Khảo sát điều kiện nuôi cấy nấm mốc aspergillus oryzae để sản xuất acid kojic

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG LÊ THẢO NGUYÊN KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY NẤM MỐC Aspergillus oryzae ĐỂ SẢN XUẤT ACID KOJIC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2020 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG LÊ THẢO NGUYÊN Mà SINH VIÊN: 1501360 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY NẤM MỐC Aspergillus oryzae ĐỂ SẢN XUẤT ACID KOJIC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Lê Ngọc Khánh Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược HÀ NỘI - 2020 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới ThS Lê Ngọc Khánh – người thầy truyền dạy cho học quý báu lòng yêu khoa học từ ngày đầu nghiên cứu tới nay, hết lòng hướng dẫn, tận tâm bảo giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Đàm Thanh Xuân cho lời khuyên bổ ích, nhiệt tình hướng dẫn, giải đáp thắc mắc giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo anh, chị kỹ thuật viên Bộ môn Công nghiệp Dược, đặc biệt tổ Công nghệ Sinh học bảo, giúp đỡ tơi giải khó khăn tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu, phịng ban tồn thể thầy giáo trường Đại học Dược Hà Nội dạy dỗ, tạo môi trường tốt cho học tập nghiên cứu trường suốt năm Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân bạn bè bên, tiếp cho động lực, giúp đỡ quãng đường học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 22 tháng 06 năm 2020 Sinh viên Hoàng Lê Thảo Nguyên MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Acid kojic Đặc điểm Ứng dụng .2 Phương pháp sản xuất acid kojic 1.2 Aspergillus oryzae Chi Aspergillus Loài Aspergillus oryzae 1.3 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến khả sinh acid kojic nấm mốc Aspergillus oryzae Ảnh hưởng thành phần môi trường lên men Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy 10 1.4 Một số nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến khả sinh acid kojic nấm mốc Aspergillus oryzae 11 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 13 Nguyên vật liệu 13 Thiết bị sử dụng 14 2.2 Nội dung nghiên cứu 14 Khảo sát ảnh hưởng thành phần môi trường lên men đến khả sinh acid kojic nấm mốc Aspergillus oryzae .14 Khảo sát ảnh hưởng pH môi trường lên men đến khả sinh acid kojic nấm mốc Aspergillus oryzae 14 2.3 Phương pháp nghiên cứu 14 Phương pháp giữ giống .14 Phương pháp nhân giống 14 Phương pháp lên men thu acid kojic 15 Phương pháp kết tinh 15 Phương pháp định tính thuốc thử FeCl3 5% 15 Phương pháp Schoorl - Regenbogen định lượng đường khử 15 Phương pháp định lượng đường saccarose tinh bột 16 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 17 3.1 Khảo sát ảnh hưởng thành phần môi trường lên men đến khả sinh acid kojic nấm mốc Aspergillus oryzae 17 Khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon môi trường lên men đến khả sinh acid kojic Aspergillus oryzae 17 Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitơ môi trường lên men đến khả sinh acid kojic Aspergillus oryzae 23 3.2 Khảo sát ảnh hưởng pH môi trường lên men đến khả sinh acid kojic nấm mốc Aspergillus oryzae 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT A oryzae Aspergillus oryzae A albus Aspergillus albus A candidus Aspergillus candidus A nidulans Aspergillus nidulans A flavus Aspergillus flavus A niger Aspergillus niger A fumigatus Aspergillus fumigatus A paraticus Aspergillus paraticus DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các thành phần môi trường lên men để sản xuất acid kojic từ Aspergillus oryzae Bảng 3.1 Môi trường lên men thu acid kojic từ trình lên men A oryzae với nguồn carbon khác 18 Bảng 3.2 Khả sinh acid kojic Aspergillus oryzae thay đổi nguồn carbon môi trường lên men 20 Bảng 3.3 Môi trường lên men thu acid kojic từ trình lên men A oryzae với nguồn nitơ khác 24 Bảng 3.4 Khả sinh acid kojic Aspergillus oryzae thay đổi nguồn nitơ môi trường lên men .26 Bảng 3.5 Môi trường lên men thu acid kojic từ trình lên men A oryzae với điều kiện pH khác 29 Bảng 3.6 Khả sinh acid kojic Aspergillus oryzae thay đổi điều kiện pH môi trường lên men .31 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Quá trình hình thành acid kojic từ glucose Hình 1.2 Quá trình hình thành di-O-acetylkojic acid từ tetra-O-acetyl-α-Dglucopyranosyl bromid phương pháp tổng hợp hóa học Hình 1.3 Bào tử Aspergillus oryzae kính hiển vi quang học (a), (b) (mơi trường Czapek) kính hiển vi điện tử (c) Hình 3.1 Hình ảnh sinh khối Aspergillus oryzae với môi trường nuôi cấy AG, AS, AM, AT sau 12 ngày lên men 19 Hình 3.2 Hình ảnh acid kojic kết tinh từ dịch lên men A oryzae môi trường nuôi cấy AG (a) AS (b) .19 Hình 3.3 Hình ảnh phản ứng acid kojic (hòa tan ethanol) với sắt (III) clorid 3% 20 Hình 3.4 Biểu đồ so sánh hiệu suất sinh acid kojic Aspergillus oryzae thay đổi nguồn carbon môi trường .21 Hình 3.5 Biểu đồ so sánh tỉ lệ đường tiêu thụ Aspergillus oryzae thay đổi nguồn carbon môi trường lên men 22 Hình 3.6 Hình ảnh sinh khối Aspergillus oryzae với môi trường nuôi cấy GP, GC, GN, GNC sau 12 ngày lên men .25 Hình 3.7 Hình ảnh acid kojic kết tinh từ dịch lên men A oryzae môi trường nuôi cấy GC (a) GP (b) .25 Hình 3.8 Biểu đồ so sánh hiệu suất sinh acid kojic Aspergillus oryzae thay đổi nguồn nitơ môi trường 27 Hình 3.9 Biểu đồ so sánh tỉ lệ glucose tiêu thụ Aspergillus oryzae thay đổi nguồn nitơ môi trường lên men 28 Hình 3.10 Hình ảnh sinh khối Aspergillus oryzae với mơi trường nuôi cấy GP1, GP2, GP3 sau 12 ngày lên men .30 Hình 3.11 Hình ảnh acid kojic kết tinh từ dịch lên men A oryzae môi trường nuôi cấy GP1 (a) GP2 (b) 31 Hình 3.12 Biểu đồ so sánh hiệu suất sinh acid kojic Aspergillus oryzae thay đổi điều kiện pH môi trường 32 Hình 3.13 Biểu đồ so sánh tỉ lệ glucose tiêu thụ Aspergillus oryzae môi trường lên men có điều kiện pH khác 33 ĐẶT VẤN ĐỀ Acid kojic acid hữu chất chuyển hóa thứ cấp, tiết từ chủng vi nấm thuộc chi Penicilium, Mucor, Aspergillus… vi khuẩn nhóm Gluconoacetobacter [17], [22] Trong đó, qua nhiều nghiên cứu Aspergillus oryzae cho thấy tiềm lớn sản xuất sinh tổng hợp acid kojic, đồng thời không sinh độc tố aflatoxin [32], [35], [46] Acid kojic ứng dụng nhiều lĩnh vực: y học, công nghiệp, thực phẩm, nơng nghiệp, cơng nghiệp hóa chất đặc biệt công nghiệp mỹ phẩm [14], [16], [18], [36] Thị trường acid kojic phát triển từ năm 1955 với nỗ lực sản xuất thuộc công ty Pfizer (Mỹ) [36] Mặc dù sản xuất ứng dụng quy mô công nghiệp nỗ lực cải thiện trình sản xuất acid kojic tiếp tục nghiên cứu cách rộng rãi Hai hướng nghiên cứu để nâng cao hiệu suất trình sản xuất acid kojic cải thiện chủng giống tối ưu trình lên men [18], [36] Hiện nay, Việt Nam, nghiên cứu vấn đề chưa công bố rộng rãi Với lý đồng thời mong muốn góp phần vào nghiên cứu cải thiện khả sinh acid kojic, đề tài “Khảo sát điều kiện nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae để sản xuất acid kojic” tiến hành với mục tiêu sau: Khảo sát ảnh hưởng thành phần môi trường lên men đến khả sinh acid kojic nấm mốc Aspergillus oryzae Khảo sát ảnh hưởng pH môi trường lên men đến khả sinh acid kojic nấm mốc Aspergillus oryzae CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Acid kojic Đặc điểm Công thức tổng quát: C6H6O4 Tên khoa học: 5-hydroxy-2-(hydroxymethyl)pyran-4-on Thành phần: C 50,70%; H 4,23%; O 45,07% Khối lượng phân tử: 142,11 g/mol Nhiệt độ nóng chảy: dao động từ 150 – 160℃ [10], [30] Công thức cấu tạo: OH O HO O Acid kojic điều kiện thường chất rắn, kết tinh dạng tinh thể hình que, lăng trụ khơng màu, khơng mùi, tan nước (43,85 g/L), tan tốt ethanol, aceton, ethyl ether, không tan benzen, chloroform [16], [18], [36] Acid kojic ℽ-pyron đa chức có tính acid yếu Nó phản ứng vị trí vịng tạo số sản phẩm có giá trị cơng nghiệp hóa học, ví dụ chelat kim loại, pyridon, pyridin, ether, azodyes, mannich base, sản phẩm cyanoethyl hóa [27], [47] Ở vị trí cacbon số 5, nhóm hydroxyl hoạt động acid yếu, có khả tạo thành muối với số kim loại natri, kẽm, đồng, canxi, niken cadimi [18], [36] Một phản ứng đặc trưng acid kojic tạo thành phức màu đỏ sáng với ion Fe3+ [13] Ứng dụng  Trong y học Acid kojic dẫn xuất có tính chất kháng sinh, chống lại vi khuẩn Gram âm vi khuẩn Gram dương Tại nồng độ lớn 0,5%, acid kojic có khả ức chế phát triển vi khuẩn, chống lại trực khuẩn lao điều kiện in Lượng acid kojic thu môi trường lên men sử dụng pepton làm nguồn nitơ lớn (0,49 g), khoảng 1,9 lần môi trường lên men sử dụng cao nấm men (0,26 g) (bảng 3.4) Bảng 3.4 Khả sinh acid kojic Aspergillus oryzae thay đổi nguồn nitơ môi trường lên men Môi Lượng acid kojic trường thu (g) lên men Lượng glucose tiêu thụ (g) Tỉ lệ glucose tiêu thụ (%) Hiệu suất sinh acid kojic (%) GP 0,49 7,30 77,33 6,71 GC 0,26 6,24 68,12 4,16 GN 3,04 33,41 GNC 3,52 38,14 Khi so sánh hiệu suất sinh acid kojic (tính theo lượng glucose tiêu thụ) mơi trường (hình 3.8), kết cho thấy môi trường lên men GP cho hiệu suất cao (6,71%), khoảng 1,6 lần môi trường lên men GC (4,16%) Với môi trường lên men GN GNC, hiệu suất sinh acid kojic Điều thể môi trường lên men sử dụng (NH4)2SO4 (NH4)2SO4 kết hợp với cao nấm men (2:1) làm nguồn nitơ không phù hợp cho mục đích sinh tổng hợp acid kojic Mơi trường lên men sử dụng pepton làm nguồn nitơ môi trường lên men phù hợp mục đích sinh tổng hợp acid kojic, sau đến mơi trường lên men dùng cao nấm men Nguyên nhân pepton, cao nấm men có chứa acid amin tự acid amin góp phần thúc đẩy cho phát triển enzym liên quan đến trình sinh tổng hợp acid kojic như: glucose-6-phosphat dehydrogenase, hexokinase, gluconat dehydrogenase [10], [11] Hơn nữa, việc sử dụng NH4+ làm nguồn carbon gây ức chế enzym liên quan đến trình sinh tổng hợp acid kojic [39] Ngồi ra, pepton cao nấm men có chứa acid amin tự khác nên có khác biệt lượng acid kojic thu môi trường lên men sử dụng pepton so với môi trường lên men sử dụng cao nấm men làm nguồn nitơ 26 Hiệu suất sinh acid kojic (%) 10 6,71 4,16 0 GN GNC GP GC Môi trường lên men Hình 3.8 Biểu đồ so sánh hiệu suất sinh acid kojic Aspergillus oryzae thay đổi nguồn nitơ mơi trường Ngồi ra, số liệu lượng glucose tiêu thụ cho thấy môi trường lên men sử dụng pepton cao nấm men có lượng glucose tiêu thụ 7,30 g 6,24 g, nhiều đáng kể so với môi trường sử dụng (NH4)2SO4 (NH4)2SO4 kết hợp với cao nấm men (2:1) (3,04 g 3,52 g) Khi so sánh tỉ lệ glucose tiêu thụ mơi trường (hình 3.9), kết cho thấy mơi trường lên men sử dụng pepton có tỉ lệ glucose tiêu thụ đạt giá trị cao (77,33%), nhiều 1,14 lần so với môi trường lên men sử dụng cao nấm men (68,12%); nhiều khoảng lần so với môi trường lên men sử dụng (NH4)2SO4 hay (NH4)2SO4 kết hợp với cao nấm men (2:1) Do đó, nhận thấy kết lượng glucose tiêu thụ tỉ lệ glucose tiêu thụ phù hợp với kết lượng acid kojic sinh