Khảo sát điều kiện nuôi cấy chủng virus NIBRG-14 trên trứng gà có phôi trong sản xuất vắc xin cúm H5N1 ở quy mô công nghiệp

Việc xác định được liều virus gây nhiễm, nhiệt độ nuôi cấy, thời gian thu hoạch thích hợp để có thể thu được dịch niệu với hiệu giá virus cao và ổn định là yếu tố quyết định đến thành cô

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

-oOo -

PHẠM VĂN TÙNG

KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY CHỦNG VIRUS NIBRG - 14 TRÊN TRỨNG GÀ CÓ PHÔI TRONG SẢN XUẤT VẮC XIN CÚM A/H5N1 Ở

QUY MÔ CÔNG NGHIỆP

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giáo viên hướng dẫn:

TS LÊ VĂN BÉ ThS LÊ PHƯƠNG CHUNG

NHA TRANG – 2013

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đồ án này, trước hết em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Ban giám hiệu Trường Đại học Nha Trang và Ban giám đốc Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi trường

Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Vắc xin và sinh phẩm Y tế (IVAC) đã tạo điều kiện thuận lợi nhất cho em trong thời gian thực tập vừa qua

Em xin chân thành cảm ơn TS Lê Văn Bé - Viện trưởng viện Vắc xin và sinh phẩm Y tế (IVAC), Ths Dương Hữu Thái - phó Viện trưởng (trưởng phòng Vắc xin Cúm - IVAC) và Ths Lê Phương Chung - giảng viên Viện công nghệ sinh học và môi trường (Đại học Nha Trang) đã tận tình hướng dẫn, động viên

em trong suốt thời gian thực hiện đồ án vừa qua

Xin cảm ơn anh Đàm Xuân Cường, anh Nguyễn Giang, chị Nguyễn Thị Thùy Đoan cùng toàn thể các cán bộ viên chức phòng Vắc xin Cúm - Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian thực hiện đồ án vừa qua

Cuối cùng, em xin cảm ơn cha mẹ, bạn bè và toàn thể quí thầy cô trong Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường đã dạy dỗ và tạo điều kiện về vật chất

và tinh thần cho em trong suốt thời gian vừa qua

Nha Trang, tháng 6 năm 2013

Sinh viên

Phạm Văn Tùng

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

LỜI MỞ ĐẦU 1

Chương I:TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 GIỚI THIỆU VỀ BỆNH CÚM H5N1 3

1.2 TÌNH HÌNH BỆNH CÚM A/H5N1 Ở NGƯỜI TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 3

1.2.1 Tình hình bệnh cúm A/H5N1 ở người trên thế giới hiện nay 3

1.2.2 Tình hình bệnh cúm A/H5N1 tại Việt Nam 5

1.2.3 Tình hình sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 cho người ở Việt Nam 7

1.3 TÁC NHÂN GÂY BỆNH 8

1.3.1 Đặc điểm sinh học của Virus cúm A/H5N1 8

1.3.2 Độc lực và tính thích ứng vật chủ 10

1.3.3 Đường xâm nhập và lây bệnh của bệnh cúm A/H5N1 12

1.3.4 Đặc điểm kháng nguyên - miễn dịch 15

1.4 SẢN XUẤT VẮC XIN PHÒNG BỆNH CÚM A/H5N1. 19

1.4.1 Các công nghệ sản xuất vắc xin cúm 19

1.4.1.1 Công nghệ sản xuất vắc xin cúm trên trứng gà có phôi 19

1.4.1.2 Công nghệ sản xuất vắc xin cúm trên tế bào 20

1.4.1.3 Một số các phương pháp sản xuất vắc xin cúm khác 22

1.4.2 Sản xuất vắc xin cúm quy mô lớn tại Viện vắc xin và sinh phẩm y tế (IVAC) 22

1.4.2.1 Điều kiện sản xuất: 22

1.4.2.2 Tóm tắt quy trình công nghệ 22

1.4.3.3 Phát triển quy trình công nghệ .24

1.4.3.4 Phát triển quy trình nuôi cấy 24

Chương II:ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 29

2.2 VẬT LIỆU 29

2.3 THIẾT BỊ - DỤNG CỤ 29

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.4.1 Xác định các điều kiện tối ưu 31

2.4.2 Phương pháp gây nhiễm virus trên trứng gà có phôi 9 - 11 ngày tuổi 32

2.4.3 Phương pháp lấy mẫu dịch virus sau khi trứng đã gây nhiễm 34

2.4.4 Phương pháp kiểm tra chất lượng 35

Chương III:KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 40

3.1 Ảnh hưởng của các yếu tố: thể tích tiêm, thời gian, nhiệt độ đến quá trình nuôi cấy virus 40

3.1.1 Kết quả đối với lô 1 40

3.1.2 Kết quả kiểm nghiệm đối với lô 2 42

3.1.3 Kết quả kiểm nghiệm đối với lô 3 44

Chương IV:KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

1.KẾT LUẬN 47

2.KIẾN NGHỊ 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC

CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

EID50 : Egg Infection Dose 50 (Liều gây nhiễm 50%)

FAO : Food and Agriculture Organization (Tổ chức Nông lương thế giới)

HA : Haemagglutinin (Kháng nguyên ngưng kết hồng cầu – Kháng nguyên

NIBSC : National Institute for Biological Standards and Control (Viện Quốc

gia về tiêu chuẩn và Kiểm định Sinh học, Anh)

OIE : Office International Epizoot (Tổ chức Thú y thế giới)

PBS : Phosphate Buffer Saline (Dung dịch đệm)

PR8 : Chủng virus cúm A/H1N1/ có nguồn gốc từ Puerto Rico

RNP : Ribo Nucleo Protein

WHO : World Health Organization - Tổ chức Y Tế Thế giới (TCYTTG) WSL : Working Seed Lot (Chủng làm việc)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Lấy mẫu thử nghiệm với thể tích tiêm V = 0,1 ml 31

Bảng 2.2 Lấy mẫu thử nghiệm với thể tích tiêm V = 0,2 ml 31

Bảng 2.3 Lấy mẫu thử nghiệm với thể tích tiêm V = 0,3 ml 31

Bảng 2.4 : Sơ đồ phản ứng ngưng kết hồng cầu 36

Bảng 2.5 Cách pha loãng mẫu thử nghiệm thành các độ pha khác nhau 37

Bảng 2.6 Kết quả EID50 của chủng giống được xác định bằng phương pháp Reed- Muench 38

Bảng 2.7 Cách tính EID50 của liều gây nhiễm 39

Bảng 3.1 Kết qủa kiểm nghiệm HA đối với lô 1 40

Bảng 3.2 Kết quả kiểm nghiệm EID50 đối với lô 1 41

Bảng 3.3 Kết quả kiểm nghiệm HA đối với lô 2 42

Bảng 3.4 Kết quả thử nghiệm EID50 ở lô 2 43

Bảng 3.5 Kết quả HA thử nghiệm đối với lô 3 44

Bảng 3.6 Kết quả kiểm nghiệm EID50 đối với lô 3 theo ảnh hưởng

của nhiệt độ 45

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Tình hình dịch cúm A/H5N1 ở người từ năm 2003 đến nay .4

