Phản ứng HA
• Nguyên tắc phản ứng:
Kháng nguyên cần xác định hiệu giá được pha lỗng bậc 2 thành các độ pha khác nhau trên phiến nhựa 96 giếng, đáy chữ U hoặc V. Sau đĩ bổ sung dung dịch hồng cầu gà 1%. Nếu trong giếng cĩ kháng nguyên hemagglutinin sẽ ngưng kết hồng cầu và khơng cho hồng cầu lắng xuống đáy giếng. Ngược lại, nếu khơng bị kháng nguyên gây ngưng kết, hồng cầu sẽ lắng xuống đáy giếng tạo một chấm nhỏ màu đỏ.
• Các bước tiến hành:
- Pha lỗng mẫu theo tỉ lệ 1/10 (50µl mẫu + 450µl PBS pH = 7,2)
- Đánh dấu mẫu thử, chứng dương (WSL), chứng âm (dịch niệu nang trứng 11 ngày tuổi khơng gây nhiễm virus), chứng hồng cầu trên phiến, mỗi mẫu thực hiện đúp
- Cho 50 µl PBS7,2 + 0,5%BSA vào tất cả các giếng trừ hàng (cột) đầu tiên.
- Cho 100 µl mẫu thử đã pha lỗng vào cột (hàng) đầu tiên
- Dùng multichanel pha lỗng mẫu theo bậc 2 trên phiến bằng cách chuyển liên tiếp 50 µl mẫu thử từ giếng đầu tiên sang các giếng kế tiếp cho đến giếng cuối cùng thì bỏ đi 50 µl
- Chứng dương pha lỗng như mẫu thử
- Chứng âm, chứng hồng cầu khơng pha lỗng
- Thêm 50 µl dung dịch hồng cầu gà 1% vào tất cả các giếng
- Lắc đều, đậy nắp phiến. Để yên ở nhiệt độ phịng trong khoảng 45 phút và đọc kết quả
36
Bảng 2.4 : Sơ đồ phản ứng ngưng kết hồng cầu Pha
lỗng bậc 2 Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4 Mẫu 5 Giếng đối chứng
A=1/10 B= 1/20 C= 1/40 D= 1/80 Chứng hồng cầu E= 1/160 F= 1/320 G= 1/640 H= 1/1280 Chứng kháng nguyên • Kết quả và cách tính kết quả:
Dựng thành phiến lên theo chiều đứng, giữ trong 5 - 10 phút đợi cho chứng âm hoặc chứng hồng cầu chảy xuống thành giếng hồn tồn. Đặt phiến trên gương để đọc kết quả. Kết quả dương tính khi hồng cầu bị ngưng kết khơng chảy xuống thành giếng khi dựng phiến theo chiều đứng.
- Hiệu giá ngưng kết hồng cầu là độ pha lỗng cao nhất của kháng nguyên mà vẫn cịn gây ngưng kết hồng cầu. Giá trị nghịch đảo của độ pha lỗng là hiệu giá ngưng kết của kháng nguyên được tính bằng 1 đơn vị HA.
- Ví dụ: Kháng nguyên dùng trong phản ứng được pha lỗng từ 1/10 đến 1/1280, độ pha lỗng thấp nhất vẫn cho phản ứng (+) là 1/160 thì kháng nguyên đĩ cĩ 160 đơn vị HA.
• Đọc kết quả:
Điều kiện để thử nghiệm cĩ giá trị tin cậy:
- Chứng dương: phải gây ngưng kết hồng cầu đúng theo đơn vị kháng nguyên đã biết trước.
- Chứng âm: khơng cĩ hiện tượng gây ngưng kết hồng cầu. - Chứng hồng cầu: khơng cĩ hiện tượng gây ngưng kết hồng cầu
37
Xác định liều gây nhiễm EID50
Nguyên tắc
Virus cúm cĩ khả năng sống và nhân lên trong dịch niệu của trứng gà cĩ phơi và dương tính với phản ứng ngưng kết hồng cầu.
Pha lỗng mỗi mẫu thành 10 độ pha. Mỗi độ pha lỗng tiêm 0,1 ml chủng pha lỗng/1 quả trứng vào dịch niệu nang, thực hiện 10 quả. Ủ 3 ngày, thu dịch và làm phản ứng HA. Nếu cĩ virus trong túi dịch thì sẽ cĩ ngưng kết hồng cầu trong phiến. Chủng pha lỗng là nguyên nhân gây hiện tượng ngưng kết hồng cầu 50% trứng gọi là EID50%. EID50 càng cao thì nồng độ virus ở mẫu càng nhiều.