khối thu từ trình lên men Asperigillus oryzae môi trường chứa nguồn nitơ khác 27 Tỉ lệ glucose tiêu thụ (%) 100 77,33 80 68,12 60 40 33,41 38,14 20 GC GP GN GNC Mơi trường lên men Hình 3.9 Biểu đồ so sánh tỉ lệ glucose tiêu thụ Aspergillus oryzae thay đổi nguồn nitơ môi trường lên men Theo Kitada cộng (1967) với nghiên cứu trình lên men Aspergillus oryzae để sản xuất acid kojic, sử dụng cao nấm men pepton làm nguồn nitơ lượng tế bào acid kojic thu nhiều nhất, sử dụng nguồn nitơ vơ phát triển vi sinh vật lượng acid kojic thu thấp [30] Trong nghiên cứu, tác giả cho pepton nguồn nitơ thích hợp cho q trình lên men sinh tổng hợp acid kojic Mohamad báo cáo môi trường lên men chứa 100 g/L glucose (đóng vai trị nguồn carbon) pepton với nồng độ 1-5 g/L cao nấm men với nồng độ 0,5-2,5 g/L (đóng vai trị nguồn nitơ) sử dụng nhiều cho trình lên men sản xuất acid kojic [36] Như vậy, kết đạt đề tài phù hợp với kết nghiên cứu trước Sau q trình thực nghiệm, đề tài lựa chọn nguồn nitơ thích hợp cho trình lên men sinh acid kojic Aspergillus oryzae pepton 28 3.2 Khảo sát ảnh hưởng pH môi trường lên men đến khả sinh acid kojic nấm mốc Aspergillus oryzae  Mục tiêu: Đánh giá khả sinh acid kojic Aspergillus oryzae mơi trường lên men có điều kiện pH mơi trường lên men khác lựa chọn điều kiện pH thích hợp để sản xuất acid kojic  Tiến hành: Nhân giống Aspergillus oryzae bình nón 250 ml có chứa 50 ml môi trường với môi trường nhân giống có điều kiện pH khác bảng 3.5 đây, điều kiện hơ hấp hiếu khí (tốc độ lắc 150 vòng/ phút) 30oC 2-3 ngày Kết thúc thời gian nhân giống, ly tâm thu lấy sinh khối Lấy sinh khối từ môi trường nhân giống, lên men Aspergillus oryzae bình nón 250 ml có chứa 100 ml môi trường với môi trường lên men khác GP1, GP2, GP3; điều kiện hô hấp hiếu khí (tốc độ lắc 150 vịng/ phút) 30oC 12 ngày Trong đó: GP1 mơi trường lên men khơng có điều chỉnh pH q trình lên men; GP2 môi trường lên men giữ pH ban đầu 5,5, sau 2-3 ngày điều chỉnh pH = 2,5 kết thúc trình lên men; GP3 môi trường lên men điều chỉnh pH = 2,5 từ đầu kết thúc q trình lên men Ba mơi trường sử dụng để so sánh khả sinh tổng hợp acid kojic từ trình lên men Aspergillus oryzae thay đổi điều kiện pH môi trường lên men Kết thúc thời gian lên men, tiến hành tách chiết tinh chế thu acid kojic, đồng thời định lượng đường glucose mẫu dịch lọc theo phương pháp 2.3.6 Bảng 3.5 Môi trường lên men thu acid kojic từ trình lên men A oryzae với điều kiện pH khác Khối lượng (g/100ml) Thành phần GP1 GP2 GP3 Glucose 10,0 10,0 10,0 Pepton 0,3 0,3 0,3 KH2PO4 0,1 0,1 0,1 MgSO4.7H2O 0,05 0,05 0,05 Vừa đủ Vừa đủ Vừa đủ 5,5 5,5 (điều chỉnh 2,5 sau 2-3 ngày) 2,5 Nước RO pH (điều chỉnh HCl 10%) 29  Kết thực nghiệm bàn luận: Mơi trường GP1 GP2 thu có cảm quan dịch lên men trong, hạt sinh khối trắng, hình cầu tương đối đồng đều, thành bình có vịng sinh khối mỏng Tuy nhiên môi trường GP3 thu có dịch lên men đục, hạt sinh khối nhỏ li ti nhiều so với mơi trường GP1 GP2 (hình 3.10) Như vậy, mơi trường lên men không điều chỉnh pH môi trường lên men với điều kiện pH điều chỉnh 5,5 2-3 ngày đầu lên men, sau cố định 2,5 cuối trình lên men, nấm mốc Aspergillus oryzae có khả sinh trưởng, phát triển tốt môi trường lên men cố định pH = 2,5 từ đầu cuối trình lên men Hình 3.10 Hình ảnh sinh khối Aspergillus oryzae với môi trường nuôi cấy GP1, GP2, GP3 sau 12 ngày lên men 30 Sau kết tinh, nhận thấy mơi trường lên men GP1 GP2 có khả tạo sản phẩm acid kojic (hình 3.11), cịn môi trường lên men GP3 sau chiết không thu sản phẩm (a) (b) Hình 3.11 Hình ảnh acid kojic kết tinh từ dịch lên men A oryzae môi trường nuôi cấy GP1 (a) GP2 (b) Lượng acid kojic thu môi trường lên men GP2 cao (0,59 g/100ml), khoảng 1,3 lần môi trường lên men GP1 (bảng 3.6) Bảng 3.6 Khả sinh acid kojic Aspergillus oryzae thay đổi điều kiện pH môi trường lên men Môi trường lên men Lượng acid kojic thu (g) GP1 0,46 7,30 77,33 6,30 GP2 0,59 7,66 82,99 7,70 GP3 2,37 26,04 Lượng glucose Tỉ lệ glucose tiêu tiêu thụ (g) thụ (%) Hiệu suất sinh acid kojic (%) Khi so sánh hiệu suất sinh acid kojic (tính theo lượng glucose tiêu thụ) mơi trường (hình 3.12), kết cho thấy môi trường lên men GP2 cho hiệu suất cao (7,70%), khoảng 1,2 lần môi trường lên men GP1 (6,30%) Với môi trường lên 31 men GP3 hiệu suất Điều thể mơi trường lên men có điều kiện pH cố định 2,5 từ đầu khơng thích hợp cho q trình sinh tổng hợp acid kojic Cịn với điều kiện lên men giữ pH = 5,5 2-3 ngày đầu lên men, sau cố định pH = 2,5 cuối q trình lên men thích hợp cho q trình sinh tổng hợp acid kojic Nguyên nhân 2-3 ngày đầu giai đoạn tăng trưởng Aspergillus oryzae, mà Aspergillus oryzae phát triển tốt pH 5,5-6 [4], [40] Vì giữ pH = 5,5 2-3 ngày đầu lên men tạo điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển, sản xuất enzym cần thiết cho q trình chuyển hóa glucose thành acid kojic Sau sang giai đoạn sản xuất acid kojic, pH = 2,5 thích hợp cho hoạt động tính ổn định enzym cần thiết cho q trình sinh tổng hợp acid kojic [40] Ở mơi trường lên men cố định pH = 2,5 từ đầu làm ức chế phát triển Aspergillus oryzae [4], gây ảnh hưởng đến việc sản xuất enzym cần thiết cho trình sản xuất acid k ojic Do với điều kiện lên men có pH điều chỉnh 5,5 2-3 ngày đầu lên men, sau cố định 2,5 cuối q trình lên men thích hợp cho trình lên men Aspergillus oryzae để sản xuất acid kojic Hiệu suất sinh acid kojic (%) 10 7,70 6,30 0 GP1 GP2 Môi trường lên men GP3 Hình 3.12 Biểu đồ so sánh hiệu suất sinh acid kojic Aspergillus oryzae thay đổi điều kiện pH mơi trường 32 Ngồi ra, số liệu lượng glucose tiêu thụ cho thấy môi trường lên men GP1 GP2 có lượng glucose tiêu thụ 7,66 g 7,30 g, nhiều đáng kể so với môi trường lên men GP3 (2,37 g) Khi so sánh tỉ lệ glucose tiêu thụ mơi trường (hình 3.13), kết cho thấy mơi trường lên men GP2 có tỉ lệ glucose tiêu thụ đạt giá trị cao (82,99%), nhiều khoảng 1,1 lần so với môi trường lên men GP1; nhiều khoảng 3,2 lần so với môi trường lên men GP3 Nguyên nhân lên men Aspergillus oryzae điều kiện pH thích hợp, glucose vừa tiêu thụ cho trình cung cấp lượng cho phát triển sinh vật trình lên men, vừa tiêu thụ chất cho trình sinh tổng hợp acid kojic, nên tỉ lệ glucose tiêu thụ môi trường GP2 nhiều Do đó, nhận thấy kết lượng glucose tiêu thụ tỉ lệ glucose tiêu thụ phù hợp với kết lượng acid kojic sinh khối thu từ trình lên men Asperigillus oryzae mơi trường có điều kiện pH khác Tỉ lệ glucose tiêu thụ (%) 100 82,99 80 77,33 60 40 26,04 20 GP1 GP2 GP3 Môi trường lên men Hình 3.13 Biểu đồ so sánh tỉ lệ glucose tiêu thụ Aspergillus oryzae môi trường lên men có điều kiện pH khác 33 Theo Ammar cộng với nghiên cứu cải thiện khả sản xuất acid kojic từ trình lên men chủng Aspergillus oryzae HAk2, điều chỉnh pH ban đầu mơi trường lượng acid kojic thu không đáng kể (0,0071 ± 0.002g /100 ml môi trường lên men) [8] Hassan cộng pH tối ưu cho trình sinh tổng hợp acid kojic từ lên men chủng Aspergillus oryzae var effusus NRC14 sử dụng glucose làm nguồn carbon amoni nitrat làm nguồn nitơ, pH lại tối ưu cho trình phát triển chủng vi sinh vật [24] Ngoài ra, Katagiri Kitahara (1933) nhận thấy Aspergillus oryzae phát triển tốt pH ban đầu 5, nhiên pH 2,4 lại thích hợp cho trình sản xuất acid kojic [28] Điều có nghĩa pH tối ưu để tổng hợp acid kojic khác với pH tối ưu cho phát triển chủng nấm sản xuất acid kojic Jignesh Chaudhary, Rosfarizan cộng nghiên cứu điều kiện lên men để thu nhiều acid kojic điều chỉnh pH từ 4,5 đến giai đoạn tăng trưởng, sau cố định pH mức từ đến giai đoạn sản xuất [18], [38] Như vậy, kết đạt đề tài phù hợp với kết nghiên cứu trước Sau trình thực nghiệm, đề tài lựa chọn điều kiện pH thích hợp cho q trình lên men sinh acid kojic Aspergillus oryzae điều chỉnh pH 5,5 23 ngày đầu lên men, sau cố định 2,5 cuối q trình lên men 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau thời gian thực hiện, đề tài hoàn thành mục tiêu đạt kết sau: 1.1 Đề tài khảo sát ảnh hưởng thành phần môi trường lên men đến khả sinh acid kojic nấm mốc Aspergillus oryzae - Tại điều kiện nghiên cứu đề tài, lựa chọn glucose 10% nguồn carbon thích hợp cho q trình lên men Aspergillus oryzae để sản xuất acid kojic - Tại điều kiện nghiên cứu đề tài, lựa chọn pepton 0,3% nguồn nitơ thích hợp cho q trình lên men Aspergillus oryzae để sản xuất acid kojic 1.2 Đề tài khảo sát ảnh hưởng pH môi trường lên men đến khả sinh acid kojic nấm mốc Aspergillus oryzae Tại điều kiện nghiên cứu đề tài, điều kiện pH ni cấy thích hợp cho q trình lên men Aspergillus oryzae để sản xuất acid kojic giữ pH môi trường ban đầu 5,5 2-3 ngày đầu, sau cố định pH 2,5 kết thúc trình lên men Kiến nghị Do thời gian nghiên cứu cịn hạn chế đồng thời để có tính ứng dụng thực tế, chúng tơi xin đưa số đề xuất sau: 2.1 Tiếp tục nghiên cứu khả sinh tổng hợp acid kojic nấm mốc Aspergillus oryzae với kỹ thuật nuôi cấy khác 2.2 Tăng quy mô nghiên cứu, khảo sát lựa chọn tỉ lệ C/N môi trường lên men thích hợp ni cấy Aspergillus oryzae để tiếp tục hồn thiện điều kiện ni cấy tối ưu quy mơ phịng thí nghiệm 35 Tài liệu tham khảo Tài liệu tiếng Việt Cao Ngọc Điệp, Nguyễn Văn Thành (2009), Giáo trình mơn Nấm học, Trường Đại học Cần Thơ, tr 7-19 Phạm Văn Hùng (1975), Phân loại nấm mốc Aspergillus số điểm miền Bắc Việt Nam số ứng dụng thực tiễn, Luận án cấp II, Trường Đại học Tổng hợp Hà Nội, tr 3-32 Nguyễn Thị Huyền (2018), Khảo sát khả sinh aicd kojic nấm mốc Aspergillus oryzae, Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr 2933 Lê Thị Phương Lan (2011), Bước đầu tìm hiểu nghiên cứu tổng quan quy trình sản xuất nước tương nấm mốc Aspergillus oryzae, Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Công nghệ thành phố Hồ Chí Minh, tr 17-23 Nguyễn Đình Luyện (2015), Thực tập kỹ thuật sản xuất dược phẩm, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr 44-56 Trần Thị Thanh Mẫn, Trần Thị Minh Hương (2010), Giáo trình phân tích thực phẩm, Trường Cao đẳng Lương thực - Thực phẩm, tr 117-118 Trương Phương, Trần Cát Đông, Nguyễn Tri Thành (2013), “Nghiên cứu điều chế kojic dipalmitat Phần 1: Sàng lọc chủng Aspergillus oryzae nghiên cứu điều kiện lên men thu nhận acid kojic”, Tạp chí Dược học, 8, tr 35-41 Tài liệu nước Ammar H A, Ezzat S M, Houseny A M (2017), “Improved production of kojic acid by mutagenesis of Aspergillus flavus HAk1 and Aspergillus oryzae HAk2 and their potential antioxidant activity”, Biotech, 7(5), pp 4-6 Arnstein H R V, Bentley R (1953), “The biosynthesis of kojic acid Production from [1-14C] and [3: 4-14C2] glucose and [2-14C]-1: 3- dihydroxyacetone”, Biochemical Journal, 54(3), pp 493 10 Arnstein H R V, Bentley R (1953), “The biosynthesis of kojic acid The incorporation of labelled small molecules into kojic acid”, Biochemical Journal, 54(3), pp 517 11 Basappa S C, Sreenivasamurthy V, Parpia H A B (1970), “Aflatoxin and kojic acid