Hình 1.2 Các giai đoạn phát triển dịch cúm A/H5N1 5

Hình 1.3 Tình hình dịch cúm A/H5N1 ở nước ta từ năm 2003 đến 2012 6

Hình 1.4 Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (A), mô hình (B), và phức hợp ribonucleoprotein RNP (C) của virus cúm A 8

Hình 1.5 Mô hình cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A ở tế bào chủ 13

Hình 1.6 Mối quan hệ lây nhiễm và thích ứng các loài vật chủ của virus cúm A 15

Hình 1.7 Sơ đồ minh họa đột biến điểm của hiện tượng “kháng nguyên” (antigenic drift) (A) và đột biến tái tổ hợp của hiện tượng “trộn kháng nguyên” (antigenic shift) ở virus cúm A (B) .19

Hình 1.8 Quy trình sản xuất vắc xin cúm H5N1 23

Hình 1.9 Bằng kĩ thuật di truyền ngược chủng gốc NIBRG-14 được tạo ra từ 6 gen của virus A/PR8/34(H1N1) và 2 gen của virus A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), trong đó gen HA bị đột biến mất đoạn để giảm độc lực, cho phép virus này tái tổ hợp này nhân lên bằng công nghệ phôi trứng gà .27

Hình 2.1 Sơ đồ lấy mẫu thử nghiệm 30

Hình 2.2 Sơ đồ xác định các điều kiện tối ưu 32

Hình 2.3 Hình ảnh về quá trình đánh dấu vị trí tiêm 33

Hình 2.4 Hình ảnh về quá trình đục lỗ điểm tiêm 33

Hình 2.5 Hình ảnh về quá trình tiêm chủng vào dịch niệu đệm của trứng 33

Hình 2.6 Hình ảnh về quá trình dán kín vị trí tiêm 33

Hình 2.7 Hình ảnh về quá trình cắt vỏ trứng tại vùng buồng khí 34

Hình 2.8 Hình ảnh về quá trình dùng pipette hút dịch niệu trong từng trứng 34

LỜI MỞ ĐẦU

Từ trường hợp nhiễm virus cúm A/H5N1 đầu tiên được phát hiện tại Hồng Kông tháng 5 năm 1997 đến nay, dịch cúm A/H5N1 trên người đã lan sang nhiều quốc gia trên thế giới Cho đến nay, vẫn chưa có một bằng chứng nào cho thấy có

sự lây truyền virus trực tiếp từ người sang người Tuy nhiên, các chuyên gia khẳng định việc virus cúm A/H5N1 lây nhiễm trực tiếp từ người qua người chỉ là vấn đề thời gian Điều này đã cảnh báo về nguy cơ của một đại dịch cúm A/H5N1 trên người gần kề và buộc các nhà khoa học trên thế giới phải nhanh chóng tìm ra phương thức phòng bệnh hiệu quả

Vắc xin luôn được coi là phương thức hiệu nghiệm nhất trong việc phòng chống, giảm tỷ lệ mắc bệnh và chết do virus cúm gây ra Tuy vắc xin cúm đã được sản xuất từ thập niên 60 nhưng chỉ tập trung ở các nước Châu Âu và Bắc

Mỹ Với năng lực sản xuất vắc xin của thế giới hiện nay là 300 triệu liều/năm, nếu đại dịch cúm trên người xảy ra thì lượng vắc xin này chỉ có thể đáp ứng cho khoảng 10% dân số thế giới Trước tình hình đó, Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG) khuyến cáo tất cả các nước, đặc biệt các quốc gia Châu Á, chủ động nghiên cứu và sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 để có thể kịp thời cung ứng cho nhu cầu bảo vệ sức khỏe cộng đồng khi xảy ra đại dịch

Hiện nay vắc xin cúm gia cầm H5N1 được sản xuất dùng trong công nghệ nuôi cấy virus trên phôi gà 9 - 11 ngày tuổi Việc xác định được liều virus gây nhiễm, nhiệt độ nuôi cấy, thời gian thu hoạch thích hợp để có thể thu được dịch niệu với hiệu giá virus cao và ổn định là yếu tố quyết định đến thành công và đảm bảo tính kinh tế khi sản xuất vắc xin cúm

Với ý nghĩa trên chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu “Khảo sát điều

kiện nuôi cấy chủng virus NIBRG - 14 trên trứng gà có phôi trong sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 ở quy mô công nghiệp.”

Mục tiêu của đề tài: Tìm ra điều kiện nuôi cấy thích hợp nhất virus

H5N1 trên trứng gà có phôi để đem vào thử nghiệm và ứng dụng trên quy mô công nghiệp

Nội dung nghiên cứu:

• Xác định các điều kiện thích hợp để nuôi cấy virus cúm H5N1: thời gian, nhiệt độ, độ ẩm, liều gây nhiễm

• Thử nghiệm và áp dụng điều kiện nuôi thích hợp vào quy trình sản xuất vắc xin cúm trên quy mô 5000-10000 liều/mẻ

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 GIỚI THIỆU VỀ BỆNH CÚM H5N1

Cúm gia cầm là bệnh truyền nhiễm cấp tính của gia cầm, do nhóm virus

cúm A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra, có khả năng lan truyền từ động vật

sang người Virus H5N1 thể độc lực cao (HPAI) vẫn đang là mối đe dọa cho chăn nuôi và sức khỏe cộng đồng Chúng ta có thể khống chế dịch bằng cách tiêu diệt và loại trừ các loài gia cầm bị nhiễm bệnh trong vùng dịch để cắt đứt đường lây truyền Virus cúm A/H5N1 trong giai đoạn từ 2003 đến nay là thể có độc lực cao, với sự xuất hiện nhiều genotype khác nhau, đặc biệt là genotype Z, lan truyền từ Nam Trung Quốc đến các nơi khác trên thế giới Tính gây bệnh của virus A/H5N1 thể độc lực cao không chỉ giới hạn ở chức năng điểm cắt protease của HA và hoạt tính của NA, mà là hiệu ứng của sản phẩm đa gen và khả năng tái tổ hợp tạo virus mới với đặc tính gây bệnh và độc lực khác nhau là vấn đề cần tính đến Trong thời gian này, đặc biệt là trong 5 năm gần đây trên thế giới có hàng ngàn công trình nghiên cứu về cúm A và cúm A/H5N1 thậm chí là nghiên cứu phát triển công nghệ sản xuất vắc xin gây miễn dịch cho gia cầm và để chuẩn

bị cho đại dịch có thể xảy ra ở người Về phương diện dịch tễ, tiến hóa, tạo biến chủng, biến đổi kháng nguyên - miễn dịch, tính mẫn cảm và đề kháng với dược liệu, khác với nhiều virus khác ở gia cầm, virus cúm A/H5N1 có xu hướng đột biến nhanh để tạo nên nhiều biến chủng phân chia thành nhiều phân dòng khác nhau và có tính thích ứng phổ rộng đối với vật chủ

1.2 TÌNH HÌNH BỆNH CÚM A/H5N1 Ở NGƯỜI TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

1.2.1 Tình hình bệnh cúm A/H5N1 ở người trên thế giới hiện nay

Cúm A/H5N1 là một phân nhóm có khả năng gây nhiễm cao của virus cúm gia cầm Chủng này lần đầu tiên được phát hiện và ghi nhận tại Hồng Kông vào năm 1997 khi nó gây bệnh trên người và gia cầm Tên gọi phân nhóm H5N1

liên quan đến loại protein kháng nguyên trên vỏ virus: protein hemagglutinin nhóm 5 (H5) và neuraminidase nhóm 1 (N1)

Kể từ cuối năm 2003 sự lan truyền cúm A/H5N1 do các loài chim di cư ở Châu Á, Châu Âu, Trung Đông và Châu Phi trở thành mối quan tâm lớn của TCYTTG cũng như nhiều quốc gia trên toàn thế giới Từ năm 2003 đến ngày 06/3/2012 theo thông báo của TCYTTG đã có tổng cộng 594 người mắc bệnh dương tính với cúm A/H5N1, trong đó 349 người tử vong (chiếm tỷ lệ chung 58,75%)

Các quốc gia có số mắc và số tử vong cao là các nước Ai cập (163/57); Indonesia (186/134) và Việt Nam (122/61)

Có 15 quốc gia ghi nhận cúm A/H5N1 ở người từ 2003 đến nay như hình 1.1

Hình 1.1 Tình hình dịch cúm A/H5N1 ở người từ năm 2003 đến nay.

Hầu hết những ca nhiễm cúm gia cầm H5N1 trên người qua điều tra dịch tễ học cho thấy có liên quan đến tiếp xúc với gia cầm bị bệnh hoặc trung gian qua thực phẩm chế biến từ gia cầm bị bệnh hoặc qua tiếp xúc trực tiếp như: giết mổ, vận chuyển, mua bán, cầm và sờ vào gia cầm nhiễm bệnh TCYTTG đã chia dịch

cúm thành 6 giai đoạn, từ mức độ chỉ là nguy cơ nhỏ cho đến khi đại dịch bùng phát và lan tràn TCYTTG đánh giá hiện nay đang nằm ở giai đoạn 3 của dịch, điều đó thừa nhận sự gây nhiễm trên người của virus H5N1 nhưng chưa có bằng chứng về sự lây truyền virus từ người sang người [19], [24], [29]

Các giai đoạn phát triển dịch cúm A/H5N1 như hình 1.2 [34]

Hình 1.2 Các giai đoạn phát triển dịch cúm A/H5N1 1.2.2 Tình hình bệnh cúm A/H5N1 tại Việt Nam

Tại Việt Nam, ca bệnh đầu tiên vào năm 2003, cho đến đầu tháng 3/2012 ghi nhận có tổng cộng 122 ca, đến ngày 7/3/2012 ghi nhận thêm 01 ca nhiễm cúm A (H5) là một bệnh nhân nam 31 tuổi, ở xã Ea Tyh, huyện Ea Kar, đây là ca bệnh thứ 4 xuất hiện tại Việt Nam trong năm 2012 và là ca bệnh đầu tiên tại Đắk Lắk từ trước đến nay đang được theo dõi và điều trị tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới

Tp Hồ Chí Minh (ca đầu tiên tại Kiên Giang, ca thứ 2 tại Sóc Trăng, ca thứ 3 tại Bình Dương)

Tình hình dịch cúm A/H5N1 ở nước ta từ năm 2003 đến 2012 như hình 1.3 [34], [35]

Hình 1.3 Tình hình dịch cúm A/H5N1 ở nước ta từ năm 2003 đến 2012

Qua điều tra dịch tễ, các trường hợp nhiễm cúm A/H5N1 trên người được ghi nhận đồng thời với thời điểm có dịch cúm trên gia cầm Mặc dù số mắc ít nhưng tỷ lệ tử vong chung rất cao (58,75%) và chi phí điều trị rất tốn kém, do vậy biện pháp tốt nhất là dự phòng để khỏi mắc bệnh

Trước tình hình dịch cúm A/H5N1 có nguy cơ lan rộng ở gia cầm và lây lan sang người, Chính phủ, Bộ Y tế, UBND các tỉnh đã có chỉ đạo các địa phương tiếp tục theo dõi chặt chẽ tình hình dịch bệnh truyền nhiễm trong nước

và thế giới, tăng cường giám sát chặt chẽ các trường hợp mắc cúm tại các địa phương thông qua hệ thống giám sát trọng điểm cúm quốc gia, tại các bệnh viện

và tại cộng đồng, phát hiện sớm các trường hợp mắc, sự biến chủng của virus,

tổ chức điều tra dịch tễ để xác định nguồn lây và xử lý kịp thời ổ dịch Và vắc xin được xem là phương pháp phòng bệnh hiệu quả nhất trong phòng chống các bệnh do virus cúm A/H5N1 gây ra

1.2.3 Tình hình sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 cho người ở Việt Nam

Trước tình hình dịch bệnh và những thông tin đầu tiên về đại dịch có thể xảy ra bất cứ lúc nào, ngay từ năm 2005 đến nay các nhà sản xuất vắc xin tại Việt nam dưới sự tài trợ của nhiều tổ chức quốc tế đang nỗ lực phấn đấu phát triển công nghệ sản xuất vắc xin cúm nói chung và vắc xin cúm đại dịch nói riêng Có thể điểm qua như sau:

• Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số I thuộc bộ Y tế (Vabiotech) từ giữa năm 2004 phát triển kỹ thuật sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 cho người trên tế bào thận khỉ tiên phát Chủng sản xuất ban đầu sử dụng là một chủng tái tổ hợp từ chủng virus A/Vietnam/1203/2004 với 1 chủng tái hợp từ chủng virus phòng thí nghiệm do trường đại học Tokyo, Nhật Bản cung cấp Hiện nay, loại vắc xin này

đã qua giai đoạn thử nghiệm lâm sàng pha III trên người tình nguyện Tuy nhiên,

vì là công nghệ mới, vắc xin được sản xuất trong phòng thí nghiệm nên vắc xin cũng chỉ dừng ở mức độ đề tài nghiên cứu

• Viện Vắc xin và sinh phẩm Y tế (IVAC): Từ năm 2006 đến 2009, thực

hiện đề tài nhánh cấp nhà nước “Nghiên cứu sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 trên

trứng gà có phôi”, Viện đã sử dụng chủng NIBRG-14 nghiên cứu sản xuất thử

nghiệm thành công ở qui mô phòng thí nghiệm các lô vắc xin cúm A/H5N1 Chủng NIBRG-14 được tạo bằng kỹ thuật di truyền đảo ngược từ chủng virus A/H5N1 hoang dại độc lực cao A/Vietnam 1194/2004 và chủng virus cúm phòng thí nghiệm PR8 Chủng do Viện NIBSC –Vương quốc Anh cung cấp và được sự công nhận của TCYTTG Kết quả nghiên cứu cho thấy vắc xin cho đáp ứng miễn dịch trên động vật thí nghiệm đạt yêu cầu theo khuyến cáo của TCYTTG Trên cơ sở thành công của đề tài, năm 2007, Viện đã được TCYTTG chọn là một trong các cơ sở nằm trong chiến lược dự trữ vắc xin cúm đại dịch cho toàn cầu và được tài trợ xây dựng một nhà máy đạt chuẩn GMP-WHO để sản xuất vắc xin cúm với công suất 1 -3 triệu liều vắc xin/năm Tiếp theo, năm

2011, Tổ chức PATH (Mỹ) đã tiếp tục tài trợ nguồn kinh phí để vận hành nhà máy Sản phẩm vắc xin cúm A/H1N1 sản xuất trên dây chuyền công nghệ của nhà máy hiện nay đang được thử nghiệm lâm sàng trên người Tiếp tục chiến lược sản xuất vắc xin cho đại dịch, từ tháng 10/2011 đến nay nhà máy bắt đầu

sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 bằng chủng NIBRG-14, hướng tới thử nghiệm lâm sàng dự kiến thực hiện vào năm 2013 cho loại vắc xin này Nếu thử nghiệm lâm sàng thành công, Vắc xin sẽ được đăng ký cấp phép sản xuất ở qui mô công nghiệp với công suất 1-3 triệu liều/năm, đủ đáp ứng cho nhu cầu phòng chống dịch cho các đối tượng có nguy cơ cao

• Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh nghiên cứu phát triển dạng vắc xin nuôi cấy trên tế bào VERO, sử dụng chủng NIBRG-14 Tuy nhiên dạng vắc xin

này cũng mới chỉ dừng ở mức độ đề tài nghiên cứu

1.3 TÁC NHÂN GÂY BỆNH

1.3.1 Đặc điểm sinh học của Virus cúm A/H5N1

Virus cúm A (còn gọi là virus cúm gia cầm, virus cúm gà) có tên khoa học

là Avian Influenza (AI), thuộc họ Orthomyxoviridae trong hệ thống phân loại

chung (Basic Taxomomy) [22] Các hạt virus cúm A (virion) có hình cầu hoặc hình khối đa diện, đường kính 80-120 nm, đôi khi cũng có dạng hình sợi, khối lượng phân tử khoảng 250 triệu Da [19], [24], [29]

• Phân tích thành phần hóa học một virion có chứa khoảng 0,8 - 1,1% RNA;

70 - 75% là protein; 20 - 24% lipid và 5 - 8% là carbonhydrate [11]

• Hạt virus có cấu tạo đơn giản gồm vỏ (capsid), vỏ bọc ngoài (envelope) và

lõi là RNA sợi đơn âm - negative single strand [11]

Hình 1.4 Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (A), mô hình (B), và phức hợp

ribonucleoprotein RNP (C) của virus cúm A Ghi chú:

- A: Các dạng hình thái khác nhau của virus cúm A dưới kính hiển vi điện tử

- B: Mô hình cấu tạo hạt virus cúm A (Hemagglutinin: phân tử kháng nguyên HA, Neuraminidase: phân tử kháng nguyên NA; PB2, PB1, PA:

ba dưới đơn vị phức hợp enzyme polymerase của virus)

- C: Cấu trúc của phức hợp ribonucleoprotein RNP

Vỏ virus có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của virus, bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào vật chủ được đặc hiệu hóa gắn các protein màng của virus Trên bề mặt có khoảng 500 “gai mấu” nhô ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10 - 14 nm có đường kính 4 - 6 nm, đó là những kháng nguyên bề mặt vỏ virus, bản chất cấu tạo là

glycoprotein gồm: HA, NA, MA (matrix) và các dấu ấn khác của virus [14] Có

sự phân bố không đồng đều giữa các phân tử NA và HA (tỉ lệ khoảng 1NA/4HA), đây là hai loại protein kháng nguyên có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus ở tế bào cảm nhiễm [7], [8] Vật chất di truyền (còn gọi là hệ gen) của virus cúm A là RNA sợi đơn âm ((-) ssRNA), gồm 8 phân đoạn riêng biệt (HA, NA, M, NS, NP, PA, PB1 và PB2) nối với nhau thành một sợi duy nhất bên trong vỏ virus, mã hóa cho 11 protein tương ứng của virus, trong đó phân đoạn M mã hóa cho 2 protein là M1 và M2, phân đoạn NS mã hóa cho 2 protein là NS và NEP, phân đoạn PB1 mã hóa cho 2 protein là PB1 và PB1

- F2 [21] (hình 1.4)

Về danh pháp, nhóm virus cúm A được phân chia thành nhiều phân type

(subtype), các phân type này được phân biệt bởi sự khác nhau ở các đặc tính

kháng nguyên bề mặt (NA và HA), cho đáp ứng miễn dịch khác nhau giữa các chủng virus ở cơ thể bị nhiễm [7], [8] Có 16 phân type HA và 9 phân type NA

đã được phát hiện, sự tổ hợp giữa các phân type này, về lí thuyết, có thể tạo ra hơn 254 biến chủng khác nhau, trừ chủng ban đầu [29] Hiện nay, dữ liệu gen và

hệ gen của virus cúm A có thể được tìm thấy trong Ngân hàng gen [18], tại mạng lưới chuyên gia cúm gia cầm của Tố chức Nông lương thế giới (FAO) và Tổ chức Thú y thế giới (OIE) [22], [23]; và tại trang web của Trung tâm dữ liệu các gen virus (Influenza Sequence Database ) TCYTTG đã quy định thống nhất danh pháp theo thứ tự kí hiệu: Tên serotype - Loài động vật bị nhiễm - Vùng địa lí phân lập - Số hiệu đăng kí chủng virus - Thời gian phân lập - Loại hình phân type

[HA(H) và NA(N)]; ví dụ: A/Chicken/Vietnam/ HG4/2005(H5N1) Đối với các virus được phân lập trên người bệnh, thì không cần ghi loài mắc trong danh pháp, ví

dụ: A/Vietnam/1194/2004(H5N1) [31]

1.3.2 Độc lực và tính thích ứng vật chủ

Độc lực gây bệnh của virus cúm A

Tính gây bệnh hay độc lực của virus cúm A được chia làm hai loại: Loại độc lực cao (HPAI), và loại độc lực thấp (LPAI), cả hai loại đều cùng tồn tại trong tự nhiên [21]

• HPAI: là loại virus cúm A có khả năng gây tổn thương nhiều cơ quan nội tạng trong cơ thể nhiễm, trên gia cầm chúng thường gây chết 100% số gia cầm bị nhiễm trong vòng 48 giờ sau nhiễm, loại này rất nguy hiểm gây lo ngại cho cộng đồng Virus loại HPAI phát triển tốt trên tế bào phôi gà và

tế bào thận chó trong môi trường nuôi cấy không có trypsin [29]

• LPAI: là loại virus khi phát triển trong cơ thể nhiễm, có thể gây bệnh cúm nhẹ không có triệu chứng lâm sàng điển hình và không làm chết vật chủ Đây là loại virus lây truyền rộng rãi và tạo nên các ổ bệnh trong tự nhiên của virus cúm A, loại này có thể trao đổi gen với các chủng virus có độc lực cao đồng nhiễm trên cùng một tế bào, và trở thành loại virus HPAI nguy hiểm [29]

Tính thích ứng đa vật chủ của virus cúm A/H5N1

Vật chủ tự nhiên của tất cả các chủng virus cúm A/H5N1 là chim hoang

dã (chủ yếu là vịt trời), đây là nguyên nhân lan truyền virus trong tự nhiên rất khó kiểm soát Virus cúm A có khả năng gia tăng biên độ vật chủ của chúng trong quá trình lây truyền ở tự nhiên [21] Nhờ đặc tính luôn thay đổi kháng nguyên trong tự nhiên, virus cúm A có khả năng xâm nhiễm ở nhiều loài vật chủ trung gian khác nhau như gia cầm, một số loài động vật có vú (hải cẩu, cá

voi, ngựa, lợn) và cả ở người, tạo nên tính thích ứng lan truyền “nội loài” như

gà - gà, hay “ngoại loài” như gà - lợn; gà - lợn - người (hình 1.6) Vịt (vịt trời)

và một số loài thuỷ cầm khác (ngỗng) luôn luôn là vật chủ tàng trữ nguồn virus gây nhiễm [34] Đặc điểm thích ứng vật chủ này là điều kiện thuận lợi cho virus cúm A trao đổi, tái tổ hợp các phân đoạn gen, đặc biệt là các phân đoạn gen

kháng nguyên (gen “độc” HA và NA) giữa các chủng, tạo ra một chủng virus

cúm mới có khả năng thích ứng xâm nhiễm ở loài vật chủ mới của chúng đặc

biệt khi chúng vượt qua được “rào cản loài” dễ dàng thích ứng lây nhiễm gây

bệnh từ gia cầm sang người và giữa người với người [18], [19] Trong lịch sử các đại dịch cúm ở người, lợn thường là vật chủ trung gian chuyển tiếp giúp cho virus cúm A biến đổi để dễ dàng lây nhiễm sang người gây nên bệnh dịch [21], [35] Ví dụ như: cúm A/H3N2 là kết quả tái tổ hợp tự nhiên của virus cúm A/H2N2 của người và virus chứa gen H3 trong tự nhiên thông qua đồng nhiễm trên lợn, gây nên đại dịch cúm châu Á năm 1968 [19], [24], [29]

Sức đề kháng

Virus cúm A tương đối nhạy cảm với các tác nhân bất hoạt vật lí hay hóa học Các hạt virus tồn tại thích hợp trong khoảng pH từ 6,5 đến 7,9 Ở pH quá acid hay quá kiềm, khả năng lây nhiễm của virus bị giảm mạnh [17] Lớp vỏ ngoài của virus bản chất là lớp lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm, dễ

bị phá hủy bởi các dung môi hòa tan lipid, chất tẩy rửa và các chất sát trùng: formaldehyde, phenol, β-propiolacton, sodium hypochloride, acid loãng và hydroxylamine Virus bị bất hoạt dưới ánh sáng trực tiếp sau 40 giờ, tồn tại được

15 ngày ánh sáng thường, tia tử ngoại bất hoạt được virus nhưng không phá hủy được kháng nguyên của virus Tuy nhiên, virus cúm A dễ dàng bị tiêu diệt hoàn toàn ở 100oC và ở 60oC/30 phút, tồn tại ít nhất 3 tháng ở nhiệt độ thấp (trong phân gia cầm), và tới hàng năm ở nhiệt độ bảo quản (−70oC) Trong phủ tạng gia cầm (40oC), virus tồn tại 25 - 30 ngày, nhưng chỉ tồn tại 7 - 8 ngày ở nhiệt độ cơ thể người (37oC), trong nước, virus có thể sống tới 4 ngày ở nhiệt độ 30oC [22], [29]

1.3.3 Đường xâm nhập và lây bệnh của bệnh cúm A/H5N1

Đường xâm nhập của virus vào tế bào chủ

Virus cúm A/H5N1 kí sinh nội bào bắt buộc, quá trình xâm nhiễm và nhân lên của virus xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu mô đường hô hấp, đường tiêu hóa của cơ thể nhiễm [22], [24], có những nét đặc trưng như sau:

• Quá trình xâm nhiễm của virus cúm A được mở đầu bằng sự kết hợp của HA và thụ thể thích ứng của nó trên bề mặt các tế bào này, và cuối cùng là giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương của tế bào nhiễm (Hình 1.5)

• Quá trình nhân lên của RNA virus cúm A chỉ xảy ra trong nhân của tế bào, đây là đặc điểm khác biệt so với các virus khác (quá trình này xảy

ra trong nguyên sinh chất), và cuối cùng là giải phóng các hạt virus ra khỏi tế bào nhiễm nhờ vai trò của enzyme neuraminidase Thời gian một chu trình xâm nhiễm và giải phóng các hạt virus mới của virus cúm chỉ khoảng vài giờ (trung bình 6 giờ) Sự tạo thành các hạt virus mới không phá tan tế bào nhiễm, nhưng các tế bào này bị rối loạn hệ thống tổng hợp các đại phân tử, và rơi vào quá trình chết theo chương trình (apoptosis) làm tổn thương mô của cơ thể vật chủ [29], [35]

• Sau khi được giải phóng vào trong bào tương tế bào nhiễm, hệ gen của virus sử dụng bộ máy sinh học của tế bào tổng hợp các protein của virus và các RNA vận chuyển phụ thuộc RNA (RNA - dependent RNA transcription) Phức hợp protein - RNA của virus được vận chuyển vào trong nhân tế bào [15]

• Trong nhân tế bào các RNA hệ gen của virus tổng hợp nên các sợi dương từ khuôn là sợi âm của hệ gen virus, từ các sợi dương này chúng tổng hợp nên RNA hệ gen của virus mới nhờ RNA-polymerase

Các sợi này không được adenine hóa (gắn thêm các adenine - gắn mũ)

ở đầu 5’- và 3’-, chúng kết hợp với nucleoprotein (NP) tạo thành phức hợp ribonucleoprotein (RNP) hoàn chỉnh và được vận chuyển ra bào tương tế bào Đồng thời, các RNA thông tin của virus cũng sao chép nhờ hệ thống enzyme ở từng phân đoạn gen của virus, và được enzyme

PB2 gắn thêm 10 - 12 nucleotide Adenin ở đầu 5’-, sau đó được vận chuyển ra bào tương và dịch mã tại lưới nội bào có hạt để tổng hợp nên các protein của virus (Hình 1.5)

• Các phân tử NA và HA của virus sau khi tổng hợp được vận chuyển gắn lên mặt ngoài của màng tế bào nhiễm nhờ bộ máy Golgi, gọi là

hiện tượng “nảy chồi” của virus NP sau khi tổng hợp được vận chuyển

trở lại nhân tế bào để kết hợp với RNA thành RNP của virus Sau cùng

các RNP của virus được hợp nhất với vùng “nảy chồi”, tạo thành các

“chồi” virus gắn chặt vào màng tế bào chủ bởi liên kết giữa HA với thụ

thể chứa sialic acid Các NA phân cắt các liên kết này và giải phóng các hạt virus trưởng thành tiếp tục xâm nhiễm các tế bào khác [22], [23]

Mô hình cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A ở tế bào chủ ở hình 1.5 [11]

Hình 1.5 Mô hình cơ chế xâm nhiễm và nhân lên

của virus cúm A ở tế bào chủ

Phương thức lây truyền

Các chủng của virus cúm gia cầm có thể lây nhiễm cho nhiều loại động vật khác nhau như chim, lợn, ngựa, hải cẩu, cá voi, hổ và người Virus cúm có

thể lan truyền nhanh từ trại chăn nuôi này sang trại chăn nuôi khác bằng các cơ chế cơ học qua các phương tiện vận chuyển, quần áo, giày dép Virus có nhiều trong chất bài tiết như dịch mũi họng, phân gia cầm bệnh, bụi và đất Tiếp xúc trực tiếp với gia cầm bệnh hoặc đồ dùng, vật dụng bị nhiễm bởi phân gia cầm là đường lây truyền chính Virus có thể lây truyền qua không khí (qua các giọt nhỏ dịch tiết đường hô hấp của gia cầm bệnh hoặc hít phải không khí có chứa bụi từ phân gia cầm) hay qua ăn uống (nước, thực phẩm nhiễm virus ) và tiếp xúc với dụng cụ và đồ vật nhiễm virus Người có thể bị lây bệnh do tiếp xúc trực tiếp với gia cầm bị bệnh qua chăn nuôi, vận chuyển, giết mổ, chế biến, ăn gia cầm và sản phẩm của gia cầm bệnh chưa được nấu chín hoặc chế biến không hợp vệ sinh