Cách thực hiện
• Chuẩn bị trứng
- 10 quả cho mỗi độ pha mẫu thử - 5 quả cho trứng ( - )
- 5 quả cho trứng ( + )
- Khử trùng trứng bằng cồn iodine 5% - Soi đánh dấu buồng khí và vị trí tiêm - Đục lỗ tại vị trí tiêm
• Chuẩn bị mẫu thử:
Pha lỗng mẫu thử nghiệm thành các độ pha sau:
Bảng 2.5. Cách pha lỗng mẫu thử nghiệm thành các độ pha khác nhau. Độ pha (PFU/ml) MẪU (ml) PBS(ml) 1 2,5 0 10-1 0,5 (mẫu) 4,5 10-2 0,5 (10-1) 4,5 10-3 0,5 (10-2) 4,5 10-4 0,5 (10- 3) 4,5 10-5 0,5 (10-4) 4,5 10-6 0,5 (10-5) 4,5 10-7 0,5 (10-6) 4,5 10-8 0,5 (10-7) 4,5 10-9 0,5 (10-8) 4,5 10-10 0,5 (10-9) 4,5
38
• Tiêm trứng và theo dõi
- Tiêm 0,1 ml mẫu thử đã pha lỗng / quả trứng, thực hiện 10 quả trứng ở mỗi độ pha từ 10-6 đến 10-10
- Tiêm 0,1 ml PBS cho 5 trứng (chứng - )
- Tiêm 0,1 ml chủng virus WSL cho 5 trứng ( chứng +)
- Sát trùng trứng bằng dung dịch cồn iodine 5% trước và sau khi tiêm tại điểm tiêm.
- Tất cả trứng được đưa vào tủ ủ trứng 350C /72 giờ / độ ẩm 65-70% - Sau 72h soi trứng xác định trứng sống ở mỗi độ pha
- Đặt tồn bộ trứng sống vào tủ lạnh 40C trong 4 giờ để giết phơi. - Gặt 0,5 ml dịch niệu của mỗi quả trứng vào tuýp chữ V 1,5ml.
• Phản ứng HA:
- Cho 50 µl PBS + 0,5% BSA vào tất cả các giếng của phiến - Thêm 50 µl hồng cầu gà 1% vào tất cả các giếng của phiến - Thêm 50 µl dịch trứng đã thu hoạch ở mỗi độ pha vào các giếng
của phiến
- Lắc đều, ủ phiến nhiệt độ phịng 45 phút - Đọc kết quả:
- Ví dụ: Cách tính EID50, thể hiện ở bảng 2.6
Bảng 2.6. Kết quả EID50 của chủng giống được xác định bằng phương pháp Reed- Muench. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 C (+) C (-)
39
Bảng 2.7. Cách tính EID50 của liều gây nhiễm
HA Tổng tích lũy % Dương tính Độ pha Log độ pha Tổng số trứng sống Dương tính Âm tính Dương tính Âm tính % 10-6 6 10 10 0 22 0 100 10-7 7 10 8 2 12 2 86 10-8 8 10 4 6 4 8 33 10-9 9 10 0 10 0 18 0 10-10 10 10 0 10 0 28 0
EID50 được tính như sau:
Log 50% = log độ pha lỗng cao nhất ↑ 50% dương tính + khoảng cách * log 10 Khoảng cách = Log 50% = 7+ * log 10 Log 50%= 7+ 0,7 50% = 107,7 EID50 (0,1 ml) = 107,7 EID50 (ml) = 108,7
• Điều kiện để phản ứng cĩ ý nghĩa:
- Trứng sạch: khơng cĩ nấm mốc, vi khuẩn …
- Chứng (-): Sử dụng PBS khơng gây ra phản ứng ngưng kết hồng cầu - Chứng (+) : Sử dụng chủng gốc gây nhưng kết hồng cầu
- Lớn hơn 80% trứng phải sống trong mỗi độ pha
- Lớn hơn 50% trứng trong sự pha lỗng thấp nhất phải (+) - Nhỏ hơn 50% trứng trong sự pha lỗng cao nhất phải (+)
40
Chương III
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN