khảo sát hoạt tính enzyme protease trích ly từ aspergillus oryzae trên môi trường rắn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Mã ngành: 08 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME PROTEASE TRÍCH LY TỪ ASPERGILLUS ORYZAE TRÊN MÔI TRƯỜNG RẮN Sinh viên thực Huỳnh Thị Phương Thảo MSSV: LT10039 Lớp: CNTP K36LT Giáo viên hướng dẫn TS Nguyễn Công Hà NĂM 2012 Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học Cần Thơ Luận văn đính kèm theo đây, với đề tựa “KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME PROTEASE TRÍCH LY TỪ ASPERGILLUS ORYZAE TRÊN MÔI TRƯỜNG RẮN”, “HUỲNH THỊ PHƯƠNG THẢO” thực báo cáo, hội đồng chấm luận văn thông qua Giáo viên hướng dẫn Giáo viên phản biện TS NGUYỄN CÔNG HÀ Giáo viên phản biện Cần Thơ, ngày … tháng … năm … Chủ tịch hội đồng Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng ii Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học Cần Thơ LỜI CẢM ƠN Qua ba học kì học tập trường Đại học Cần Thơ em quý thầy cô trường Đại học Cần Thơ, đặc biệt thầy cô môn Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng tạo điều kiện thuận lợi truyền thụ kiến thức quý báu, tạo sở khoa học vững cho em suốt thời gian học tập Sau hoàn thành chương trình học trường, em thầy Nguyễn Công Hà tận tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho em trình thực luận văn tốt nghiệp Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học trường Đại học Cần Thơ cung cấp nguồn nấm mốc cho em thực đề tài Đặc biệt cảm ơn thầy Nguyễn Văn Thành nhiệt tình giúp đỡ em Em xin chân thành cảm ơn! Cần Thơ, ngày 15 tháng năm 2012 Sinh viện thực HUỲNH THỊ PHƯƠNG THẢO Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng iii Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học Cần Thơ TÓM TẮT Protease enzyme sử dụng nhiều số ngành sản xuất chế biến thực phẩm, sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp…nhưng giá thành chế phẩm enzyme thương mại cao Vì đề tài thực với mục đích dùng nấm mốc để làm dồi nguồn enzyme giảm giá thành chế phẩm enzyme thương mại Quá trình nghiên cứu tiến hành xác định động học enzyme nhằm phục vụ cho nghiên cứu ứng dụng vào sản xuất thực phẩm Sau dựa vào nguồn enzyme ứng dụng vào việc thuỷ phân da cá tra để sản xuất collagen Kết nghiên cứu đề tài cho thấy tiến hành thu enzyme có hoạt tính cao thành phần môi trường thích hợp để tạo enzyme protease thuỷ phân môi trường acid 70% cám : 25% trấu : 5% gelatin pH môi trường Đồng thời có tương tác pH nhiệt độ xử lý lên hoạt tính hệ enzyme protease dịch chiết Enzyme thể hoạt tính tối ưu nhiệt độ 45oC pH = 5,5 Động học enzyme protease có Vmax = 1,2548µmol/phút Km = 0,3932% Khả thuỷ phân enzyme protease dịch acid protein ứng với thời gian thuỷ phân 50 phút với thể tích dung dịch enzyme 1ml, pH dung dịch 3,2 nhiệt độ thuỷ phân 45oC Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng iv Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .iii TÓM TẮT iv MỤC LỤC .v DANH SÁCH BẢNG vii DANH SÁCH HÌNH viii CHƯƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ .1 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CHƯƠNG LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 SƠ LƯỢC VỀ ENZYME PROTEASE 2.1.1 Giới thiệu .3 2.1.2 Phân loại enzyme protease vi sinh vật 2.1.3 Động học enzyme 2.2 GIỚI THIỆU VỀ CƠ CHẤT 2.2.1 Giới thiệu chất gelatine .8 2.2.2 Giới thiệu chất casein 2.2.3 Giới thiệu chất Bovine Serium Albumin (BSA) 10 2.3 NGUỒN TỔNG HỢP ENZYME PROTEASE TỪ VI SINH VẬT 11 2.3.1 Đặc điểm enzyme protease từ vi sinh vật .11 2.3.2 Nguồn thu enzyme protease từ vi sinh vật 11 2.4 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG XÚC TÁC CỦA ENZYME 13 2.4.1 Các nhóm phương pháp xác định khả xúc tác enzyme 13 2.4.2 Đơn vị hoạt độ enzyme 14 2.5 SẢN XUẤT ENZYME PROTEASE TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE .14 2.5.1 Sơ lược nấm mốc Aspergillus oryzae .14 2.5.2 Môi trường nuôi cấy 15 2.5.4 Phương pháp nuôi cấy bề mặt 16 2.5.5 Thu nhận chế phẩm enzyme protease thô .19 2.6 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME PROTEASE 20 2.6.1 Độ ẩm môi trường 20 2.6.2 Ảnh hưởng không khí 20 2.6.3 Ảnh hưởng nhiệt độ pH môi trường 20 2.6.4 Thời gian nuôi cấy .20 2.7 ỨNG DỤNG CỦA ENZYME PROTEASE .20 2.7.1 Ứng dụng chế biến thực phẩm 20 2.7.2 Ứng dụng ngành công nghiệp khác .21 CHƯƠNG PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM 22 3.1.1 Địa điểm thời gian thực 22 3.1.2 Vật liệu 22 3.1.3 Đối tượng nghiên cứu 22 3.1.4 Hoá chất thí nghiệm 22 3.1.5 Thiết bị thí nghiệm .23 Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng v Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học Cần Thơ 3.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 24 3.2.1 Phương pháp thí nghiệm 24 3.2.2 Bố trí thí nghiệm 245 3.2.2.1 Thí nghiệm 1: khảo sát ảnh hưởng thành phần môi trường pH môi trường đến khả sinh tổng hợp enzyme protease 25 3.2.2.2 Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng pH, nhiệt độ lên hoạt tính enzyme protease 26 3.2.2.3 Thí nghiệm 3: khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất lên hoạt tính enzyme protease 27 3.2.2.4 Thí nghiệm 4: khảo sát khả thuỷ phân enzyme protease dung dịch acid protein 28 CHƯƠNG KẾT QUẢ THẢO LUẬN 29 4.1 Kết khảo sát ảnh hưởng thành phần môi trường pH môi trường khác 29 4.2 Kết khảo sát ảnh hưởng pH nhiệt độ lên hoạt tính enzyme protease .32 4.3 Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất lên hoạt tính enzyme protease .35 4.4 Kết khảo sát khả thuỷ phân enzyme protease dung dịch acid protein thời gian khác 36 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .39 5.1 KẾT LUẬN .39 5.2 KIẾN NGHỊ 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC 1: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ix PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ THỐNG KÊ xiv Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng vi Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Thành phần acid amin có gelatine .8 Bảng 2: Thành phần acid amin casein Bảng 3: Thành phần acid amin phân tử BSA 10 Bảng 4: Thành phần dinh dưỡng cám 16 Bảng 5: Sự thay đổi hoạt tính enzyme (TU/ml) theo thành phần môi trường pH môi trường 30 Bảng 6: Sự thay đổi hoạt tính riêng (TU/mg) enzyme theo thành phần môi trường pH môi trường .30 Bảng 7: Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease theo pH với nhiệt độ 32 Bảng 8: Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease theo nồng độ casein .35 Bảng 9: Hàm lượng protein lại sau trình thuỷ phân 37 Bảng 10: Hàm lượng tyrosine sau trình thuỷ phân 38 Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng vii Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Mô hình enzyme protease thủy phân phân tử protein Hình 2: Cấu trúc không gian enzyme protease .4 Hình 3: Đồ thị biểu diễn phương trình Michaelis – Menten .7 Hình 4: Đồ thị biểu diễn phương trình Line Weaver Hình 5: Bacillus 12 Hình 6: Nấm mốc 12 Hình 7: Xạ khuẩn 13 Hình 8: Nấm mốc Aspergillus oryzae sau ủ ngày 15 Hình 9: Nấm mốc Aspergillus oryzae qua kính hiển vi 15 Hình 10: Quy trình nuôi cấy vi sinh vật phương pháp bề mặt 17 Hình 11: Máy khuấy từ 23 Hình 12: Cân điện tử 23 Hình 13: Tủ ủ 23 Hình 14: Máy đo quang phổ 23 Hình 15: Tủ cấy vi sinh vật 24 Hình 16: Thiết bị ủ nhiệt 24 Hình 17: Máy vortex 24 Hình 18: Kính hiển vi điện tử 24 Hình 19: Quy trình thí nghiệm sản xuất enzyme protease 26 Hình 20: Môi trường sau ủ 42 29 Hình 21: Dịch lọc thô enzyme protease 29 Hình 22: Biến đổi hoạt tính enzyme theo pH thành phần môi trường 30 Hình 23: Biến đổi hoạt tính riêng enzyme theo pH thành phần môi trường.31 Hình 24: Ảnh hưởng pH lên hoạt tính protease theo nhiệt độ 32 Hình 25: Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính protease thep pH 33 Hình 26: Sự ảnh hưởng tương tác pH nhiệt độ xử lý lên hoạt tính enzyme protease 34 Hình 27: Ảnh hưởng nồng độ casein lên hoạt tính enzyme protease theo phương trình Michaelis – Menten .36 Hình 28: Biến đổi hàm lượng protein theo thời gian thuỷ phân 37 Hình 29: Thay đổi hàm lượng tyrosine thời gian thuỷ phân khác 38 Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng viii Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, với phát triển mạnh mẽ Công nghệ Sinh học, chế phẩm enzyme sản xuất ngày nhiều sử dụng hầu hết lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Đặc biệt ngành thực phẩm, ứng dụng kỹ thuật sinh học tạo nên tiến đáng kinh ngạc việc sản xuất sản phẩm gia tăng hiệu suất sản phẩm truyền thống Hàng