Khả năng gây bệnh của virus cúm A

Virus cúm A có tính thích ứng lây nhiễm cao với biểu mô đường hô hấp, gây bệnh chủ yếu ở đường hô hấp, và cũng có thể tác động gây tổn thương nhiều cơ quan khác trong cơ thể của các động vật cảm nhiễm, do đó còn được gọi là virus hướng đa phủ tạng [29], [24], [35] Khả năng gây bệnh của virus cúm A phụ thuộc vào độc lực và tính thích nghi vật chủ của từng chủng virus Thông thường chúng không gây bệnh hoặc chỉ gây bệnh nhẹ giới hạn ở đường

hô hấp của chim hoang dã và gia cầm nhiễm, nhưng một số chủng cường độc (H5, H7, và H1, H2, H3) có thể gây bệnh nặng ở hầu hết các cơ quan trong cơ thể, gây nên dịch cúm ở gia cầm và ở người do tính thích ứng thụ thể sialic của chúng [28], [35] Hầu hết các chủng virus cúm A nhân lên rất tốt trong phôi gà sau lần cấy truyền thứ nhất, tuy nhiên các chủng cường độc phân type H5, H7 gây chết phôi gà ngay sau vài giờ, cả khi hàm lượng virus rất thấp chưa được nhân lên nhiều, và có thể gây bệnh cúm thực nghiệm trên chuột lang, chuột Hamster, chồn đất [19], [20], [35]

Sau khi bị nhiễm virus cúm A, cơ thể vật chủ sinh ra đáp ứng miễn dịch chống lại virus để bảo vệ cơ thể, nhưng đáp ứng miễn dịch này có thể không có tác dụng bảo vệ hoàn toàn cho những lần nhiễm sau, do virus cúm A luôn có sự biến đổi kháng nguyên của nó trong quá trình lưu hành ở tự nhiên, và không có đáp ứng miễn dịch chéo giữa các chủng virus cúm A [29] Do đó, khi xuất hiện những biến chủng virus cúm A có đặc tính kháng nguyên khác với các chủng

virus trước đó, cơ thể nhiễm sẽ không hoặc ít có đáp ứng miễn dịch bảo hộ thích ứng với chủng virus cúm mới Đây là nguyên nhân làm cho gia cầm và con người thường bị mắc bệnh cúm nhiều lần trong năm, và các đợt dịch cúm xảy ra về sau thường nặng nề hơn và có thể gây nên đại dịch cúm mới [35] Khả năng gây bệnh của biến chủng virus cúm mới giảm hoặc biến mất, khi cơ thể có được đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với biến chủng đó và chúng trở nên thích nghi lây nhiễm ở loài vật chủ mới [35] Ví dụ: virus A/H1N1, A/H2N2, A/H3N2 là nguyên nhân của các đại dịch cúm trên người trước đây và đã thích nghi lây nhiễm ở người [21] Tuy nhiên, các chủng này vẫn thường gây ra các vụ dịch cúm tản phát hàng năm ở người, do khả năng biến đổi kháng nguyên của chúng [18] Đây cũng chính là nguồn virus trao đổi gen với các chủng virus cúm đang lưu hành ở gia cầm, để thích ứng lây nhiễm gây bệnh cho nhiều loài khác ngay cả trên người [29], [35]

Hình 1.6 Mối quan hệ lây nhiễm và thích ứng các loài vật chủ

của virus cúm A [35]

1.3.4 Đặc điểm kháng nguyên - miễn dịch

Cấu trúc, chức năng của HA và NA

HA là kháng nguyên quan trọng nhất quyết định độc tính của virus nhờ khả năng nhận biết và gắn vào thụ thể (receptor) của tế bào chủ Khả năng này phụ thuộc vào hai yếu tố:

- Hai dạng phân tử sialic acid (SA) trên thụ thể (receptor) của tế bào chủ:

N -acetylneuraminic acid và N - glycolylneuraminic acid

- Hai kiểu liên kết với galactose: liên kết alpha - 2,6Gal hay liên kết 2,3Gal trên bề mặt của tế bào chủ

alpha-HA virus cúm chim có ái lực với liên kết SA anpha - 2,3Gal, có nhiều ở các tế bào biểu mô của ruột Ngược lại, HA virus cúm người liên kết với liên kết

SA alpha -2,6Gal, các tế bào biểu mô của khí quản người phần lớn chứa liên kết trên Vì vậy virus tấn công cơ quan hô hấp của người, gây bệnh nặng và thường dẫn đến tử vong

Ở heo, các tế bào biểu mô của khí quản mang cả hai loại SA và hai loại liên kết nêu trên Vì vậy, loài heo trở thành vật chủ trung gian có thể bị nhiễm cả hai loại virus cúm chim và cúm người Điều này tạo điều kiện cho quá trình tái tổ hợp tạo một biến chủng virus cúm có độc tính cao và lan truyền trong cộng đồng người

Trong 16 type HA, đến nay chỉ có 3 phân type H1, H2, và H3 liên quan đến các đại dịch đã xảy ra ở người Gần đây các phân type H5, H7 và H9 được xác định là có khả năng gây bệnh trên người

• Neuraminidase

Tương tự như HA, neuraminidase (NA) là một glycoprotein, có một đầu gồm 4 monomer hình cầu trên cùng mặt phẳng và một vùng kị nước gắn vào màng virus có dạng nút lồi hình nấm trên bề mặt virus cúm

NA (hay còn gọi la sialidase) là enzyme có chức năng ngược với HA, nó phân cắt sialic acid bằng cách cắt liên kết glycoside nối nhóm keto của acid sialic với D-galactose hoặc D - galactosamine Phản ứng này cho phép virus tiến qua lớp niêm dịch để tới các tế bào của đường biểu mô hô hấp trong quá trình nhiễm trùng Ngoài ra, việc loại bỏ acid sialic của phân tử HA từ các virion mới được tổng hợp giúp phóng thích các hạt virion ra khỏi tế bào bị nhiễm và gia tăng khả năng nhiễm trùng

Cho đến nay, trong 9 phân type NA, chỉ có N1 và N2 được xác nhận là liên quan đến các vụ dịch ở người

• Các phương thức biến đổi kháng nguyên

Có ba phương thức chủ yếu làm biến đổi kháng nguyên ở virus cúm A [35]

