FADH2) + O2 → GOx(FAD) + H2O2

Glucono-δ-lactone + H2O2 → Gluconic acid

β-D-glucose + O2 + H2O → Gluconic acid + H2O2

Hình 2.1 Cảm biến glucose thế hệ 1 và nguyên tắc hoạt động

(Bao-Yan Wu, Shi-Hua Hou, Feng Yin, Jing Li, 2007)

Đây là loại cảm biến đầu tiên được nghiên cứu vào những năm 80 Đặc điểm của loại cảm biến này là rất dễ chế tạo, giá thành hạ Cảm biến glucose thế hệ 1 chủ yếu phát hiện và định lượng nồng độ glucose thông qua lượng H2O2 sinh ra Đối với

cảm biến glucose này lượng H2O2 này sẽ được sợi nano Platin phát hiện và chuyển tín hiệu đến bộ phận thu nhận Nhược điểm của loại này là do làm việc ở thế cao nên tín hiệu dễ bị nhiễu do những hợp chất có trong máu như axit uric, vitamin C, paracetamol (Xueji Zhang, 2008)

2.1.2.2 Cảm biến glucose thế hệ 2 (Second-generation glucose sensor)

Là thế hệ cảm biến dựa trên cơ sở sử dụng chất trung gian chuyển điện tử Trong đó chất trung gian oxi hóa (Oxidized Mediator) thay thế cho oxi còn chất trung gian khử (Reduced Mediator) thay thế cho H2O2 Cơ chế của phản ứng như sau:

Hình 2.2 Nguyên tắc hoạt động của cảm biến Glucose thế hệ 2 (Bao-Yan Wu,

Shi-Hua Hou, Feng Yin, Jing Li, 2007)

Loại cảm biến thế hệ 2 này mới được nghiên cứu trong những năm gần đây Ở loại cảm biến này lớp chất trung gian (mediator) đóng vai trò như là cầu nối chuyển điện tử trực tiếp từ tâm hoạt động của enzyme đến sợi Điều này khiến cho cảm biến thế hệ này nhạy hơn, linh hoạt hơn, nhỏ hơn và có thể tránh được sự oxi hóa của những chất oxi hóa có trong máu Tuy nhiên giá thành và sự rò rỉ chất trung gian trong

quá trình sử dụng có thể gây ra nhiễu trong lúc đo đạc (Garjonyte, 2000)

2.1.2.3 Cảm biến Glucose thế hệ 3 (Third-generation glucose sensor)

Trong thế hệ này enzyme được gắn trực tiếp tới bề mặt điện cực, và trực tiếp trao đổi điện tử với điện cực, do đó không cần sử dụng đến chất trung gian Phương pháp này làm cho sự truyền electron trở nên nhanh hơn và thuận tiện hơn do đó làm tăng mật độ dòng dẫn đến cảm biến nhạy hơn và nhỏ hơn nữa

Hình 2.3 Nguyên tắc hoạt động của cảm biến Glucose thế hệ 3 (Cheng-Wei

Liao a, Jung-Chuan Chou 2007)

2.1.3 Cảm biến glucose dựa trên cấu trúc sợi nano Platin

Công nghệ nano là ngành khoa học về nghiên cứu, chế tạo, điều khiển và ứng dụng các vật liệu và linh kiện có kích thước siêu nhỏ, trong khoảng từ 1-100 nm (1 mét = 109 nm) Kích thước và cấu trúc siêu nhỏ dẫn đến các thay đổi lớn về bản chất

và tính chất của vật liệu và linh kiện Những thay đổi và tính chất mới này khi được khai thác và sử dụng thích hợp sẽ mang lại những ứng dụng mới, với khả năng ưu việt

mà vật liệu và linh kiện truyền thống không có được Ví dụ màng nano đơn lỗ với kích thước lỗ từ 2-3 nm (single nanopore membrane), sẽ chỉ cho 1 phân tử ADN (có đường kính 2,3 nm) chạy qua trong một thời điểm, tính chất này tạo ra khả năng chế tạo hệ giải mã ADN mới, có tốc độ nhanh hơn thiết bị hiện tại vài nghìn lần với chi phí thấp ( http://www.mcb.harvard.edu/branton/)