năm lượng enzyme sản xuất giới đạt 300.000 với giá trị 500 triệu USD phân phối lĩnh vực khác Công nghệ sản xuất enzyme đem lại lợi nhuận to lớn cho Việt Nam Ứng dụng enzyme để hỗ trợ cho trình sản xuất chế biến thực phẩm trở nên phổ biến quen thuộc Bản chất enzyme chất protein Chúng tạo tế bào sống (thực vật, động vật vi sinh vật) chất xúc tác cho phản ứng sinh học Chức enzyme hoạt động sống xúc tác hình thành cắt đứt liên kết hóa học Do có ưu nhiều mặt nên vi sinh vật trở thành nguồn thu enzyme chủ đạo Tùy theo mục đích sử dụng mà người ta sản xuất nhiều dạng chế phẩm enzyme khác enzyme thô, enzyme bán tinh khiết enzyme tinh khiết Sản xuất enzyme từ vi sinh vật so với từ thực vật động vật có nhiều ưu điểm như: - Tốc độ sản sinh vi sinh vật mạnh - Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính cao - Vi sinh vật thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp - Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme rẻ tiền dễ kiếm - Vi sinh vật sinh tổng hợp lúc nhiều loại enzyme khác Protease enzyme sử dụng nhiều số ngành sản xuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm phomat, làm mềm thịt…), sản xuất chất tẩy rửa, công nghiệp thuộc da, y tế, nông nghiệp… Việc gia tăng sử dụng vi sinh vật nguồn cung cấp protease cải thiện đáng kể hiệu sản xuất sản phẩm tạo nhiều Tuy nhiên giá thành chế phẩm enzyme cao, hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzyme công nghiệp đời sống Với thuận lợi cần thiết enzyme, đề tài thực khảo sát Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học Cần Thơ số yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp enzyme protease từ Aspergillus oryzae môi trường rắn Bởi ứng dụng ngày rộng rãi protease việc sản xuất enzyme góp phần đưa công nghệ enzyme ngày phát triển, góp phần hạ giá thành chế phẩm enzyme tạo điều kiện mở rộng sản xuất enzyme thực tế, cải thiện quy trình sản xuất, cải thiện điều kiện lao động nâng cao chất lượng sản phẩm 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Đề tài nghiên cứu nhằm khảo sát hoạt tính enzyme protease trích ly từ Aspergillus oryzae môi trường rắn với mục tiêu sau: - Ảnh hưởng thành phần môi trường pH môi trường khác đến trình sinh tổng hợp enzyme protease - Ảnh hưởng nhiệt độ pH lên hoạt tính xúc tác phản ứng thuỷ phân enzyme protease - Ảnh hưởng nồng độ chất lên hoạt tính xúc tác phản ứng thuỷ phân enzyme protease - Khảo sát khả thuỷ phân enzyme protease dung dịch acid protein Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 10: Hàm lượng tyrosine sau trình thuỷ phân Thời gian thuỷ phân (phút) 10 20 30 40 50 60 Tyrosine (µmol/phút) 0,698d 0,784c 0,912b 0,966b 1,049a 1,053a Kết thể hàm lượng protein theo đơn vị (mg/ml) Các chữ khác cột biểu thị khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê độ tin cậy 95% Tyrosine (µmol/phút) 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Hình 29: Thay đổi hàm lượng tyrosine thời gian thuỷ phân khác Lượng tyrosine sinh trình thuỷ phân nghiệm thức khác biệt có ý nghĩa độ tin cậy 95% Nghiệm thức F5 F6 khác biệt so với nghiệm thức F1, F2, F3, F4 độ tin cậy 95% có hàm lượng tyrosine sinh cao trình thuỷ phân Nhưng nghiệm thức F3 F4 khác biệt ý nghĩa Nghiệm thức F1 có hàm lượng tyrosine thấp Từ bảng 10 hình 29 cho thấy thời gian thuỷ phân dài hàm lượng tyrosine sinh nhiều, lượng tyrosine sinh tỷ lệ thuận với thời gian thuỷ phân Khi tăng thời gian thuỷ phân từ 10 ÷ 40 phút lượng tyrosine tăng lên cách nhanh chóng, thời gian thuỷ phân từ 40 ÷ 60 phút lượng tyrosine tăng tăng chậm thời gian đầu trình thuỷ phân Do trình xử lý nhiệt môi trường ẩm, sợi collagen bị co ngắn lại Có thể thấy thí nghiệm hàm lượng tyrosine sinh cao thời gian thuỷ phân 60 phút (1,049µmol/phút) Như vậy, để tiết kiệm chi phí cho trình thuỷ phân ta chọn thời gian thuỷ phân thích hợp 50 phút Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng 38 Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Chế phẩm enzyme protease thu sau nuôi cấy chế phẩm dạng thô Trong trình nuôi cấy Aspergillus oryzae để thu chế phẩm protease, điều kiện nuôi cấy không thích hợp cho phát triển nấm mốc làm giảm khả tổng hợp hoạt tính enzyme protease hay kéo dài thời gian nuôi cấy làm giảm suất sản xuất Qua thời gian khảo sát, kết