production by resting cells of Aspergillus flavus Link”, Microbiology, 61(1), pp 81-86 12 Beard R L, Walton G S (1969), “Kojic acid as an insecticidal mycotoxin”, Journal of Invertebrate Pathology, 14(1), pp 53-59 13 Bentley R (1957), “Preparation and analysis of Kojic acid”, Mechods Enymol, 3, pp 107-112 14 Bentley R (2006), “From miso, sake and shoyu to cosmetics: a century of science for kojic acid”, Natural product reports, 23(6), pp 1046-1062 15 Beélik A (1956), “Kojic acid”, Advances in carbohydrate chemistry, Vol 11, pp 149-164 16 Brtko J, Rondahl L, Fickova M, Hudecova D, Eybl V, Uher M (2004), “Kojic acid and its derivatives: history and present state of art”, Central european journal of public health, 12(SUPP), pp S16-S17 17 Burdock G A, Soni M G, Carabin IG (2001), “Evaluation of health aspects of kojic acid in food”, Regulatory toxicology and pharmacology, 33(1), pp 80-101 18 Chaudhary J, Pathak A N, Lakhawat S (2014), “Production technology and applications of kojic acid”, Annual Research & Review in Biology, 4(21), pp 3165, 3178-3179 19 Chen J S, Wei C, Rolle R S, Otwell W S, Balaban M O, Marshall M R (1991), “Inhibitory effect of kojic acid on some plant and crustacean polyphenol oxidases”, Journal of Agricultural and food Chemistry, 39(8), pp 1396-1401 20 Coupland K, Niehaus Jr W G (1987), “Effect of nitrogen supply, Zn2+, and salt concentration on kojic acid and versicolorin biosynthesis by Aspergillus parasiticus”, Experimental mycology, 11(3), pp 206-213 21 Dobias J, Nemec P (1977), “The inhibitory effect of kojic acid and its two derivatives on the development of Drosophila melanogaster [insecticidal effect]”, Biologia 22 El-Aziz Amany B Abd (2013), “Improvement of kojic acid production by a mutant strain of Aspergillus flavus”, Journal of Natural sciences Research, 3(4), pp 3141 23 Eyong K O, Ambassa P, Yimdjo M C, Sidjui L S, Folefoc G L (2012), “A new source of kojic acid isolated from Kingella africana: A possible precursor for quinine biosynthesis”, Rasayan journal of chemistry, 5(4), pp 477-480 24 Hassan H M, Saad A M, Hazzaa M, Ibrahim E (2014), “Optimization study for the production of kojic acid crystals by Aspergillus oryzae var effusus NRC 14 isolate”, Int J Curr Microbiol App Sci, 3(10), pp 133-142 25 Hazzaa M M, Saad A M, Hassan H M, Ibrahim E (2013), “High Production of Kojic acid crystals by isolated Aspergillus oryzae var effuses NRC14”, J Appl Sci Res, 9(3), pp 1714-1723 26 Hudecová D, Jantová S, Melník M, Uher M (1996), “New azidometalkojates and their biological activity”, Folia microbiologica, 41(6), pp 473-476 27 Ichimoto I, Fujii K, Tatsumi C (1965), “Studies on Kojic Acid and its Related γPyrone Compounds: Part IX Synthesis of Maltol from Kojic Acid (Synthesis of Maltol (3))”, Agricultural and Biological Chemistry, 29(4), pp 325-330 28 Katagiri H, Kitahara K (1929), “The Formation of Kojic Acid by Aspergillus Oryzae”, Bulletin of the Agricultural Chemical Society of Japan, 5(6-9), pp 3847 29 Kitada M, Fukimbara T (1971), “Studies on kojic acid fermentation: (VII) The mechanism of the conversion of glucose to kojic acid”, J Ferment Technol, 49, pp 847-851 30 Kitada M, Ueyama H (1967), “Studies on kojic acid fermentation: (I) Cultural condition in submerged culture”, J Ferment Technol, 45, pp 1101-1107 31 Kotani T, Ichimoto I, Tatsumi C, Fujita T (1976), “Bacteriostatic activities and metal chelation of kojic acid analogs”, Agricultural and Biological Chemistry, 40(4), pp 765-770 32 Kwak M Y, Rhee J S (1992), “Cultivation characteristics of immobilized Aspergillus oryzae