Hình 2.4 Sợi nano chế tạo bởi nhiều phương pháp khác nhau (A); Đơn sợi nano với kích thước 40-50 nm (B); Sợi nano với hai điện cực nối ra mạch điều khiển bên ngoài (C) (Tống

Tính siêu nhạy của cảm biến: Chỉ cần một vài phân tử sinh học (từ dung dịch

hoặc không khí) bám lên bề mặt sợi cũng đủ làm thay đổi đáng kể điện trở của sợi

Tính siêu nhanh của cảm biến: Vì cảm biến hoạt động thông qua sự đo đạc trực

tiếp, liên tục của điện trở, cho phép các phân tích được phát hiện nhanh (trong khoảng vài giây đến phút)

Tính siêu chọn lọc của cảm biến: Vì các cặp mồi sinh học được thiết kế để sử

dụng có tính kết cặp siêu chọn lọc, cho phép cảm biến có độ chọn lọc rất cao với chất cần phát hiện Tính kết cặp siêu chọn lọc của các cặp mồi sinh học là một tính chất tuyệt vời của tự nhiên, cho phép phân biệt từng cá thể riêng biệt trong một quần thể cực phức tạp, phong phú

Tính đồng bộ và đa dạng của cảm biến: Một cảm biến sinh học có thể được chế

tạo bao gồm nhiều sợi nano (array of nanowire) mà mỗi sợi được gắn kết với một mồi sinh học đặc trưng Cảm biến như thế cho phép phát hiện đồng thời, cùng lúc nhiều loại phân tử sinh học khác nhau Điều này nâng cao khả năng làm việc cũng như tính chính xác của phép phân tích (Xia và ctv, 2003)

2.1.3.1 Sợi nano platin (platinum nanowire)

Sợi nano được định nghĩa là vật liệu ở dạng sợi với đường kính sợi trong khoảng 1-100 nm Để có một vật thể có kích thước ngang bằng sợi tóc người với đường kính trung bình là 100 μm phải bó ít nhất 1 triệu sợi nano lại với nhau Khi ở dạng siêu nhỏ sợi nano, phần lớn các lớp nguyên tử cấu tạo nên sợi sẽ nằm trên bề mặt, dẫn đến các tính chất của sợi, đặc biệt là điện trở của sợi, rất nhạy với các thay đổi của môi trường bên ngoài (Xia và ctv, 2001)

Sợi nano Pt có độ dày 25 nm, có chiều ngang 40-50 nm, chiều dài 5-20 micro mét và dòng điện làm việc trong khoảng Micro Ampe (μA) tương ứng với điện thế làm việc trong khoảng -1 đến 1 Volt thích hợp cho việc chế tạo cảm biến glucose Nếu sợi nano platin có kích thước quá nhỏ và quá mỏng sẽ có điện trở thay đổi nhiều do điện trở sợi trở lên quá nhạy cảm với các thay đổi trong quá trình chế tạo, dẫn đến tính không ổn định của cảm biến Ngược lại, khi sợi có kích thước lớn hơn, điện trở ổn định hơn, tuy thế lại hạn chế đến độ nhạy của cảm biến

Sợi nano Platin thẳng, có đường kính cỡ 50 -100 nm cấu tạo từ các hạt nano Platin có kích thước siêu nhỏ cỡ vài nm Ở dạng sợi nano, vật liệu có tỉ số cực lớn giữa

bề mặt so với thể tích, mang đến những tính chất mới mà vật liệu khối không có Và đặc biệt là điện trở của sợi rất nhạy với trạng thái và thay đổi trên bề mặt, làm sợi nano trở thành vật liệu lí tưởng để xây dựng cảm biến siêu nhạy thế hệ mới, đặc biệt là cảm

biến nano sinh học khi kết hợp với các phần tử sinh học để tăng độ chọn lọc và độ nhạy (Tống Duy Hiển và ctv, 2007)

Hình 2.5 Ảnh SEM của sợi nano được chế tạo (A sợi nano 50 nm với độ phóng đại 500.000 lần; (B) sợi với các điện cực; (C) sợi nano platin với độ phóng đại siêu cao 720.000 lần (Tống Duy Hiển và ctv, 2007)

2.1.3.2 Enzyme glucose oxidase (GOx)

Tổng quan về glucose oxidase: Glucose oxidase (GOx) là một enzyme nhân flavin

đặc trưng với flavin adenine dinucleotide (FAD) hoạt động như nhóm ngoại tham gia vào quá trình oxy hóa-khử Đặc tính sinh học của nó là xúc tác cho quá trình oxi hóa chuyển glucose thành gluconolacton Trong khi bản thân enzyme chuyển từ dạng GOx(FAD) đến dạng GOx(FADH2) Phân tử GOx là một cấu trúc glycoprotein chắc chắn với trọng lượng phân tử từ 152.000–186.000 Da, bao gồm hai mạch giống hệt nhau Mỗi mạch chứa một cofactor FAD hoạt động được gắn thông qua cầu nối không cộng hợp (Wohlfahrt và ctv, 1999)

Sự phân hủy hai mạch dưới những điều kiện biến tính dẫn đến sự mất hoạt tính của coenzyme FAD Chức năng GOx được phân chia thành một nửa chu trình phản

D

ứng khử và một nửa chu trình phản ứng oxi hóa Trong nửa chu trình phản ứng khử đầu cơ chất tạo ra FAD bằng cách chuyển đi nhóm hidro từ FADH2 và tạo ra sản phẩm oxi hóa Có nhiều lọai đường và dẫn xuất của đường D-glucose là cơ chất của GOx nhưng enzyme chỉ thể hiện hoạt tính mạnh nhất đối với β-D-Glucose (Pazur và Kleppe, 1964) Ở nửa chu trình phản ứng oxi hóa sau nhân flavin được phục hồi trở lại nhờ sự phân hủy H2O2

Hình 2.6 Cấu trúc không gian 3 chiều của phân tử GOx

(Jianzhong Zhu, Ziqiang Zhu, 2002)

Cấu trúc cơ bản của tiểu đơn vị glucose oxidase: Glucose oxidase của Asperilus

niger có chứa từ 10-16% carbonhydrate kiểu mannose, trong số đó phân nửa số

carbonhydrate là nối N hay O glycosidic vào protein (Takegawa và ctv, 1989) Hai phân tử GOx giống nhau đến 81% trình tự và có động học oxi hóa khử như nhau Những monomers nối với nhau qua vùng tiếp xúc dài và hẹp Có khoảng 120 điểm tiếp xúc giữa những dimer trung tâm xung quanh 11 vùng thông qua các cầu nối là liên kết ion hay liên kết hydro

Giữa các tiểu đơn vị có chứa một cầu nối disulphide trong khi enzyme hiển thị dưới dạng đối xứng hình elip với cấu trúc cấp 2 (28% dạng xoắn, 18% dạng tấm) Cấu trúc bậc 4 của enzyme được phân chia thành hai phần riêng biệt bởi sự khác nhau của

hệ thống tấm beta Một phần của FAD gắn vào vùng cấu trúc Phần còn lại là một hệ gồm 6 mạch polypeptide đan vào nhau dạng tấm beta được cố định bởi bốn chuỗi xoắn α-helices (Gouda và ctv, 2003)

Những tấm được sắp xếp gần bề mặt của 2 tiểu đơn vị Hệ thống vòng flavin nằm gần phía đáy của một khoang sâu trong khung enzyme Hệ thống flavin trong

trung tâm hoạt động hình thành giống như một cái túi áo có dạng hình phễu Khoảng cách ngắn nhất giữa flavin và bề mặt của monomer là 13 Å Hai nửa vòng isoalloxazine được phân tách bởi một khoảng cách là 40 Å với khoảng cách này ngăn chặn sự trao đổi điện giữa hai phần với nhau

Hình 2.7 Một số hình ảnh về cấu trúc GOx (A) Hình thái của phân tử

enzyme đồng đẳng (B) Cấu trúc nhân FAD của GOx (phần bắt màu đỏ)

Trong phân tử enzyme những aminoacid như Asp Tyr Ile Ile Ala Gly Gly Gly Leu Thr Gly Leu Thr Thr Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro Asn Ile Ser Val Leu Val Ile Glu Ser gắn vào nhân FAD còn những aminoacid Cys thì lại có liên quan đến việc gắn vào cơ chất glucose Một số khác như Met Gln Thr Leu Leu Val Ser Ser Leu Val Val Ser Leu Ala Ala Ala Leu Pro His Tyr Ile Arg có liên quan đến những trình tự nhận biết tín hiệu

Tính chất hóa sinh của Flavin Adenine Dinucleotide (FAD): Glucose oxidase

(β-D-glucose:oxygen 1-oxidoreductase, EC 1.1.3.4) xúc tác phản ứng oxi hóa β-D-glucose thành D-glucono-1,5-lactone và hydrogen peroxide sử dụng oxigen như là chất nhận

điện tử

Hình 2.8 Phản ứng oxi hóa β-D-glucose thành

D-glucono-1,5-lactone và hydrogen peroxide (Linqiu Cao, 2002)

Sản phẩm đầu tiên của quá trình oxi hóa là D-glucono-1,5-lactone là một chất

ức chế cạnh tranh yếu Nó sẽ bị phân hủy ngay lập tức thành gluconic acid Tỉ lệ cho

sự phân hủy này tùy thuộc giá trị pH Ví dụ ở pH 3,0 phản ứng xảy ra rất chậm trong khi đó ở pH 8,0 quá trình diễn ra trong khoảng thời gian là 10 phút FAD và riboflavin-5'-phosphate là những coenzymes oxi hóa linh hoạt nhất trong các loại coenzyme Flavin thông thường là chất có đặc tính oxi hóa cao hơn cả NAD+, điều đó cũng dễ hiểu bởi flavin giữ vai trò rất lớn trong chuỗi dẫn truyền điện tử ở ti thể các sinh vật trong tự nhiên Thêm nữa flavin có thể nhường một hoặc hai electron trong phản ứng oxi hóa-khử Cũng chính điều này cho phép chúng tham gia vào quá trình oxi hoá một cách trọn vẹn và tương tác với các ion kim loại Cuối cùng những phân tử flavin nhường electron (flavin khử) có thể được oxi hóa trở lại bởi các phân tử oxi Quá trình tự oxi hóa này cho phép các enzymes chuyển điện tử trực tiếp cho oxygen và cũng là cơ sở cho phản ứng hydroxyl

Hình 2.9 Cấu trúc hóa học của coenzyme FAD

Riboflavin (vitamin B2) bao gồm đường alcohol D-ribitol gắn vào 7,8-dimethyl-isoalloxazine (Linqiu Cao, 2002)

Coenzyme flavin thông thường gắn chặt vào khung protein Giữa quá trình khử

và quá trình oxi hóa có sự tham gia đồng thời của hai tiểu đơn vị tương đồng Tùy thuộc vào cấu trúc tự nhiên của loại enzyme có chứa nhân flavin mà quá trình oxi hóa khử nhân flavin sẽ khác nhau Thế oxi hóa khử flavin trong khoảng từ -0,49 đến 0,19

V do đó FAD có thể tham gia một cách rộng rãi vào hầu hết các phản ứng sinh hóa (Linqiu Cao, 2002)

Tính oxi hóa khử của Flavin Adenine Dinucleotide (FAD): Chức năng FAD là một

coenzyme và có khả năng trải qua quá trình biến- hồi tính trong phản ứng oxi hóa khử Trung tâm hoạt động oxi hóa khử của FAD coenzyme là hệ thống vòng isoalloxazine

Trong phản ứng khử màu vàng đặc trưng của coenzyme sẽ biến mất khi FAD nhường electron Nhưng khi được tiếp xúc với không khí màu vàng đó lại xuất hiện

Hình 2.10 Chu trình phản ứng khử của riboflavin thành ihydroriboflavin

(Matsumoto và cs, 2002)

Trong pha khử FADH2 có thể bị oxi hóa trở lại FAD bởi phân tử oxi Thực vậy, dihydroriboflavin tự do phản ứng với phân tử oxy ở vị trí 4a của vòng isoalloxazine Sản phẩm phụ bị phá vỡ bởi quá trình proton hóa của oxi nội phân tử cho ra H2O2 và nhân Flavin

Hình 2.11 Chuỗi phản ứng quá trình oxi hóa trở lại của FADH2 Phản ứng xảy ra thông qua trung gian 4a-hydroperoxy FAD (Matsumoto và cs, 2002)

2.2 Một số phương pháp dùng cho quá trình cố định enzyme và kiểm tra cảm biến sau cố định

2.2.1 Các phương pháp tạo màng dùng cho cảm biến glucose

Có nhiều phương pháp tạo màng như: nhúng, quay, phun, phủ lăn tròn, phủ hoá học… Mỗi phương pháp đều có ưu, nhược điểm riêng và màng tạo ra từ những phương pháp khác nhau thì cũng có những tính chất khác nhau

Hình 2.12 Vài phương pháp tạo màng từ dung dịch

(R.Garjonyte và A.Malinauskas, 2000)

2.2.1.1 Phương pháp phủ nhúng (dip coating)

Công nghệ phủ nhúng là phương pháp mà đế nền được nhúng hoàn toàn vào dung dịch phủ và sau đó được kéo lên với một vận tốc thích hợp trong điều kiện nhiệt

độ và áp suất cố định Độ dày màng phụ thuộc chủ yếu vào tốc dộ kéo màng, mật độphần tử rắn và độ nhớt trong dung dịch Độ dày màng có thể được tính bằng công thức của Landau-levich :

Phương pháp phủ nhúng được thực hiện theo những bước sau:

Bước 1: Đế nền được nhúng trong dung dịch và bắt đầu kéo màng

Bước 2: Dung dịch bám vào đế và được kéo lên với vận tốc thích hợp Lớp bên trong

di chuyển cùng với đế còn lớp bên ngoài có xu hướng trôi xuống bình dung dịch

Bước 3: Tách dung dịch dư và cho bay hơi

Độ dày màng phủ phụ thuộc chủ yếu vào độ nhớt của dung dịch và tốc độ kéo màng

Hình 2.13 Mô hình cơ bản tạo màng bằng phương pháp nhúng

(Wei-Jen Hoa, Chiun-Jye Yuan, Ohara Reiko, 2006)

2.2.1.2 Phương pháp phủ quay (spin coating)

Phủ quay là phương pháp tạo màng khá đơn giản và ít tốn kém Dung dịch được đưa lên đế nền đã gắn sẵn trên một trục quay ly tâm và tiến hành quay để tán mỏng màng và bay hơi dung dịch dư Màng tạo được khá đồng nhất và có độ dày tương đối lớn Trong khi quay, chất lỏng loang chảy nhanh do tác dụng của lực li tâm và khi kết thúc, màng đã được tán mỏng, tiếp tục cho bay hơi để màng kết chặt hơn Vì lực li tâm (có xu hướng kéo màng ra bên ngoài) cân bằng lực nhớt (kéo màng vào trong) nên màng tạo ra có độ đồng đều cao (Hà Thúc Huy, 2000)

Bước 1 Bước 2 Bước 3 + 4

Hình 2.14 Mô hình cơ bản tạo màng bằng phương pháp phủ quay

(R.Garjonyte, A.Malinauskas 2000)

Độ dày màng được tính bằng công thức :

2.2.1.3 Phương pháp phủ phun (spray coating)

Kĩ thuật phun được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sơn phủ Kĩ thuật phun phủ rất khả thi khi tạo một lớp màng mỏng lên các vật có hình dạng phức tạp Khi sử dụng thiết bị phun tự động thẳng (loại HGS-Venjakop) kết kợp với chế độ phun HVLP (dung tích cao và áp suất thấp) để phun phủ lên một tấm thuỷ tinh phẳng (0,5 m × 0,5 m) thì có thể tạo được lớp phủ có độ dày trong khoảng 100-220 nm với độ dày chính xác khoảng 5-10% Ưu điểm lớn nhất của phương pháp phun phủ là không bị lãng phí nguyên vật liệu như các phương pháp khác

Hình 2.15 Hệ máy phun tại phòng thí nghiệm CN Nano

(hình chụp ngày 23/4/2009)