cho thấy để nuôi cấy Aspergillus oryzae sản xuất enzyme protease đạt hoạt tính tổng cao điều kiện môi trường bao gồm: - Thành phần môi trường gồm 70% cám : 25% trấu : 5% gelatin bổ sung làm chất cảm ứng, sau trùng tiến hành cấy giống Aspergillus oryzae vào nuôi thời gian 42 giờ, điều kiện độ ẩm 55%, pH = 5, nhiệt độ nuôi cấy 30oC - Có tương tác qua lại pH nhiệt độ môi trường xử lý lên hoạt tính hệ enzyme protease dịch chiết Hệ enzyme protease thể hoạt tính cao khoảng pH dung dịch đệm ÷ 5,5 với nhiệt độ 45 oC - Hệ enzyme protease khảo sát với chất casein điều kiện tối thích (nhiệt độ 45 oC pH = 5,5) enzyme cho hoạt tính cao nồng độ casein 0,8%, Vmax = 1,2548µmol/phút Km = 0,3932% - Enzyme protease thể khả thuỷ phân dung dịch acid protein tốt thời gian 50 phút với 1ml dung dịch enzyme nhiệt độ thuỷ phân 45oC 5.2 KIẾN NGHỊ Do thời gian nghiên cứu ngắn nên chế phẩm enzyme thu chế phẩm thô, chưa có điều kiện ứng dụng vào thực tế Những nghiên cứu đề nghị sau: - Khảo sát mật số nấm mốc thời gian nuôi cấy ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp enzyme protease - Nghiên cứu sinh tổng hợp enzyme nguồn vật liệu khác như: cám ngô, cám mì, bã củ cải, bột đậu nành… - Nghiên cứu sản xuất enzyme protease từ vi khuẩn nấm mốc khác - Khảo sát khả thuỷ phân ezyme nồng độ enzyme khác Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng 39 Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học Cần Thơ TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi Thị Quỳnh Hoa 2010 Bài giảng Vi sinh Thực phẩm, khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ Lê Ngọc Tú cộng 1998 Hóa sinh học công nghiệp Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Lê Ngọc Tú cộng 2003 Hoá học Thực phẩm Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Lương Đức Phẩm 2004 Công nghệ vi sinh vật Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Công Hà 2010 Giáo trình kỹ thuật thực phẩm III, Khoa Nông Nghiệp Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ Nguyễn Đức Lượng 2002 Công nghệ vi sinh tập Vi sinh vật học công nghiệp Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Lượng 2004 Công nghệ enzyme Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Văn Mùi 2001 Thực hành hoá sinh học Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Tiếng Anh Bradford, M.M., 1976 A rapid and sensitive mocrogram quantities of protein utilizing the priciple of protein dye biding Anal Biochem 72, 248 - 254 Brown, J R (1975), Structure of Bovine Serum Albumin Fed Proc 34; 591 – 591 Jarun Chutmanop, Sinsupha Chuichulcherm, Yusuf Chisti and Penjit Srinophakun 2008 Protease production by Aspergillus oryzae in solid-state fermentation using agroindustrial substrates Journal of Chemical Technology and Biotechnology 83:1012-1018 Kunitz M., 1947 Determination of proteolytic activity by the casein digestion method J Gen Physiol 30, 291 Prabjeet Singh, Soottawat Benjakul, Sajid Maqsood and Hideki Kishimura 2011 Isolation and characterisation of collagen extracted from the skin of striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus) Food Chemical 124 Một số địa website http://baigiang.violet.vn/present/same/entry_id/3232177 http://www.casein.com/products.htm Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng 40 Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC 1: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 1.1 XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME BẰNG PHƯƠNG PHÁP KUNITZ (Nguồn: Kunitz (1947), citied by Fernander et al, 2003) 1.1.1 Nguyên tắc Phương pháp đo hoạt tính dựa vào phản ứng thủy phân chất protein (casein) enzyme có dung dịch Phản ứng thủy phân kết thúc thời điểm định trichloroacetic acid (TCA) Sản phẩm tạo thành xác định dựa vào độ hấp thụ ánh sáng sản phẩm acid amin sinh (chủ yếu tyrosine) đo bước sóng 280nm Đơn vị hoạt tính enzyme protease thể qua đơn vị tyrosine (TU: tyrosine unit) 1TU lượng sản phẩm sinh tương đương với số µmol tyrosine thuỷ phân casein enzyme có 1ml dung dịch thời gian phút điều kiện nhiệt độ pH môi trường định Hoạt tính riêng enzyme: số đơn vị hoạt tính có 1mg protein (TU/mg) 1.1.2 Tiến hành thí nghiệm 1.1.2.1 Chuẩn bị hóa chất Dung dịch đệm Mcllvain: cân 35,85g Na2HPO4.12H2O hòa tan 500ml nước cất; cân 5,525g acid citric hòa tan 250ml nước cất Trộn 88,25ml acid với 411,75ml muối điều chỉnh pH = Chất hoạt hóa cysteine 0,02M: cân 0,242g cysteine hòa tan với 100ml HCl 0,2N Dung dịch trichloroacetic acid (TCA) 15%: cân 15g TCA hòa tan với nước cất, sau dùng nước cất định mức đến 100ml Casein 1%: hòa tan 1g casein với 100ml dung dịch đệm Mcllvain, pH = Dung dịch đun cách thủy nhiệt độ 95oC khoảng hòa tan hoàn toàn Sau bảo quản 4oC trước sử dụng phải ủ ấm dung dịch 37oC khoảng 30 phút 1.1.2.2 Các bước tiến hành Tiến hành hai mẫu thí nghiệm song song, có mẫu đối chứng Các bước thực theo sơ đồ sau: Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng ix Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học Cần Thơ Mẫu đối chứng Mẫu thật 200µl cysteine 0,02M 700µl đệm Mcllvain pH = 100µl enzyme 200µl cysteine 0,02M 700µl đệm Mcllvain pH = 100µl enzyme Ủ 37 oC, 20 phút Ủ 37 oC, 20 phút Bổ sung 3000µl casein 1% Bổ sung 3000µl TCA 15% Lắc ủ 10 phút, 37 oC Lắc ủ 10 phút, 37 oC Bổ sung 3000µl casein 1% Bổ sung 3000µl TCA 15% Ổn định oC, 10 phút Ổn định oC, 10 phút Lọc Lọc Đo độ hấp thụ 280nm 1.1.2.3 Tính toán kết Đo độ hấp thụ 280nm Đơn vị hoạt tính enzyme 1ml dung dịch enzyme tính theo công thức sau: TU  X  Vhh k T  VE 103 Trong đó: TU: hoạt tính enzyme (TU/ml) X: nồng độ tyrosine (µmol/ml) Vhh: thể tích tổng dung dịch phản ứng (4ml) T: thời gian phản ứng (10 phút) VE: thể tích enzyme (100µl) k: hệ số pha loãng Nồng độ tyrosine (X) công thức xác định dựa vào đường chuẩn Tyrosine - Xây dựng đường chuẩn Tyrosine Tyrosine pha dung dịch HCl 0,2N Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng x Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học Cần Thơ Chuẩn bị dãy ống nghiệm chứa dung dịch tyrosine chuẩn với nồng độ tăng dần tử 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2µmol/ml Thí nghiệm lặp lại lần Lắc ống nghiệm máy Vortex Sau tiến hành đo OD ống nghiệm bước sóng 280nm Tyrosine (µmol/ml) OD (280nm) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 0,128 0,225 0,363 0,467 0,692 0,920 1,124 1,328 Từ kết đo OD, ta thiết lập mối quan hệ độ hấp thụ nồng độ Tyrosine dung dịch Mật độ quang A 1.6 1.4 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 y = 1.129x R = 0.9987 0.2 0.4 0.6 0.8 Nồng độ Tyrosine (mmol/l) 1.2 1.4 Hình 1: đường chuẩn Tyrosine 1.2 PHÂN TÍCH PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD 1.2.1 Nguyên tắc Hàm lượng protein xác định dựa phản ứng tạo màu protein có dung dịch với thuốc thử Coomassie Brilliant Blue Cường độ màu hỗn hợp phản ứng bước sóng 595nm tỷ lệ thuận với hàm lượng protein phạm vi định Biết mật độ quang dung dịch protein nghiên cứu với thuốc thử Coomassie Brilliant Blue, dựa vào đường chuẩn protein tinh khiết Bovine Serum Albumin (BSA) với thuốc thử tính lượng protein mẫu nghiên cứu 1.2.2 Tiến hành thí nghiệm 1.2.2.1 Chuẩn bị hoá chất Chuẩn bị thuốc thử cách hoà tan 100mg Coomassie Brilliant Blue G – Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng xi Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học Cần Thơ 250 vào 50ml ethanol (96%, v/v) Sau thêm vào 100ml H3PO4 (85%, w/v) dẫn nước cất đến 1lít 1.2.2.2 Các bước tiến hành thí nghiệm Bật máy Spectrophotometer cho khởi động 10 phút Dùng micropippet lấy xác 20µl mẫu cho vào cuvette nhựa loại 1ml Thêm vào 1ml thuốc nhuộm màu, trộn ủ nhiệt độ phòng thời gian 15 phút Đo độ hấp thụ bước sóng 595nm Đối chiếu với đường chuẩn ta xác định hàm lượng protein có mẫu - Xây dựng đường chuẩn protein Chuẩn bị dãy ống nghiệm chứa dung dịch BSA chuẩn với nồng độ tăng dần từ 0,03; 0,12; 0,18; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 1mg/ml Tiến hành xác định hàm lượng protein dung dịch nói phương pháp Bradford Thí nghiệm lặp lại lần Ghi nhận giá trị OD dung dịch nói bước sóng 595nm BSA OD 0,03 0,030 0,12 0,101 0,18 0,123 0,3 0,180 0,4 0,279 0,5 0,374 0,6 0,454 0,7 0,528 0,8 0,588 0,9 0,631 0,700 Từ kết đo OD, ta thiết lập mối quan hệ độ hấp thụ nồng độ BSA dung dịch Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng xii Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học Cần Thơ Độ truyền quang A 0.8 0.7 y = 0.7194x R2 = 0.9931 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 Nồng độ BSA (mg/ml) Hình 2: đường chuẩn protein Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng xiii Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ THỐNG KÊ Thí nghiệm 1.1 Hoạt tính protease (TU/ml) Analysis Summary Dependent variable: Hoat tinh protease Factors: Thanh phan MT pH Selection variable: Thanh phan MT Number of complete cases: 72 Analysis of Variance for HT Protease - Type III Sums of Squares -Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -MAIN EFFECTS A:TP moi truong 1.01135 0.505674 109.15 0.0000 B:pH 1.28398 0.427995 92.38 0.0000 INTERACTIONS AB 0.691756 0.115293 24.89 0.0000 RESIDUAL 0.277968 60 0.0046328 -TOTAL (CORRECTED) 3.26506 71 -Multiple Range Tests for HT Protease by TP moi truong -Method: 95.0 percent LSD TP moi truong Count LS Mean Homogeneous Groups -2 24 0.6255 X 24 0.7515 X 24 0.915 X -Contrast Difference +/- Limits -1 - *0.126 0.0393031 - *-0.1635 0.0393031 - *-0.2895 0.0393031 -Multiple Range Tests for HT Protease by pH -Method: 95.0 percent LSD pH Count LS Mean Homogeneous Groups -3 18 0.642667 X 18 0.647333 X 18 0.797333 X 18 0.968667 X -Contrast Difference +/- Limits -3 - *-0.154667 0.0453833 - *-0.326 0.0453833 - -0.00466667 0.0453833 - *-0.171333 0.0453833 - *0.15 0.0453833 - *0.321333 0.0453833 Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng xiv Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học Cần Thơ 1.2 Hoạt tính riêng (TU/mg) Analysis Summary Dependent variable: Hoat tinh rieng Factors: Thanh phan MT pH Selection variable: Thanh phan MT Number of complete cases: 72 Analysis of Variance for HT Rieng - Type III Sums of Squares -Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -MAIN EFFECTS A:TP moi truong 0.856902 0.428451 49.97 0.0000 B:pH 0.607474 0.202491 23.62 0.0000 INTERACTIONS AB 0.285756 0.0476259 5.56 0.0001 RESIDUAL 0.514411 60 0.00857352 -TOTAL (CORRECTED) 2.26454 71 -Multiple Range Tests for HT Rieng by TP moi truong -Method: 95.0 percent LSD TP moi truong Count LS Mean Homogeneous Groups -2 24 0.930167 X 24 1.12362 X 24 1.18654 X -Contrast Difference +/- Limits -1 - *0.193458 0.0534668 - *-0.0629167 0.0534668 - *-0.256375 0.0534668 -Multiple Range Tests for HT Rieng by pH -Method: 95.0 percent LSD pH Count LS Mean Homogeneous Groups -6 18 0.988556 X 18 1.02756 XX 18 1.074 X 18 1.23033 X -Contrast Difference +/- Limits -3 - -0.0464444 0.0617382 - *-0.202778 0.0617382 - 0.039 0.0617382 - *-0.156333 0.0617382 - *0.0854444 0.0617382 - *0.241778 0.0617382 Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng xv Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học Cần Thơ Thí nghiệm 2: Hoạt tính protease (TU/ml) Analysis Summary Dependent variable: Hoat tinh protease Factors: Nhiet pH Selection variable: Nhiet Number of complete cases: 180 Analysis of Variance for HT Protease - Type III Sums of Squares -Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -MAIN EFFECTS A:pH 0.171098 0.0342197 4.67 0.0005 B:Nhiet 38.9898 9.74745 1329.32 0.0000 INTERACTIONS AB 5.60731 20 0.280365 38.24 0.0000 RESIDUAL 1.0999 150 0.00733264 -TOTAL (CORRECTED) 45.8681 179 -Multiple Range Tests for HT Protease by Nhiet -Method: 95.0 percent LSD Nhiet Count LS Mean Homogeneous Groups -55 36 0.245667 X 35 36 0.511667 X 50 36 0.899 X 40 36 1.18433 X 45 36 1.55233 X -Contrast Difference +/- Limits -35 - 40 *-0.672667 0.0398805 35 - 45 *-1.04067 0.0398805 35 - 50 *-0.387333 0.0398805 35 - 55 *0.266 0.0398805 40 - 45 *-0.368 0.0398805 40 - 50 *0.285333 0.0398805 40 - 55 *0.938667 0.0398805 45 - 50 *0.653333 0.0398805 45 - 55 *1.30667 0.0398805 50 - 55 *0.653333 0.0398805 -Multiple Range Tests for HT Protease by pH -Method: 95.0 percent LSD pH Count LS Mean Homogeneous Groups -4 30 0.8384 X 6.5 30 0.8512 XX 4.5 30 0.874 XX 30 0.8828 X 30 0.8904 X 5.5 30 0.9348 X -Contrast Difference +/- Limits -4 - 4.5 -0.0356 0.0436869 - *-0.0444 0.0436869 - 5.5 *-0.0964 0.0436869 Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng xvi Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học Cần Thơ - *-0.052 0.0436869 - 6.5 -0.0128 0.0436869 4.5 - -0.0088 0.0436869 4.5 - 5.5 *-0.0608 0.0436869 4.5 - -0.0164 0.0436869 4.5 - 6.5 0.0228 0.0436869 - 5.5 *-0.052 0.0436869 - -0.0076 0.0436869 - 6.5 0.0316 