for kojic acid production”, Biotechnology and bioengineering, 39(9), pp 903-906 33 Lee H F, Boltjes B, Eisenman W (1950), “Kojic acid as an inhibitor of tubercle bacilli”, American Review of Tuberculosis and Pulmonary Diseases, 61(5), pp 738-41 34 Lee Y S, Park J H, Kim M H, Seo S H, Kim H J (2006), “Synthesis of tyrosinase inhibitory kojic acid derivative”, Archiv der Pharmazie, 339(3), pp 111-114 35 Liljegren K, Svendsen A, Frisvad J C (1988), “Mycotoxin and exoenzyme production by members of Aspergillus section flavi”, JSM Mycotoxins, 1988(1Supplement), pp 35-36 36 Mohamad R, Mohamed M S, Suhaili N, Salleh M M, Ariff A B (2010), “Kojic acid: Applications and development of fermentation process for production”, Biotechnology and Molecular Biology Reviews, 5(2), pp 24-37 37 Noh J M, Kwak S Y, Seo H S, Seo J H, Kim B G, Lee Y S (2009), “Kojic acidamino acid conjugates as tyrosinase inhibitors”, Biooorganic & medicinal chemistry letters, 19(19), pp 5586-5589 38 Rosfarizan M, Arbakariya A, Hassan M A, Karim M I A, Hiroshi S, Suteaki S (2002), “Importance of carbon source feeding and pH control strategies for maximum kojic acid production from sago starch by Aspergillus flavus”, Journal of bioscience and bioengineering, 94(2), pp 99-105 39 Rosfarizan M, Ariff A B (2000), “Kinetics of kojic acid fermentation by Aspergillus flavus using different types and concentrations of carbon and nitrogen sources”, Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 25(1), pp 20– 24 40 Rosfarizan M, Ariff A B, Hassan M A, Karim M I A (2000), “Influence of pH on kojic acid fermentation by Aspergillus flavus”, Pakistan Journal of Biological Sciences, 3(6), pp 977-982 41 Saito K (1907), “Über die Säurebildung bei Aspergillus Oryzœ”, Shokubutsugaku Zasshi, 21(240), pp 7-11 42 Saruno R, Kato F, Ikeno T (1979), “Kojic acid, a tyrosinase inhibitor from Aspergillus albus”, Agricultural and Biological Chemistry, 43(6), pp 1337-1338 43 Son S M, Moon K D, Lee C Y (2001), “Inhibitory effects of various antibrowning agents on apple slices”, Food Chemistry, 73(1), pp 23-30 44 Synytsya A, Blafková P, Čopíková J, Spěváček J, Uher M (2008), “Conjugation of kojic acid with chitosan”, Carbohydrate polymers, 72(1), pp 21-31 45 Takamizawa K, Nakashima S, Yahashi Y, Kubata K B, Suzuki T, Kawai K, Horitsu H (1996), “Optimization of kojic acid production rate using the Box- Wilson method”, Journal of Fermentation and bioengineering, 82(4), pp 414416 46 Wakisaka Y, Segawa T, Imamura K, Sakiyama T, Nakanishi K (1998), “Development of a cylindrical apparatus for membrane-surface liquid culture and production of kojic acid using Aspergillus oryzae NRRL484”, Journal of fermentation and bioengineering, 85(5), pp 488-494 47 Wilson B J (1971), “Miscellaneous Aspergillus toxins”, Microbes toxins, fungal toxins, pp 235-250 48 Wei C I, Huang T S, Fernando S Y, Chung K T (1991), “Mutagenicity studies of kojic acid”, Toxicol Lett, 59, pp 213-220 ... sinh acid kojic, đề tài ? ?Khảo sát điều kiện nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae để sản xuất acid kojic? ?? tiến hành với mục tiêu sau: Khảo sát ảnh hưởng thành phần môi trường lên men đến khả sinh acid. .. A oryzae trình sản xuất acid kojic Do cần điều kiện pH thích hợp suốt giai đoạn tăng trưởng sản xuất 1.4 Một số nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến khả sinh acid kojic nấm mốc. .. men Aspergillus oryzae để sản xuất acid kojic 1.2 Đề tài khảo sát ảnh hưởng pH môi trường lên men đến khả sinh acid kojic nấm mốc Aspergillus oryzae Tại điều kiện nghiên cứu đề tài, điều kiện