2.2.1.4 Phương pháp polymer điện hóa (electropolymerization)

Tổng hợp màng bằng phương pháp điện hóa là một kĩ thuật khá mới và có nhiều ưu điểm hơn so với các phương pháp truyền thống khác Với phương pháp này, chúng ta có thể điều khiển được độ dày của màng lên đến từng micromet đồng thời màng tạo ra có độ tinh khiết và đồng đều rất cao

Phương pháp này chủ yếu dựa vào sự oxi hóa các đơn phân (monomer) trong dung dịch điện ly khi áp một phân thế không đổi ở cực âm Các đơn phân trong dung dịch điện ly có thế oxi hóa thấp sẽ trải qua quá trình oxi hóa hình thành các cation ở bề mặt điện cực và tương tác với các đơn phân khác trong dung dịch hình thành nên các các chuỗi oligo ngắn sau đó tiếp tục hình thành màng polymer

2.2.1.5 Phương pháp tạo màng có tăng cường plasma

Plasma là một trong những kĩ thuật hiện đại được sử dụng làm biến đổi tính chất bề mặt vật liệu như: kim loại, hợp kim, gốm sứ, màng mỏng, polymer Plasma tạo thành khi một chất khí hoặc một hỗn hợp khí được đặt trong điện trường thích hợp Môi trường Plasma chứa các phần tử bị kích thích bởi điện trường như các nguyên tử, phân tử, ion, điện tử, các gốc tự do và có thể phát ra ánh sáng với bước sóng ngắn nằm trong vùng tử ngoại Các phần tử kích thích này có thể tác động vào vật liệu (substrate) đặt trong môi trường Plasma và làm biến đổi bề mặt của nó, các tác động này có thể là các tác động vật lí hay tác động hoá học hoặc đồng thời cả vật lí và hoá học

Hình 2.16 Mô hình thiết bị tăng cường Plasma cho màng

(R.Garjonyte, A.Malinauskas, 2000)

Màng được đặt lên bệ đỡ trong thiết bị Plasma sao cho bề mặt hoạt động của màng tiếp xúc với môi trường Plasma Thiết bị được rút chân không tới áp suất nhỏ Sau đó khí Argon được dẫn vào với tốc độ dòng thích hợp cho tới khi đạt tới áp suất xác định Đóng mạch điện để tạo ra một điện trường giữa hai điện cực Plasma xuất hiện và bề mặt màng bị tác động bởi các phần tử kích thích trong môi trường Plasma

2.2.1.6 Phương pháp lắng đọng hơi hóa học có tăng cường Plasma (PECVD)

Lắng đọng hơi hóa học có tăng cường Plasma là quá trình gắn kết màng mỏng

từ thể hơi sang thể bền vững trên một bề mặt nhất định Nguyên lý chung của phương pháp PECVD là dòng hơi hóa chất đi vào trong buồng phản ứng và tương tác với nhau trong điều kiện Plasma sau đó lắng đọng trên bề mặt cần tạo màng

Hình 2.17 Nguyên lý chung của phương pháp tạo màng bằng PECVD

(S Frretti, S Paynter, D Russell, K Sapsford, D Richardson, 2000)

2.2.2 Chất trung gian (mediator) và kĩ thuật tổng hợp chất trung gian

Chất trung gian là một trong những thành phần cốt lõi của cảm biến sinh học thế hệ 2 Chất trung gian đóng vai trò như một lớp trung gian giữa enzyme và điện cực kim loại giúp chuyển tín hiệu thu nhận được từ enzyme vào điện cực đồng thời tham gia ổn định hóa enzyme chống lại các tác nhân oxi hóa trong môi trường

Sự thay đổi trạng thái từ oxi hóa sang khử và ngược lại giúp chất trung gian

có thể vận chuyển điện tử dễ dàng hơn trong một khoảng rộng về nhiệt độ, độ pH…Chất trung gian của cảm biến Glucose hiện nay có khá nhiều loại: một số là các polymer dẫn có vai trò như chất trung gian, một số khác là các hợp chất kim loại hữu

cơ có khả năng gắn kết với enzyme Glucose oxidase Một trong những loại chất trung gian được áp dụng nhiều vào cảm biến glucose là Prussian Blue (PB) (Chi, 1995) Prussian Blue, hay sắt (III) hexacyanoferrate là một trong những thành viên