0.0436869 5.5 - *0.0444 0.0436869 5.5 - 6.5 *0.0836 0.0436869 - 6.5 0.0392 0.0436869 -Multiple Regression Analysis Dependent variable: HT Protease Standard T Parameter Estimate Error Statistic P-Value CONSTANT -26.3804 0.880529 -29.9598 0.0000 Nhiet 1.06361 0.0271359 39.1957 0.0000 pH 1.60997 0.215361 7.4757 0.0000 Nhiet do*Nhiet -0.0104952 0.000279026 -37.6139 0.0000 pH*pH -0.0419143 0.0187176 -2.2393 0.0264 Nhiet do*pH -0.0257874 0.00193315 -13.3396 0.0000 Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Model 41.6009 8.32017 339.26 0.0000 Residual 4.26725 174 0.0245244 Total (Corr.) 45.8681 179 R-squared = 90.6967 percent R-squared (adjusted for d.f.) = 90.4294 percent Standard Error of Est = 0.156603 Mean absolute error = 0.117593 Durbin-Watson statistic = 0.70065 Thí nghiệm 3.1 Hoạt tính protease (TU/ml) Analysis Summary Dependent variable: Hoat tinh protease Factor: Nong casein Selection variable: Nong casein Number of observations: 54 Number of levels: ANOVA Table for Hoat tinh protease by Nong casein Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1.73729 0.217161 4.14 0.0009 Within groups 2.36213 45 0.0524917 Total (Corr.) 4.09941 53 Multiple Range Tests for HT Protease by Nong casein -Method: 95.0 percent LSD Nong casein Count Mean Homogeneous Groups Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng xvii Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học Cần Thơ -0.2 0.362 X 0.3 0.55 XX 0.4 0.62 XXX 0.5 0.718 XXX 0.6 0.746 XXX 0.7 0.846 XX 0.908 X 1.4 0.908 X 0.8 0.91 X -Contrast Difference +/- Limits -0.2 - 0.3 -0.188 0.26642 0.2 - 0.4 -0.258 0.26642 0.2 - 0.5 *-0.356 0.26642 0.2 - 0.6 *-0.384 0.26642 0.2 - 0.7 *-0.484 0.26642 0.2 - 0.8 *-0.548 0.26642 0.2 - *-0.546 0.26642 0.2 - 1.4 *-0.546 0.26642 0.3 - 0.4 -0.07 0.26642 0.3 - 0.5 -0.168 0.26642 0.3 - 0.6 -0.196 0.26642 0.3 - 0.7 *-0.296 0.26642 0.3 - 0.8 *-0.36 0.26642 0.3 - *-0.358 0.26642 0.3 - 1.4 *-0.358 0.26642 0.4 - 0.5 -0.098 0.26642 0.4 - 0.6 -0.126 0.26642 0.4 - 0.7 -0.226 0.26642 0.4 - 0.8 *-0.29 0.26642 0.4 - *-0.288 0.26642 0.4 - 1.4 *-0.288 0.26642 0.5 - 0.6 -0.028 0.26642 0.5 - 0.7 -0.128 0.26642 0.5 - 0.8 -0.192 0.26642 0.5 - -0.19 0.26642 0.5 - 1.4 -0.19 0.26642 0.6 - 0.7 -0.1 0.26642 0.6 - 0.8 -0.164 0.26642 0.6 - -0.162 0.26642 0.6 - 1.4 -0.162 0.26642 0.7 - 0.8 -0.064 0.26642 0.7 - -0.062 0.26642 0.7 - 1.4 -0.062 0.26642 0.8 - 0.002 0.26642 0.8 - 1.4 0.002 0.26642 - 1.4 0.0 0.26642 3.2 Kết chương trình SAS 9.1 xác định phương trình Michaelis - Menten data Nitofoocmon; input conc act; cards; 0.000 0.2 0.362 0.3 0.550 0.4 0.620 0.5 0.718 0.6 0.746 0.7 0.846 0.8 0.910 1.0 0.908 1.4 0.908 ; proc nlin data=Nitofoocmon method=marquardt maxiter=1000; parms vmax=0.01 to 0.2 by 0.01 Km=0 to 50 by 0.01; Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng xviii Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học Cần Thơ Model act=vmax* (conc/ (conc+Km)); Output out=Nitofoocmon p=predict r=residu; run; goptions reset=all gunit=cm horigin= cm hsize=11 cm vorigin=1 cm vsize=9 cm; Title1 h=0.45 f=simulate 'Do thi Michaelis-Menten-Protease'; symbol1 V=triangle c=black h=0.4 I=none; symbol2 V=none c=black h=0.3 I=join; axis1 LABEL = (F=simulate H=0.35 '[Nong co chat casein] (%)') order=0 to 1.4 by 0.2 VALUE = (F=simulate H=0.35); axis2 LABEL = (a=90 F=simulate H=0.35 'Tyrosine (micromol/phut)') order=0 to 1.2 by 0.2 VALUE = (F=simulate H=0.35); proc gplot data=Nitofoocmon; plot act*conc/ frame haxis=axis1 vaxis=axis2; plot2 predict*conc/ haxis=axis1 vaxis=axis2 noaxis nolegend; run; NOTE: An intercept was not specified for this model Sum of Mean Approx Source DF Squares Square F Value Pr > F Model 5.0667 2.5333 1263.18 [...]... Chuẩn bị dung dịch enzyme từ nghiệm tối ưu ở thí nghiệm 1 Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme protease trên cơ chất là casein Tiến hành thí nghiệm như trên, mỗi mẫu đều tiến hành xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp Kunitz (phụ lục) 3.2.2.3 Thí nghiệm 3: khảo sát ảnh hưởng nồng độ cơ chất lên hoạt tính enzyme protease - Mục đích: xác định động học của enzyme, tìm ra Vmax... mẫu đối chứng và mẫu phân tích xác định được hoạt tính enzyme và hàm lượng protein từ đó tìm ra hoạt độ riêng cao nhất, lấy sử dụng làm nguồn enzyme cho các thí nghiệm sau 3.2.2.2 Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme protease - Mục đích: tìm hiểu quy luật biến đổi hoạt tính của enzyme protease ở những điều kiện môi trường khác nhau - Bố trí thí nghiệm Chuyên ngành... đến khả năng sinh tổng hợp enzyme protease - Mục đích: nuôi Aspergillus oryzae ở các thành phần môi trường và pH môi trường khác nhau Từ đó xác định thành phần môi trường và pH môi trường thích hợp để nấm sợi sinh tổng hợp enzyme protease mạnh nhất - Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí với 02 nhân tố hoàn toàn ngẫu nhiên với 02 lần lặp lại Nhân tố A: thành phần môi trường A1: 75% cám + 15% trấu... hưởng của nhiệt độ và pH môi trường Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển và hình thành enzyme của Aspergillus oryzae là khoảng 28 ÷ 32 oC Nhiệt độ do nấm mốc tỏa ra môi trường có thể lên đến 40oC hoặc cao hơn Cần giữ cho nhiệt độ môi trường không xuống dưới 27 oC và không quá 36oC Thích hợp cho Aspergillus oryzae phát triển là môi trường acid yếu 5,5 ÷ 6,5 Các môi trường tự nhiên từ cám, đậu, ngô thường... serine protease thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng - Cysteine protease: các protease chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động Cysteine protease bao gồm các protease thực vật như papayin, bromalin, một vài protease động vật và protease ký sinh trùng Các cysteine protease thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng - Aspartic protease: ... dưới tác dụng của EDTA 2.1.2.3 Dựa vào khả năng hoạt động ở các giá trị pH khác nhau Chia làm 03 loại protease acid, protease trung tính và protease kiềm - Protease acid: loại protease này được thu nhận từ nấm mốc màu đen như: Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus saitoi pH hoạt động của protease nấm mốc này là 2,5 ÷ 3,0 - Protease trung tính: loại này có ở rất nhiều loại nấm mốc khác... không cần điều chỉnh pH Môi trường bán rắn là môi trường tĩnh nên sự thay đổi pH ở một vùng nào đó ít khi ảnh hưởng đến toàn bộ khối môi trường Thời gian nuôi nấm sợi thu nhận enzyme vào khoảng 36 ÷ 60 giờ Điều này còn phụ thuộc vào chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và điều kiện môi trường cũng như phụ thuộc vào điệu kiện nuôi cấy Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng phương... phẩm enzyme thô (vì ngoài thành phần enzyme ra chúng còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường và nước có trong môi trường) Người ta thường sấy khô chế phẩm enzyme đến một độ ẩm thấp để đảm bảo cho chế phẩm enzyme thô không mất hoạt tính nhanh 2.5.5 Thu nhận chế phẩm enzyme protease thô Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzyme Chế phẩm này được gọi là chế phẩm enzyme. .. bề mặt môi trường không phẳng Cần lắc nhẹ vài vòng cốc thủy tinh để đảm bảo môi trường đồng nhất trước khi đổ đĩa Việc đổ đĩa được thực hiện trong tủ cấy vi sinh vật, trong không gian vô trùng của ngọn lửa đèn cồn Tuần tự rót vào mỗi đĩa khoảng 10 ÷ 15ml môi trường, xoay tròn đĩa để môi trường trong đĩa được dàn đều và để yên cho môi trường đặc lại Khi môi trường đặc dùng kim cấy nấm mốc giống Aspergillus. .. mốc có màu vàng như: Aspergillus oryzae, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus tericole Ngoài nấm mốc ra, protease trung tính còn tìm thấy ở vi khuẩn Bacillus mesentericus - Protease kiềm: tìm thấy nhiều ở nấm men Tuy nhiên việc tạo ra protease acid, trung tính và kiềm còn phụ thuộc rất nhiều vào thành phần môi trường hoặc cơ chất mà chúng tác dụng Đã có nhiều trường hợp thí nghiệm ... nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học Cần Thơ Luận văn đính kèm theo đây, với đề tựa “KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME PROTEASE TRÍCH LY TỪ ASPERGILLUS ORYZAE TRÊN MÔI TRƯỜNG RẮN”, “HUỲNH THỊ PHƯƠNG... B3 có hoạt tính enzyme trung bình cao (0,969TU/ml) B1 có hoạt tính enzyme trung bình thấp (0,643TU/ml) Hình 22 thể hoạt tính enzyme tăng theo thành phần môi trường pH môi trường Hoạt tính enzyme. .. 2012 Trường Đại học Cần Thơ Tương tự hoạt tính tổng enzyme protease, hình 23 nhận thấy hoạt tính riêng enzyme protease tăng có thay đổi pH môi trường thành phần môi trường Enzyme có hoạt tính