• Hiện tượng lệch kháng nguyên

Lệch kháng nguyên (antigenic drift) thực chất là các đột biến điểm xảy ra các phân đoạn gen/hệ gen của virus Do virus cúm A kí sinh nội bào bắt buộc, không có cơ chế “đọc và sửa bản sao - proof reading” trong quá trình phiên mã

và sao chép ở nhân tế bào đích Sự thiếu hụt enzyme sửa chữa RNA dẫn đến các

enzyme sao chép phụ thuộc RNA sẽ có thể “gài” thêm (đột biến giãn nở), làm

mất đi hoặc thay thế (đột biến trượt - xóa) [35] một hay nhiều nucleotide mà không được sửa chữa trong phân tử RNA chuỗi đơn mới của virus [22], [35] Tuỳ thuộc vị trí xảy ra các đột biến trong bộ ba mã hóa, mà có thể trực tiếp làm thay đổi các amino acid trong trình tự của protein được mã hóa biểu hiện, dẫn đến thay đổi thuộc tính của protein, hoặc được tích lũy trong phân đoạn gen xảy

ra đột biến (đột biến điểm) Tần suất xảy ra đột biến điểm rất cao, cứ mỗi 10.000 nucleotide (tương ứng với độ dài của RNA hệ gen của virus cúm A) thì có 1 nucleotide sai khác [29], [35] Như vậy, gần như mỗi hạt virus mới được sinh ra đều chứa đựng một đột biến điểm trong hệ gen của nó, và các đột biến này được tích lũy qua nhiều thế hệ virus sẽ làm xuất hiện một phân type virus mới có những đặc tính kháng nguyên mới có thể bị sai lệch (Hình1.7)

Hiện tượng này thường xảy ra ở các phân đoạn gen kháng nguyên NA

và HA, tạo ra các bộ mã tổng hợp các amino acid mới, hoặc làm thay đổi cấu trúc dẫn đến thay đổi đặc tính của protein đó, hoặc có khả năng glycosyl hóa rất cao trong cấu trúc chuỗi polypeptide kháng nguyên, tạo ra một biến thể virus mới thay đổi độc lực gây bệnh hay đặc tính kháng nguyên mới [29], [35]

• Hiện tượng trộn kháng nguyên

Hiện tượng trộn kháng nguyên (còn gọi là trao đổi hay tái tổ hợp) các gen kháng nguyên (antigenic shift) chỉ có ở virus cúm, và rất ít ở một số

virus RNA gây bệnh gia cầm khác, cho phép virus có khả năng biến chủng rất cao Hệ gen gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt của virus cúm A được 2

chủng virus cúm A khác nhau khi đồng nhiễm trong một tế bào trao đổi cho nhau, để có thể xảy ra sự hoà trộn (reassort) hoặc trao đổi (swap) các phân đoạn gen của hai chủng virus đó trong quá trình kết hợp lại RNA hệ gen, tạo

ra các trạng thái khác nhau của RNA hệ gen của các hạt virus mới từ hai RNA hệ gen của những virus ban đầu Kết quả là đã tạo ra thế hệ virus mới

có các phân đoạn gen kết hợp, và đôi khi giúp cho chúng có khả năng lây nhiễm ở loài vật chủ mới hoặc gia tăng độc lực gây bệnh (Hình 1.7) [18], [35]

• Hiện tượng glycosyl hóa

Glycosyl hóa (glycosylation) là sự gắn kết của một chuỗi carborhydrate

(oligosaccharide) vào với amino acid asparagine (N) ở một số vị trí nhất định

trong chuỗi polypeptide HA hay NA, hay một số polypeptide khác của virus cúm Thông thường chuỗi oligosaccharide được gắn tại vị trí N – X - S/T (N = Asparagine; X = amino acid bất kì, trừ Proline; S/T = Serine hoặc Threonine) [14] Đây là những vị trí được cho là gắn kết với các kháng thể được cơ thể sinh

ra do kích thích của kháng nguyên, nhằm bảo vệ cơ thể nhiễm Hiện tượng lệch kháng nguyên sinh ra đột biến điểm hình thành bộ mã của Asparagine, tạo tiền đề cho hiện tượng glycosyl hóa xảy ra khi tổng hợp chuỗi polypeptide HA hay NA, làm thay đổi biểu hiện đặc tính kháng nguyên của HA và NA, giúp cho virus thoát khỏi tác động miễn dịch bảo hộ của cơ thể chủ và điều hoà sự nhân lên của virus [4], [14], [35]

Hiện tượng “lệch kháng nguyên” và “glycosyl hóa” xảy ra liên tục theo thời gian, còn hiện tượng “trộn kháng nguyên” có thể xảy ra với tất cả các chủng của virus cúm A, khi đồng nhiễm trong một tế bào ở tất cả các loài vật chủ khác nhau Đây cũng chính là vấn đề đáng lo ngại của virus cúm A/H5N1 hiện nay, mặc dù virus này chưa có sự thích nghi lây nhiễm dễ dàng ở người, nhưng nó có khả năng gây bệnh được cho người, và rất có thể virus cúm A/H5N1 tái tổ hợp (vay mượn) gen HA hay NA, hoặc cả hai gen của các chủng virus cúm A đã thích nghi ở người, để tạo ra một biến chủng virus mới thích ứng lây nhiễm dễ dàng ở người, gây ra nguy cơ của một đại dịch cúm mới và đặt ra một định hướng mới trong phòng chống [18], [35]

Hình 1.7 Sơ đồ minh họa đột biến điểm của hiện tượng “kháng

nguyên” (antigenic drift) (A) và đột biến tái tổ hợp của hiện tượng

“trộn kháng nguyên” (antigenic shift) ở virus cúm A (B)

1.4 SẢN XUẤT VẮC XIN PHÒNG BỆNH CÚM A/H5N1

Sản xuất vắc xin phòng bệnh cúm A/H5N1 có quy mô sản xuất khác nhau

từ nhỏ đến lớn, đơn giản đến phức tạp như sau :

• Quy mô nghiên cứu

Đó là quy mô trong phòng thí nghiệm để nghiên cứu, kiểm tra các mẫu thử nghiệm

• Quy mô nhỏ

Là quy mô sản xuất vắc xin cúm ở mức vừa và nhỏ, sản phẩm vắc xin cúm đáp ứng một nhu cầu nhỏ, sản phẩm thu được sử dụng để thử nghiệm lâm sàng trên người trong các giai đoạn tiếp theo

• Quy mô lớn

Là quy mô sản xuất lớn với các trang thiết bị hiện đại đáp ứng số lượng

sản phẩm cho nhu cầu của thị trường, các vùng dịch trong nước và thế giới

1.4.1 Các công nghệ sản xuất vắc xin cúm

1.4.1.1 Công nghệ sản xuất vắc xin cúm trên trứng gà có phôi

Nuôi cấy virus trên trứng gà có phôi là phương pháp truyền thống, an toàn, tin cậy và đã được sử dụng để sản xuất vacxin cúm với quy mô công nghiệp trong hơn 60 năm qua, chưa có phương pháp nào thay thế được

Trứng gà có phôi 9 - 11 ngày tuổi được sử dụng để cấy virus Sau khi gây nhiễm virus, ủ trứng ở khoảng nhiệt độ 340C – 350C, có độ ẩm 60 - 85% Sau 72 giờ chuyển trứng vào buồng lạnh (40C) để qua đêm nhằm diệt phôi và làm co

mạch máu Ngày hôm sau thu hoạch dịch niệu nang rồi tiến hành các công đoạn tinh khiết virus và bất hoạt [1], [6]

Ưu điểm của công nghệ sản xuất vắc xin cúm trên trứng gà có phôi

• Đây là phương pháp sản xuất chuẩn thức được sử dụng rộng rãi hiện nay Với công nghệ này, hàng trăm triệu liều vắc xin cúm đã được sản xuất và được sử dụng an toàn trên thế giới

• Những chủng virus dùng trong sản xuất vắc xin cúm đã được tối ưu hóa để phát triển trên trứng Vấn đề giấy phép cũng như những phân tích cần thiết đã được thiết lập và có những chứng cứ thuyết phục

• Vốn đầu tư ban đầu để xây dựng nhà máy sản xuất ở qui mô vừa và nhỏ, giá thành vắc xin tương đối rẻ

Nhược điểm của công nghệ sản xuất vắc xin cúm trên trứng gà có phôi

• Đây là một dây chuyền riêng biệt cho việc sản xuất chỉ một loại vắc xin cúm Nếu nhu cầu vắc xin cúm đột ngột giảm xuống không tận dụng được cơ

sở vật chất đã được nâng cấp sang sản xuất loại vắc xin khác vì thế phải tính toán chi tiết khi đầu tư mở rộng sản xuất

• Nguồn cung cấp trứng sẽ hạn chế đặc biệt khi dịch xảy ra trên gà

• Chất thải rắn trong qui trình sản xuất sẽ chiếm 80% lượng nguyên liệu cung cấp, do đó, cần phải có hệ thống sử lý thích hợp

• Năng suất vắc xin sản xuất trên trứng: mỗi một chủng virus có những đặc tính phát triển trên trứng khác nhau [1], [6], [33]

1.4.1.2 Công nghệ sản xuất vắc xin cúm trên tế bào

Hiện nay có một số dòng tế bào đang được dùng trong nghiên cứu sản xuất vắc xin cúm: MDCK (tế bào thận chó Madin-Darby) được phân lập vào năm

1958 và được sử dụng rộng rãi trong sản xuất vắc xin cho vật nuôi; Vero (tế bào thận khỉ xanh châu Phi) đã được dùng để sản xuất vắc xin bại lệt trong hơn 20

năm; PER.C6 (tế bào võng mạc người) là dòng tế bào mới được sử dụng trong nuôi cấy tế bào

Các dòng tế bào khác: Một vài dòng tế bào khác có thể phù hợp đối với việc sản xuất vắc xin cúm Tế bào nguyên bào sợi phôi gà (đã được dùng để sản xuất vắc xin sởi) có năng suất tốt với virus cúm Dòng tế bào Vivalis có nguồn gốc từ gà (Nantes, Pháp), đang được nghiên cứu trong vài năm gần đây cũng cho thấy có nhiều hứa hẹn [1], [6]

Ưu điểm của công nghệ sản xuất vắc xin cúm trên tế bào

Nuôi cấy virus cúm trên tế bào sẽ khắc phục được một số nhược điểm của phương pháp sản xuất trên trứng gà có phôi Những thuận lợi của phương pháp này so với phương pháp sản xuất trên trứng gà có phôi bao gồm:

• Không cần phải dùng đến lượng trứng gà lớn Nguồn cung cấp nguyên liệu bảo đảm và có thể dự trữ

• Quy trình này có thể tăng quy mô lên nhanh chóng do sử dụng được công nghệ trong nhà máy sản xuất các vắc xin khác trên tế bào

• Nâng cao khả năng vô trùng trong quá trình sản xuất Tránh được nguy

cơ trứng có phôi nhiễm retrovirus

• Vắc xin không có thành phần trứng nên tránh được nguy cơ dị ứng cho những người có tiền sử dị ứng với protein của trứng

Nhược điểm của công nghệ sản xuất vắc xin cúm trên tế bào

• Chi phí sản xuất vắc xin cúm trên tế bào cao hơn so với phương pháp truyền thống Các quy trình kiểm định phức tạp hơn như phải phát hiện DNA của

tế bào chủ Những kỹ thuật này đòi hỏi phương tiện và phải chuẩn thức

• Tốn thời gian và chi phí để phát triển đủ lượng tế bào cho sản xuất từ ngân hàng tế bào gốc

• Các tế bào dùng để sản xuất vắc xin thường yêu cầu phải có hồ sơ mô

tả toàn bộ đặc tính của tế bào và hồ sơ về ngân hàng tế bào gốc của nhà sản xuất,

mà chúng thường được cấp sở hữu trí tuệ nên đòi hỏi phải xin giấy phép [1], [6], [33]

1.4.1.3 Một số các phương pháp sản xuất vắc xin cúm khác

Nuôi cấy trên nguyên bào sợi phôi gà:

Đây có thể là phương pháp nhanh nhất để mở rộng quy mô sản xuất vắc xin cúm, áp dụng đối với các nhà sản xuất đã sử dụng phương pháp này trong sản xuất các vắc xin khác

Phương pháp sản xuất này cần sự đầu tư vừa phải về kinh phí và thời gian Tuy nhiên phương pháp này cũng có những bất lợi như đòi hỏi phải có trứng

sạch SPF, huyết thanh bào thai bê …

Vắc xin DNA

Vắc xin chứa DNA của HA và NA được tiêm trong da dưới dạng đạn bọc DNA (hãng PowderMed, Oxford Anh) Vì DNA có thể được sản xuất nhanh chóng cho nên vắc xin này đang thu hút sự quan tâm của các nhà chuyên môn Tuy nhiên quy trình công nghệ phức tạp và quyền sở hữu trí tuệ gây khó khăn cho việc triển khai rộng rãi loại vắc xin này

Vắc xin HA theo kiểu vector và tái tổ hợp

Kháng nguyên HA được sản xuất bởi hệ thống virus baculo (hãng Protein

Sciences Corporation, Mỹ) hoặc trong thực vật cấy DNA của virus (hãng Microbix, Mỹ) Ưu điểm của dạng vacxin này là năng xuất kháng nguyên cao và sản xuất nhanh Tuy nhiên khả năng đáp ứng miễn dịch bị hạn chế

1.4.2 Sản xuất vắc xin cúm quy mô lớn tại Viện vắc xin và sinh phẩm y tế (IVAC) 1.4.2.1 Điều kiện sản xuất:

Nhà máy đạt chuẩn GMP-WHO để sản xuất vắc xin cúm với công suất 1

- 3 triệu liều vắc xin/năm được trang bị đầy đủ các trang thiết bị hiện đại nhất thế giới như : Lò ấp trứng, máy gặt trứng, máy hút dịch, máy li tâm 2000 vòng/ phút, máy siêu ly tâm 30000 vòng/phút, hệ thống lọc trong, bơm hút…

1.4.2.2 Tóm tắt quy trình công nghệ

Quy trình sản xuất vắc xin Cúm H5N1

Hình 1.8 Quy trình sản xuất vắc xin cúm H5N1

Thuyết minh quy trình : Quy trình sản xuất theo dạng bán tự động

gồm các bước chính:

• Trứng (2 ngày tuổi) được chuyển bằng xe trứng từ trại chăn nuôi gà Suối Dầu sẽ được đưa vào phòng chọn trứng, tại đây loại những quả trứng không đạt tiêu chuẩn chất lượng

• Trứng đạt tiêu chuẩn được xếp khay cho vào lo ấp trong thời gian 11 ngày

• Soi trứng loại bỏ các trứng yếu, dễ chết

• Gây nhiễm bằng máy gây nhiễm