khảo sát hoạt tính enzyme protease trích ly từ aspergillus oryzae trên môi trường rắn

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng ii Luận văn đính kèm theo đây, với đề tựa “KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME PROTEASE TRÍCH LY TỪ ASPERGILLUS ORYZAE TRÊ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME PROTEASE TRÍCH LY

TỪ ASPERGILLUS ORYZAE TRÊN MÔI TRƯỜNG RẮN

NĂM 2012

Sinh viên thực hiện

Huỳnh Thị Phương Thảo MSSV: LT10039

Lớp: CNTP K36LT

Giáo viên hướng dẫn

TS Nguyễn Công Hà

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng ii

Luận văn đính kèm theo đây, với đề tựa “KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME

PROTEASE TRÍCH LY TỪ ASPERGILLUS ORYZAE TRÊN MÔI TRƯỜNG

RẮN”, do “HUỲNH THỊ PHƯƠNG THẢO” thực hiện và báo cáo, đã được hội

đồng chấm luận văn thông qua

Giáo viên hướng dẫn Giáo viên phản biện 1

TS NGUYỄN CÔNG HÀ

Giáo viên phản biện 2

Cần Thơ, ngày … tháng … năm …

Chủ tịch hội đồng

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng iii

LỜI CẢM ƠN

Qua ba học kì học tập tại trường Đại học Cần Thơ em đã được quý thầy cô trường Đại học Cần Thơ, đặc biệt là thầy cô trong bộ môn Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng tạo điều kiện thuận lợi và truyền thụ những kiến thức quý báu, tạo cơ sở khoa học vững chắc cho em trong suốt thời gian học tập

Sau khi hoàn thành chương trình học tại trường, em đã được thầy Nguyễn Công Hà tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp

Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học trường Đại học Cần Thơ

đã cung cấp nguồn nấm mốc cho em thực hiện đề tài Đặc biệt cảm ơn thầy Nguyễn Văn Thành đã nhiệt tình giúp đỡ em

Em xin chân thành cảm ơn!

Cần Thơ, ngày 15 tháng 5 năm 2012 Sinh viện thực hiện

HUỲNH THỊ PHƯƠNG THẢO

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng iv

TÓM TẮT

Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như chế biến thực phẩm, sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp…nhưng giá thành chế phẩm enzyme thương mại hiện nay còn rất cao Vì vậy đề tài này được thực hiện với mục đích dùng nấm mốc để làm dồi dào nguồn enzyme và giảm giá thành chế phẩm enzyme thương mại Quá trình nghiên cứu cũng tiến hành xác định động học của enzyme này nhằm phục vụ cho những nghiên cứu ứng dụng vào sản xuất thực phẩm Sau đó dựa vào nguồn enzyme này ứng dụng vào việc thuỷ phân da cá tra để sản xuất collagen

Kết quả nghiên cứu của đề tài cho thấy có thể tiến hành thu enzyme có hoạt tính cao ở thành phần môi trường thích hợp để tạo enzyme protease thuỷ phân trong môi trường acid là 70% cám : 25% trấu : 5% gelatin và pH môi trường là 5

Đồng thời có sự tương tác giữa pH và nhiệt độ xử lý lên hoạt tính của hệ enzyme protease trong dịch chiết Enzyme này thể hiện hoạt tính tối ưu ở nhiệt độ

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng v

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN iii

TÓM TẮT iv

MỤC LỤC v

DANH SÁCH BẢNG vii

DANH SÁCH HÌNH viii

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 SƠ LƯỢC VỀ ENZYME PROTEASE 3

2.1.1 Giới thiệu 3

2.1.2 Phân loại enzyme protease vi sinh vật 4

2.1.3 Động học của enzyme 5

2.2 GIỚI THIỆU VỀ CƠ CHẤT 8

2.2.1 Giới thiệu về cơ chất gelatine 8

2.2.2 Giới thiệu về cơ chất casein 9

2.2.3 Giới thiệu về cơ chất Bovine Serium Albumin (BSA) 10

2.3 NGUỒN TỔNG HỢP ENZYME PROTEASE TỪ VI SINH VẬT 11

2.3.1 Đặc điểm enzyme protease từ vi sinh vật 11

2.3.2 Nguồn thu enzyme protease từ vi sinh vật 11

2.4 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG XÚC TÁC CỦA ENZYME 13

2.4.1 Các nhóm phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme 13

2.4.2 Đơn vị hoạt độ của enzyme 14

2.5 SẢN XUẤT ENZYME PROTEASE TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE 14

2.5.1 Sơ lược về nấm mốc Aspergillus oryzae 14

2.5.2 Môi trường nuôi cấy 15

2.5.4 Phương pháp nuôi cấy bề mặt 16

2.5.5 Thu nhận chế phẩm enzyme protease thô 19

2.6 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME PROTEASE 20

2.6.1 Độ ẩm môi trường 20

2.6.2 Ảnh hưởng của không khí 20

2.6.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH môi trường 20

2.6.4 Thời gian nuôi cấy 20

2.7 ỨNG DỤNG CỦA ENZYME PROTEASE 20

2.7.1 Ứng dụng trong chế biến thực phẩm 20

2.7.2 Ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác 21

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM 22

3.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 22

3.1.2 Vật liệu 22

3.1.3 Đối tượng nghiên cứu 22

3.1.4 Hoá chất thí nghiệm 22

3.1.5 Thiết bị thí nghiệm 23

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng vi

3.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 24

3.2.1 Phương pháp thí nghiệm 24

3.2.2 Bố trí thí nghiệm 245

3.2.2.1 Thí nghiệm 1: khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường và pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzyme protease 25

3.2.2.2 Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme protease 26

3.2.2.3 Thí nghiệm 3: khảo sát ảnh hưởng nồng độ cơ chất lên hoạt tính enzyme protease 27

3.2.2.4 Thí nghiệm 4: khảo sát khả năng thuỷ phân của enzyme protease trên dung dịch acid protein 28

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 29

4.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường và pH môi trường khác nhau 29

4.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme protease 32

4.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính enzyme protease 35

4.4 Kết quả khảo sát khả năng thuỷ phân của enzyme protease trên dung dịch acid protein ở những thời gian khác nhau 36

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39

5.1 KẾT LUẬN 39

5.2 KIẾN NGHỊ 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

PHỤ LỤC 1: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ix

PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ THỐNG KÊ xiv

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng vii

DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Thành phần acid amin có trong gelatine 8

Bảng 2: Thành phần các acid amin trong casein 9

Bảng 3: Thành phần các acid amin trong phân tử BSA 10

Bảng 4: Thành phần dinh dưỡng của cám 16

Bảng 5: Sự thay đổi hoạt tính enzyme (TU/ml) theo thành phần môi trường và pH môi trường 30

Bảng 6: Sự thay đổi hoạt tính riêng (TU/mg) của enzyme theo thành phần môi trường và pH môi trường 30

Bảng 7: Sự thay đổi hoạt tính của enzyme protease theo pH với từng nhiệt độ 32

Bảng 8: Sự thay đổi hoạt tính của enzyme protease theo nồng độ casein 35

Bảng 9: Hàm lượng protein còn lại sau quá trình thuỷ phân 37

Bảng 10: Hàm lượng tyrosine sau quá trình thuỷ phân 38

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng viii

DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Mô hình enzyme protease thủy phân phân tử protein 3

Hình 2: Cấu trúc không gian enzyme protease 4

Hình 3: Đồ thị biểu diễn phương trình Michaelis – Menten 7

Hình 4: Đồ thị biểu diễn phương trình Line Weaver 8

Hình 5: Bacillus 12

Hình 6: Nấm mốc 12

Hình 7: Xạ khuẩn 13

Hình 8: Nấm mốc Aspergillus oryzae sau khi ủ 4 ngày 15

Hình 9: Nấm mốc Aspergillus oryzae qua kính hiển vi 15

Hình 10: Quy trình nuôi cấy vi sinh vật bằng phương pháp bề mặt 17

Hình 11: Máy khuấy từ 23

Hình 12: Cân điện tử 23

Hình 13: Tủ ủ 23

Hình 14: Máy đo quang phổ 23

Hình 15: Tủ cấy vi sinh vật 24

Hình 16: Thiết bị ủ nhiệt 24

Hình 17: Máy vortex 24

Hình 18: Kính hiển vi điện tử 24

Hình 19: Quy trình thí nghiệm sản xuất enzyme protease 26

Hình 20: Môi trường sau khi ủ 42 giờ 29

Hình 21: Dịch lọc thô enzyme protease 29

Hình 22: Biến đổi hoạt tính của enzyme theo pH và thành phần môi trường 30

Hình 23: Biến đổi hoạt tính riêng của enzyme theo pH và thành phần môi trường 31 Hình 24: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của protease theo nhiệt độ 32

Hình 25: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của protease thep pH 33

Hình 26: Sự ảnh hưởng tương tác của pH và nhiệt độ xử lý lên hoạt tính của enzyme protease 34

Hình 27: Ảnh hưởng của nồng độ casein lên hoạt tính enzyme protease theo phương trình Michaelis – Menten 36

Hình 28: Biến đổi hàm lượng protein theo thời gian thuỷ phân 37

Hình 29: Thay đổi hàm lượng tyrosine ở những thời gian thuỷ phân khác nhau 38

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 1

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ Sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu hết trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Đặc biệt trong ngành thực phẩm, những ứng dụng của kỹ thuật sinh học đã tạo nên những tiến bộ đáng kinh ngạc trong việc sản xuất các sản phẩm mới cũng như gia tăng hiệu suất của các sản phẩm truyền thống Hàng năm lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt trên 300.000 tấn với giá trị hơn 500 triệu USD được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau

Công nghệ sản xuất enzyme đã đem lại những lợi nhuận to lớn cho Việt Nam Ứng dụng enzyme để hỗ trợ cho quá trình sản xuất trong chế biến thực phẩm

đã trở nên phổ biến và quen thuộc Bản chất của enzyme là những chất protein Chúng được tạo ra bởi tế bào sống (thực vật, động vật và vi sinh vật) là chất xúc tác cho các phản ứng sinh học Chức năng chính của enzyme trong hoạt động sống là xúc tác sự hình thành và cắt đứt các liên kết hóa học

Do có ưu thế về nhiều mặt nên vi sinh vật đã trở thành nguồn thu enzyme chủ đạo Tùy theo mục đích sử dụng mà người ta sản xuất nhiều dạng chế phẩm enzyme khác nhau như enzyme thô, enzyme bán tinh khiết và enzyme tinh khiết Sản xuất enzyme từ vi sinh vật so với từ thực vật và động vật có rất nhiều ưu điểm như:

- Tốc độ sản sinh của vi sinh vật rất mạnh

- Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính rất cao

- Vi sinh vật là rất thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp

- Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme rẻ tiền và dễ kiếm

- Vi sinh vật có thể sinh tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzyme khác nhau

Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm phomat, làm mềm thịt…), sản xuất chất tẩy rửa, công nghiệp thuộc da, y tế, nông nghiệp…

Việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như nguồn cung cấp protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn Tuy nhiên giá thành chế phẩm enzyme còn khá cao, do đó cũng hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzyme trong công nghiệp và đời sống

Với những thuận lợi và sự cần thiết của enzyme, đề tài thực hiện khảo sát

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 2

một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme protease từ

Aspergillus oryzae trên môi trường rắn Bởi những ứng dụng ngày càng rộng rãi của

protease thì việc sản xuất ra enzyme sẽ góp phần đưa công nghệ enzyme ngày càng phát triển, góp phần hạ giá thành chế phẩm enzyme tạo điều kiện mở rộng sản xuất enzyme trong thực tế, cải thiện được quy trình sản xuất, cải thiện điều kiện lao động

và nâng cao chất lượng sản phẩm

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Đề tài nghiên cứu nhằm khảo sát hoạt tính enzyme protease trích ly từ

Aspergillus oryzae trên môi trường rắn với các mục tiêu sau:

- Ảnh hưởng của thành phần môi trường và pH môi trường khác nhau đến quá trình sinh tổng hợp enzyme protease

- Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt tính xúc tác phản ứng thuỷ phân của enzyme protease

- Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính xúc tác phản ứng thuỷ phân của enzyme protease

- Khảo sát khả năng thuỷ phân của enzyme protease trên dung dịch acid protein

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 3

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

Enzyme protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi sinh vật là phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn… Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất

để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghiệp và đời sống

2.1 SƠ LƯỢC VỀ ENZYME PROTEASE

2.1.1 Giới thiệu

Protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptid (-CO-NH-) của phân tử protein, polypeptid đến sản phẩm cuối cùng

là các acid amin Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este

và vận chuyển acid amin

Hình 1: Mô hình enzyme protease thủy phân phân tử protein

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ

tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn) đến thực vật (đu đủ, dứa…) và động vật (gan, dạ dày bê…) So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất

Hầu hết protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có thể sử dụng các enzyme này theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các liên kết peptid định trước Yếu tố tăng cường quá trình tổng hợp bao gồm pH, các nhóm carboxyl hoặc nhóm amin được lựa chọn để bảo vệ khả năng kết tủa sản phẩm…

Trong cơ thể protein thực phẩm được phân giải ở bộ máy tiêu hóa bởi các enzyme phân giải protein, đầu tiên là pepsin trong dịch dạ dày và sau đó là các protease được tiết ra ở tuyến tụy và từ các tế bào ở màng nhầy thành ruột Các acid

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 4

amin tự do, các peptid ngắn được hấp thụ và đi qua các tế bào hình lông ở thành ruột Phần lớn các peptid được hấp thụ bị thủy phân ở các tế bào thành ruột Các acid amin được hấp thụ sẽ đi vào gan và sau đó tham gia vào quá trình chuyển hóa

Quá trình thủy phân protein đóng vai trò quan trọng trong sản xuất nhiều loại thực phẩm Quá trình này có thể được thực hiện nhờ chính protease của thực phẩm

đó hoặc do các protease vi sinh vật được đưa vào trong quá trình chế biến thực phẩm

Trong nhiều trường hợp các tính chất protein của thực phẩm được cải thiện khi thủy phân hạn chế hoặc sâu sắc nhờ các enzyme protease Sự thủy phân hạn chế

có tác dụng tăng khả năng nhũ hóa và tạo bọt của protein (do tăng tính hòa tan và khả năng khuếch tán đến bề mặt phân chia)

Hình 2: Cấu trúc không gian enzyme protease 2.1.2 Phân loại enzyme protease vi sinh vật

Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) trong hệ thống phân loại các nhóm enzyme

Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase

2.1.2.1 Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptid, exopeptidase được phân chia

thành hai loại:

- Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptid ở đầu nitơ tự do

của chuỗi polypeptid để giải phóng ra một amino acid, một dipeptid hoặc một tripeptid

- Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptid ở đầu cacbon

của chuỗi polypeptid và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptid

2.1.2.2 Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn

nhóm:

- Serine protease: là những protease chứa nhóm –OH của gốc serine

trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin,

elastase Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như Subtilisin

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 5

Carlsberg, Subtilisin BPN Các serine protease thường hoạt động mạnh ở vùng

kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng

- Cysteine protease: các protease chứa nhóm –SH trong trung tâm

hoạt động Cysteine protease bao gồm các protease thực vật như papayin, bromalin, một vài protease động vật và protease ký sinh trùng Các cysteine protease thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng

- Aspartic protease: hầu hết các aspartic protease thuộc nhóm pepsin

Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, rennin Các aspartic protease có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính

- Metallo protease: là nhóm protease được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm

mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo protease thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA

2.1.2.3 Dựa vào khả năng hoạt động ở các giá trị pH khác nhau

Chia làm 03 loại protease acid, protease trung tính và protease kiềm

- Protease acid: loại protease này được thu nhận từ nấm mốc màu đen

như: Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus saitoi pH hoạt động của

protease nấm mốc này là 2,5 ÷ 3,0

- Protease trung tính: loại này có ở rất nhiều loại nấm mốc khác nhau,

chủ yếu là ở các loại nấm mốc có màu vàng như: Aspergillus oryzae, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus tericole Ngoài nấm mốc ra, protease trung tính còn tìm thấy ở vi khuẩn Bacillus mesentericus

- Protease kiềm: tìm thấy nhiều ở nấm men Tuy nhiên việc tạo ra protease acid, trung tính và kiềm còn phụ thuộc rất nhiều vào thành phần môi trường hoặc cơ chất mà chúng tác dụng Đã có nhiều trường hợp thí nghiệm cho thấy thành phần môi trường làm thay đổi hẳn đặc tính của protease

2.1.3 Động học của enzyme

2.1.3.1 Ý nghĩa của việc nghiên cứu động học enzyme

Nghiên cứu động học của enzyme là nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố: nồng độ cơ chất, enzyme, pH môi trường, nhiệt độ, các chất kìm hãm… đến tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác Việc nghiên cứu động học enzyme sẽ cho ta biết được các vấn đề sau đây:

- Có thể biết được cơ chế phân tử của sự tác động của enzyme

- Cho phép ta hiểu biết được mối quan hệ về mặt năng lượng của quá trình enzyme

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 6

- Thấy được vai trò quan trọng cả về mặt lý luận lẫn thực tiễn: khi lựa chọn các đơn vị hoạt động enzyme người ta cần phải biết những điều kiện tốt nhất đối với hoạt động của enzyme, cũng như cần phải biết được các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của chúng

- Là điều kiện cần thiết để thực hiện tốt các bước tinh chế enzyme, vì người ta cần phải kiểm tra về mặt năng lượng bằng cách xác định có hệ thống hoạt động của chế phẩm enzyme trong các giai đoạn tinh chế

2.1.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

a Phương trình động học Michalelis – Menten

Năm 1913 hai nhà khoa học Leonom Michalelis và Maud Menten đưa ra mô hình động học để giải thích phản ứng xúc tác bởi enzyme và lập phương trình phản ánh mối quan hệ giữa vận tốc phản ứng, nồng độ cơ chất và enzyme

Mô hình chuyển hoá của phản ứng enzyme với một cơ chất như sau:

1 1

ES k cat

k k

Etot: nồng độ enzyme ban đầu Giả sử nồng độ enzyme ban đầu cũng là nồng độ cơ chất ở trạng thái cân bằng của phản ứng, nếu bỏ qua phản ứng ngược PE ES

Tốc độ phản ứng tại thời điểm bắt đầu phản ứng: V dP dt/ k cat ES

Phản ứng xấp xỉ trạng thái ổn định (Steady – State): [ES] là hằng số

Tốc độ xuôi chiều = tốc độ ngược chiều

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 7

Phương trình (*) là phương trình Michaelis – Menten Phương trình này phản ánh tương quan định lượng giữa tốc độ ban đầu của phản ứng V, tốc độ cực đại của phản ứng Vmax, nồng độ cơ chất ban đầu [S] và hằng số Km

Hình 3: Đồ thị biểu diễn phương trình Michaelis – Menten

(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Những trường hợp giới hạn của phương trình Michaelis – Menten

V = kcat[S]Etot/(Km+[S]) = Vmax[S]/(Km+[S]) Trong trường hợp:

V ~ (1/2)Vmax = (1/2)kcatEtot

b Ý nghĩa của hằng số Michaelis – Menten

Ý nghĩa thực tiễn của hằng số Michaelis, chính là giá trị của nồng độ cơ chất khi tốc độ phản ứng bằng ½ tốc độ cực đại Km có đơn vị là Molar, khi [S] = Km thì

V = Vmax/2 và ngược lại

Hằng số Michaelis là một hằng số rất quan trọng Nó xác định ái lực của enzyme với cơ chất Km càng nhỏ thì ái lực càng lớn, tốc độ phản ứng càng cao vì thế tốc độ cực đại Vmax đạt ở nồng độ cơ chất thấp

(kcat/Km) là hằng số tốc độ phản ứng hai phân tử hiệu quả tại nồng độ cơ chất thấp Khi (kcat/Km) ~ 109 chỉ ra rằng sự xúc tác gần như hoàn chỉnh: mỗi khi cơ chất gặp enzyme hầu như đều chuyển thành sản phẩm

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 8

c Phương trình Line Weaver

V = Vmax[S]/(Km + [S]) Nghịch đảo 2 vế phương trình:

1/V = (1/Vmax) + (Km/Vmax)*(1/[S]) Đây là phương trình được Line Weaver và Burk đưa ra vào năm 1943 có dạng y = ax + b là phương trình đường thẳng

Nếu vẽ đồ thị đường thẳng sẽ cắt trục tung ở 1/Vmax và cắt trục hoành ở 1/Km và độ nghiêng bằng Km/Vmax Từ phương trình trên ta dễ dàng xác định Km và

-Vmax trong các thí nghiệm

Hình 4: Đồ thị biểu diễn phương trình Line Weaver

(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.2 GIỚI THIỆU VỀ CƠ CHẤT

2.2.1 Giới thiệu về cơ chất gelatine

Cơ chất cảm ứng được xem như yếu tố rất quan trọng dùng để điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzyme

Gelatine có sẵn trong tự nhiên nhưng nó được tìm thấy từ protein collagen gốc bằng quá trình phá hủy cấu trúc bậc hai hoặc cao hơn ở các nhiệt độ khác nhau của quá trình thủy phân polypeptide có trong xương và da

Gelatine là các polypeptide cao phân tử dẫn xuất từ collagen, là thành phần protein chính trong các tế bào liên kết của nhiều loại động vật Cấu tạo là một chuỗi acid amin gồm 3 acid amin chủ yếu là glycine, proline và hydroproline.Trong phân

tử gelatine, các acid amin liên kết với nhau tạo chuỗi xoắn ốc có khả năng giữ nước

Bảng 1: Thành phần acid amin có trong gelatine

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 9

2.2.2 Giới thiệu về cơ chất casein

Casein là protein chủ yếu trong sữa, chiếm khoảng 80% protein của sữa Chúng tồn tại dưới dạng micelle Casein là những protein có tính acid vì trong phân

tử của chúng rất giàu các acid glutamic và acid aspartic Tất cả các casein đều được phosphoryl hoá với những mức độ khác nhau trên gốc serin và threonine Casein có điểm đẳng điện pI = 4,6 Casein trong sữa có nguồn gốc từ những chủng bò khác nhau nên có cấu trúc bậc 1 khác nhau Casein trong sữa có 4 dạng chính: casein αs1

và casein αs2, casein β, casein K

- Casein αs1: phân tử lượng khoảng 23.000Da, có 199 gốc acid amine Do

sự phân bố các phần tích điện và các phần ưa béo không đồng đều nên các phân tử loại này có tính chất lưỡng cực, 1 đầu ưa nước, 1 đầu kỵ nước

- Casein αs2: phân tử lượng 25.000Da, có 207 gốc acid amine, có tính ưa nước cao nhất trong các loại casein do phân tử của nó chứa nhiều nhóm phosphoryl

và gốc cation nhất

- Casein β: phân tử lượng khoảng 24.000Da, có 209 gốc acid amine, có tính ưa béo cao nhất Phân tử casein β gồm 10% cấu trúc xoắn α, 13% cấu trúc lá xếp β và 77% cấu trúc không trật tự

- Casein K: phân tử lượng khoảng 19.000Da, có 169 gốc acid amine Loại này chỉ chứa một gốc phosphoryl và cũng có tính lưỡng cực Đầu amino của phân tử protein thì ưa béo còn đầu carboxyl thì ưa nước Casein K gồm 23% vùng xoắn α, 31% vùng lá xếp β và 24% vùng vòng cung β

Bảng 2: Thành phần các acid amin trong casein

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 10

2.2.3 Giới thiệu về cơ chất Bovine Serium Albumin (BSA)

Serum Albumin là một trong những protein được nghiên cứu rộng rãi và là protein phong phú nhất trong huyết tương với nồng độ là 5g/100ml Nhiều nhà khoa học đã có nghiên cứu về cấu trúc và những tính chất của serum albumin cũng như những ảnh hưởng của nó đến những loại protein khác để từ đó biết được ảnh hưởng của serum albumin đến chức năng của thực phẩm là như thế nào

BSA là protein hình cầu lớn (66.000Da) với những acid amin cần thiết Nó

có đầy đủ những đặc điểm và tính chất của protein đã được biết đến (Peter, 1975)

Trong thành phần của nó chứa ít tryptophane và methionine nhưng hàm lượng cystein và acid amin phân cực cao Hàm lượng glycine và isoleucine phân tử BSA thì thấp hơn mức trung bình trong protein (Peter, 1985) Thành phần acid amin trong phân tử BSA được trình bày trong bảng 3

Bảng 3: Thành phần các acid amin trong phân tử BSA

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 11

2.3 NGUỒN TỔNG HỢP ENZYME PROTEASE TỪ VI SINH VẬT

2.3.1 Đặc điểm enzyme protease từ vi sinh vật

Khác với protease thực vật và động vật, protease của vi sinh vật là những enzyme ngoại bào và có tính đặc hiệu rộng rãi

Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghiệp và đời sống Dùng nguồn vi sinh vật

có những lợi ích chính như sau:

- Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật và giống vi sinh vật

- Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn 16 ÷ 100 giờ nên có thể thu nhiều lần trong năm

- Có thể điều khiển sinh tổng hợp enzyme dễ dàng theo hướng có lợi (định hướng sử dụng và tăng hiệu suất tổng thu hồi)

- Giá thành tương đối thấp vì môi trường tương đối rẻ, đơn giản, dễ tổ chức sản xuất

Tuy nhiên trong mọi trường hợp cần lưu ý khả năng sinh độc tố (gây độc, gây bệnh) để có biện pháp phòng ngừa và xử lý thích hợp

Để sản xuất chế phẩm enzyme, người ta có thể phân lập các giống vi sinh vật

có trong tự nhiên hoặc các giống đột biến có lựa chọn theo hướng có lợi nhất, chỉ tổng hợp ưu thế một loại enzyme nhất định cần thiết nào đó

2.3.2 Nguồn thu enzyme protease từ vi sinh vật

Enzyme protease phân bố chủ yếu ở vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn và một số loại nấm men

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 12

circulans, Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Bacillus thermorpoteoliticus, Bacillus thermophyllus, Bacillus brevis và một số giống thuộc chi Clostridium Trong đó Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất Các vi khuẩn

thường tổng hợp protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu

Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH = 5 ÷ 8) và có khả năng chịu nhiệt thấp Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng Các protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với các acid amin ưa béo và

thơm Chúng được sinh ra nhiều bởi Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Bacillus thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium

Hình 5: Bacillus

2.3.2.2 Nấm mốc

Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng

dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng Aspergillus oryzae, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus soyae, Penicillum chysogenum, Mucor hiemalis…Các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả 03 loại protease: acid,

trung tính và kiềm Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có khả năng

thủy phân protein ở pH 2,5 ÷ 3,0

Một số nấm mốc như Aspergillus canditatus, Penicillum cameberti, Penicillium roqueforti…cũng có khả năng tổng hợp protease đông tụ sữa sử dụng

trong sản xuất phomat

Hình 6: Nấm mốc

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 13

Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là protease được chiết

tách từ Streptomyces grieus, enzyme này có tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy

phân tới 90% liên kết peptid của nhiều protein thành acid amin Ở Liên Xô (cũ)

người ta cũng tách được chế phẩm tương tự từ Streptomyces grieus có tên là

protelin

Hình 7: Xạ khuẩn 2.4 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG XÚC TÁC CỦA ENZYME

Người ta xác định khả năng xúc tác của enzyme thông qua việc xác định hoạt

độ hoạt động của enzyme Người ta cũng không thể định lượng enzyme trực tiếp mà phải xác định gián tiếp thông qua hoạt độ hoạt động của chúng hoặc thông qua khả năng làm giảm cơ chất sau một thời gian phản ứng

2.4.1 Các nhóm phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme

Hiện nay nhiều phòng thí nghiệm sử dụng một trong ba nhóm phương pháp sau để xác định khả năng xúc tác của enzyme

- Tiến hành đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành sau một thời gian nhất định và lượng enzyme đã xác định trước Phương pháp này được áp dụng rộng rãi và đã được xác định là tương đối chính xác

- Tiến hành xác định thời gian cần thiết để thu nhận được một lượng biến đổi nhất định của lượng cơ chất hay lượng sản phẩm tương ứng với một lượng enzyme nhất định

- Tiến hành chọn nồng độ enzyme cần thiết để trong một thời gian nhất định sẽ thu được sự biến đổi nhất định về cơ chất hay sản phẩm

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 14

2.4.2 Đơn vị hoạt độ của enzyme

Khả năng xúc tác của enzyme được xác định thông qua hoạt độ hoạt động của enzyme Hoạt độ hoạt động của enzyme được xác định thông qua đơn vị hoạt

độ Người ta biểu diễn đơn vị hoạt độ qua những đơn vị sau

2.4.2.1 Đơn vị hoạt độ quốc tế (UI)

Đơn vị hoạt độ quốc tế là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa được 1µmol cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn

1UI = 1µmol cơ chất (10-6mol)/phút

2.4.2.4 Hoạt độ riêng của phân tử

Hoạt độ riêng của phân tử enzyme là số phân tử cơ chất được chuyển hóa bởi một phân tử enzyme trong một đơn vị thời gian

2.5 SẢN XUẤT ENZYME PROTEASE TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUS

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 15

Loài: Aspergillus oryzae

2.5.1.2 Đặc điểm

 Hình thái

Chủng mốc Aspergillus oryzae có màu vàng hoa cau, sợi nấm phát triển rất

mạnh (chiều ngang 5 ÷ 7µm), có vách ngăn chia sợi nấm thành nhiều tế bào (nấm

đa bào), phát triển thành từng đám gọi là hệ sợi nấm hay khuẩn ty

Hình 8: Nấm mốc Aspergillus oryzae sau khi ủ 4 ngày

Hình 9: Nấm mốc Aspergillus oryzae qua kính hiển vi

 Điều kiện phát triển

Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành bào tử: 45%

Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành enzyme: 55 ÷ 58%

Độ ẩm không khí: 85 ÷ 95%

pH môi trường: 5,5 ÷ 6,5

Nhiệt độ nuôi cấy: 27 ÷ 30oC

2.5.2 Môi trường nuôi cấy

2.5.2.1 Nguyên liệu

Môi trường sử dụng nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận enzyme thường là cám

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 16

gạo hay cám mì, bã củ cải hoặc thóc nảy mầm Trong các loại nguyên liệu trên thì cám gạo, cám mì thường được sử dụng nhiều hơn cả Hai loại cám này có đầy đủ chất dinh dưỡng cần thiết cho vi sinh vật phát triển Mặt khác, khi tạo môi trường, chúng thường có tính chất vật lý rất thích hợp để đảm bảo khối kết dính cần thiết, vừa đảm bảo lượng không khí lưu chuyển trong khối nguyên liệu Nguồn dinh dưỡng bổ sung thường là các muối ammonium, phosphat…

Trong nhiều trường hợp, để tạo khả năng thoáng khí tốt hơn, người ta thường cho thêm trấu với lượng khoảng 20 ÷ 25% Thực chất, việc cho trấu vào là làm tăng

độ xốp của môi trường, tạo nên những khoảng trống để không khí có thể lưu thông trong lòng môi trường

Bảng 4: Thành phần dinh dưỡng của cám (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004)

Thành phần dinh dưỡng Hàm lượng Thành phần dinh dưỡng Hàm lượng

6,0 ÷ 6,5 %

30 ÷ 32mg% 4,5 ÷ 4,6mg%

10 ÷ 14mg% 0,96 ÷ 1mg%

2.5.2.2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

Trong quá trình chuẩn bị môi trường, điều quan trọng nhất là tạo được độ ẩm thích hợp Độ ẩm thích hợp cho nhiều vi sinh vật khi nuôi cấy trong môi trường cám

là 60%W Độ ẩm vượt quá 60%W thường tạo điều kiện cho nhiều vi khuẩn phát triển, khi đó dễ xảy ra nhiễm vi sinh vật lạ Nếu độ ẩm < 60%W (thường 45 ÷ 50%W) thường gây hiện tượng tạo nhiều bào tử nấm sợi và như vậy thì enzyme thu được sẽ giảm hoạt tính rất mạnh

Sau khi chuẩn bị xong môi trường, ta tiến hành thanh trùng môi trường để tiêu diệt các vi sinh vật lạ nhiễm vào môi trường mà có thể ức chế sự phát triển của giống vi sinh vật mà ta sẽ nuôi cấy Thông thường, môi trường sẽ được thanh trùng bằng hơi nước nóng ở 121oC trong thời gian 15 ÷ 30 phút

Môi trường nuôi cấy sẽ được cho vào bình tam giác và tiến hành trộn giống

vi sinh vật vào khối môi trường sao cho thật đều Thời gian nuôi cấy nấm sợi để thu nhận enzyme vào khoảng 36 ÷ 60 giờ

2.5.4 Phương pháp nuôi cấy bề mặt

Để nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae sản xuất enzyme protease ta lựa

chọn phương pháp nuôi cấy bề mặt với môi trường rắn Phương pháp nuôi cấy bề

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 17

mặt là phương pháp tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường hay trên bề mặt vật liệu rắn, xốp, ẩm Thông thường, môi trường dạng rắn với nguyên liệu chính là bột cám mì, bã củ cải, bột bắp nghiền, hạt thóc nảy mầm, trấu

và bổ sung một số chất dinh dưỡng khác (amon sulfat, amon clorua, amon phosphat) Phương pháp này phát triển rất mạnh từ những năm 1970 đến nay Những ưu điểm cơ bản của phương pháp nuôi cấy bề mặt:

- Dễ thực hiện, quy trình công nghệ đơn giản

- Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với nuôi cấy chìm

- Sản phẩm enzyme thô sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản

- Khi bị nhiễm vi sinh vật lạ ta rất dễ dàng xử lý

2.5.4.1 Quy trình

Hình 10: Quy trình nuôi cấy vi sinh vật bằng phương pháp bề mặt

2.5.4.2 Thuyết minh quy trình

a Nguyên liệu

Đặc điểm của giống Aspergillus oryzae giàu các enzyme thủy phân nội bào

và ngoại bào (amylase, protease, pectinase…), ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột, gạo đã hết nhưng không được rửa sạch,

ở cặn bã bia, bã rượu, ở bã sắn… Chúng mọc và có khi phát triển thành lớp mốc, có

Thu nhận chế phẩm enzyme thô

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 18

màu sắc đen, vàng… Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành sợi mốc mới

b Kỹ thuật nuôi cấy

Sau khi đã trộn giống, các bình tam giác có chứa mẫu được đặt vào tủ ủ ở nhiệt độ 30oC vì nấm sợi phát triển thích hợp ở nhiệt độ là 28 ÷ 32oC Nếu nhiệt độ thấp quá hoặc cao quá đều ảnh hưởng không tốt đến sự phát triển của nấm sợi

Trong quá trình nuôi cấy, ta hoàn toàn không cần điều chỉnh pH Môi trường bán rắn là môi trường tĩnh nên sự thay đổi pH ở một vùng nào đó ít khi ảnh hưởng đến toàn bộ khối môi trường

Thời gian nuôi nấm sợi thu nhận enzyme vào khoảng 36 ÷ 60 giờ Điều này

còn phụ thuộc vào chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và điều kiện môi trường cũng

như phụ thuộc vào điệu kiện nuôi cấy

Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng phương pháp bề mặt này trải qua các giai đoạn sau:

- Giai đoạn 1: giai đoạn này kéo dài 10 ÷ 14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy, xảy ra sự trương đính bào tử, bắt đầu mọc nấm và hô hấp Ở giai đoạn này phòng nuôi cấy cần giữ nhiệt độ không dưới 28 ÷ 30oC để không kìm hãm sự phát triển ban đầu của chúng Trong giai đoạn này có thể xảy ra nhiều biến đổi:

 Nhiệt độ tăng rất chậm

 Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa

 Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi

 Khối môi trường còn rời rạc

 Enzyme mới bắt đầu được hình thành

- Giai đoạn 2: hệ sợi nấm bắt đầu phát triển nhanh, giai đoạn này kéo dài khoảng 14 ÷ 18 giờ Nấm mốc phát triển mạnh mẽ, sử dụng một lượng lớn các chất dinh dưỡng, hô hấp rất mạnh và lượng nhiệt thoát ra nhiều Trong giai đoạn này có những thay đổi cơ bản sau:

 Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất mạnh, có thể nhìn rõ được sợi nấm

 Môi trường được kết lại khá chặt

 Độ ẩm môi trường giảm dần

 Nhiệt độ môi trường sẽ tăng nhanh có thể đạt tới 40 ÷ 45oC

 Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh, do sự đồng hóa mạnh của nấm sợi

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 19

 Các enzyme được hình thành và enzyme nào có cơ chất cảm ứng trội hơn sẽ được tạo ra nhiều hơn

 Lượng oxy trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng 29 ÷ 30oC là tốt nhất

- Giai đoạn 3: giai đoạn này kéo dài khoảng 10 ÷ 20 giờ Ở giai đoạn này

có một số thay đổi cơ bản như sau:

 Quá trình trao đổi chất sẽ yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm lại

 Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí môi trường xuống còn 20 ÷ 25 thể tích không khí/thể tích phòng nuôi cấy/1 giờ Nhiệt độ nuôi cấy duy trì ở 30oC Trong giai đoạn này, bào tử được hình thành nhiều do đó lượng enzyme sẽ giảm Chính vì thế việc xác định thời điểm cần thiết

để thu nhận enzyme rất cần thiết

Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzyme Chế phẩm này được gọi là chế phẩm enzyme thô (vì ngoài thành phần enzyme ra chúng còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường và nước có trong môi trường) Người ta thường sấy khô chế phẩm enzyme đến một độ ẩm thấp để đảm bảo cho chế phẩm enzyme thô không mất hoạt tính nhanh

2.5.5 Thu nhận chế phẩm enzyme protease thô

Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzyme Chế phẩm này được gọi là chế phẩm enzyme thô (vì ngoài thành phần enzyme ra chúng còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường và nước có trong môi trường)

Tùy theo mục đích sử dụng, ta có thể dùng chế phẩm thô này ngay mà không cần qua quá trình tinh sạch Trong những trường hợp cần thiết khác, ta phải tiến hành làm sạch enzyme Khi enzyme được tách hết nước, sinh khối vi sinh vật và thành phần môi trường, chúng ở dạng tinh thể, ta thu được chế phẩm enzyme sạch Chế phẩm enzyme này còn được gọi là chế phẩm enzyme tinh khiết

Để đảm bảo cho chế phẩm enzyme thô không mất hoạt tính nhanh, người ta thường sấy khô chế phẩm enzyme đến một độ ẩm thấp Độ ẩm cần đạt sau khi quá trình sấy kết thúc là nhỏ hơn 10%W Để đảm bảo hoạt tính enzyme không thay đổi, người ta thường sấy enzyme ở nhiệt độ 38 ÷ 40oC Ở nhiệt độ này enzyme ít bị biến đổi Nếu ta sấy ở nhiệt độ cao quá 40oC enzyme rất dễ bị biến tính Do đó, điều kiện nhiệt độ trong quá trình sấy phải được thực hiện tuyệt đối chính xác

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 20

2.6 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME PROTEASE

2.6.1 Độ ẩm môi trường

Độ ẩm của môi trường tốt nhất cho sự hình thành enzyme của nấm mốc là 55

÷ 58% Độ ẩm môi trường thích hợp cho sự hình thành bào tử khoảng 45% Cần giữ cho độ ẩm môi trường không bị giảm trong quá trình phát triển của nấm mốc

2.6.2 Ảnh hưởng của không khí

Aspergillus oryzae là sinh vật hoàn toàn hiếu khí, chỉ phát triển bình thường

khi trong môi trường có đầy đủ O2 Để đáp ứng điều kiện nuôi cấy này môi trường phải xốp, rải thành lớp không dày quá 2,5 ÷ 3,0cm, phòng nuôi cấy phải thoáng

2.6.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH môi trường

Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển và hình thành enzyme của Aspergillus oryzae là khoảng 28 ÷ 32oC Nhiệt độ do nấm mốc tỏa ra môi trường có thể lên đến

40oC hoặc cao hơn Cần giữ cho nhiệt độ môi trường không xuống dưới 27oC và không quá 36oC

Thích hợp cho Aspergillus oryzae phát triển là môi trường acid yếu 5,5 ÷ 6,5

Các môi trường tự nhiên từ cám, đậu, ngô thường có sẵn pH ở khoảng này nên không cần điều chỉnh Đôi khi khả năng sinh bào tử của nấm mốc bị yếu hoặc mất hẳn Để khôi phục khả năng này có thể nuôi nấm mốc trong ánh sáng khuếch tán trong một vài thế hệ

2.6.4 Thời gian nuôi cấy

Hầu hết các chủng Aspergillus oryzae có hoạt động cực đại của amylase ở

giờ thứ 30 ÷ 36, rồi sau đó cực đại của protease ở giờ thứ 36 ÷ 42 Thời gian nuôi mốc giống thường hết 60 ÷ 70 giờ

2.7 ỨNG DỤNG CỦA ENZYME PROTEASE

2.7.1 Ứng dụng trong chế biến thực phẩm

2.7.1.1 Trong công nghiệp thịt

Trong công nghiệp thịt có sử dụng chế phẩm protease để làm mềm thịt Ngoài papayin có thể dùng chế phẩm protease của vi sinh vật để thủy phân một phần nào đó các protein tham gia trong thành phần của thịt Kết quả là chất lượng của các loại thịt được tăng cao, có thể chuyển thịt loại thấp thành thịt có phẩm chất cao Không những thế thời gian chín của thịt sẽ rút xuống nhiều lần

2.7.1.2 Trong công nghiệp sữa

Protease không những có khả năng phân ly protein mà còn có khả năng làm đông tụ sữa Tính chất của enzyme cũng như của pepsin từ lâu đã được dùng trong

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 21

công nghiệp thực phẩm Protease của nấm mốc và vi khuẩn cũng thể hiện khả năng

đó Tuy nhiên tất cả protease của vi sinh vật đều khác với renin của động vật ở chỗ chúng không những làm đông tụ được sữa mà còn có thể phân hủy sâu casein, do đó

có ảnh hưởng xấu đến chất lượng phomat Bởi vậy trong quá trình làm phomat, renin vẫn chiếm một vị trí đặc biệt trong các protease khác Dưới tác dụng của renin, casein của sữa sẽ đông tụ thành một khối đặc không hòa tan và thu hút vào đó hầu như toàn bộ chất béo có trong sữa Từ đây, dưới ảnh hưởng của vi khuẩn lactic

sẽ tạo thành phomat bền vững có chứa các chất dinh dưỡng quý giá hơn và có tính chất cảm quan ưu việt hơn Hương vị của phomat sau quá trình chín có liên quan mật thiết với sự tích tụ các peptid và acid amin Như vậy renin còn có vai trò dẫn động trong quá trình chín của phomat nữa

2.7.2 Ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác

2.7.2.1 Trong công nghiệp da

Protease của vi sinh vật cũng có tầm quan trọng trên hai quá trình: làm mềm

và tách lông Về mặt này, chế phẩm protease như là một phương tiện có hiệu quả để hoàn thiện kĩ thuật chế biến da Chúng ta đều biết chất quan trọng nhất của da là collagen Phân tử của nó gồm những acid amin kết lại với nhau thành mạch dài Dưới tác dụng của protease, các chất nhờn bị tách ra và một số liên kết trong sợi collagen bị phá hủy Kết quả là da thu được có độ mềm nhất định và trong quá trình thuộc da tính chất này lại được củng cố thêm

2.7.2.2 Trong sản xuất tơ tằm

Sợi thu được khi kéo ở kén ra thường có chứa 30% xerixin Muốn tạc xerixin thì phải nấu tơ trong dung dịch xà phòng trong thời gian từ 1,5 ÷ 2 giờ Chỉ sau khi

có sự gia công này, tơ mới bắt đầu kéo chỉ Một lượng nhỏ xerixin nằm lại ở trên lụa sẽ làm giảm độ đàn hồi của lụa, làm cho lụa bắt màu không đồng đều và khó trang trí trên lụa Để tách lượng xerixin còn lại đó người ta thường dùng chế phẩm protease từ nấm mốc và đặc biệt từ vi khuẩn

2.7.2.3 Trong hương phẩm và mỹ phẩm

Tác dụng của protease trong kem, các biểu bì của da đã chết sẽ được tách ra,

da non và mới sẽ xuất hiện trên về mặt, đồng thời sự phát triển của lông (tóc) cũng

bị chặn lại

2.7.2.4 Trong y học

Các chế phẩm protease cũng được sử dụng để sản xuất các môi trường dinh dưỡng hỗn hợp có protein dùng trong nuôi cấy vi khuẩn và các vi sinh vật khác Ngoài ra người ta còn dùng các chế phẩm protease để cô đặc và tinh chế các huyết thanh để chữa bệnh (huyết thanh miễn dịch)

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 22

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM

3.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện

Địa điểm: phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ

Thời gian: từ ngày 30/01/2012 đến ngày 28/04/2012

3.1.2 Vật liệu

Cám

Trấu

Cơ chất (gelatine)

Dung dịch acid protein (da cá ngâm acid acetic trong 24 giờ)

3.1.3 Đối tượng nghiên cứu

Nấm sợi Aspergillus oryzae (chủng Aspergillus sp.) lấy từ Viện Nghiên cứu

và Phát triển Công nghệ Sinh học trường Đại học Cần Thơ

3.1.4 Hoá chất thí nghiệm

Gelatine (Trung Quốc)

Casein (Trung Quốc)

Acid citric 0,1M (C6H8O7.H20), (Trung Quốc)

Trinatri citrat 0,1M (C6H5O7Na3.2H20), (Trung Quốc)

Disodium hydro phosphate (Na2HPO4.12H2O), (Trung Quốc)

L – Cysteine hydrochlorid – monohyrate (Merck)

Acid hydrochlorid 0,1N (HCl)

Trichloroacetic acid (TCA), (Trung Quốc)

L – Tyrosine (C9H11NO3), (Merck)

Coomassie Brilliant Blue G – 250

Bovine Serum Albumin (BSA)

Cồn 96o

Acid phosporic (H3PO4), (Trung Quốc)

Natri hydroxit (NaOH), (Trung Quốc)

Acid acetic (CH3COOH), (Trung Quốc)

Butanol (CH3(CH2)3OH), (Trung Quốc)