Tầm quan trọng
Phát triển quy trình nuơi cấy cĩ là vơ cùng quan trọng, để tăng được lượng sản phẩm để đáp ứng được nhu cầu khi dịch cúm xảy ra.
Đặc tính chủng virus cúm A/ H5N1 và quy trình nuơi cấy
• Cách tạo ra chủng virus cúm A/H5N1
25
Kĩ thuật di truyền ngược (reverse genetics) là một thuật ngữ được sử dụng trong ngành virus học phân tử để chỉ việc tạo ra virus từ cDNA tách dịng. Hệ thống di truyền ngược đầu tiên được áp dụng cho virus RNA sợi dương từ năm 1978. Khác với virus RNA sợi dương, các gen của virus RNA sợi âm khơng cĩ khả năng tự lây nhiễm. Do đĩ việc phiên mã và tái bản virus sợi âm địi hỏi sự đồng biểu hiện của phức hệ polymerase virus và sự tạo thành phức hệ giữa RNA và nucleoprotein.[21]
Năm 1994, Conzelmann và cộng sự, với virus dại tái tổ hợp, lần đầu tiên đã chứng minh được khả năng tạo ra virus RNA sợi âm hồn tồn từ cDNA tách dịng.Yếu tố quyết định thành cơng này là sự tổng hợp (+) antigenome từ cDNA để khơng bắt cặp với (+) mRNA, vì thế khơng cản trở quá trình tái bản virus. Hơn nữa genome của virus chứa chuỗi uridine và cấu trúc kẹp tĩc tương tự như T7 terminator, nên nếu dùng genome này làm khuơn thì sẽ dẫn đến sự phiên mã khơng hồn chỉnh. Phương pháp này được áp dụng cho Rhabdovirus, Paramyxovirus và Ebola virus (thuộc họ Filoviridae). Những kinh nghiệm rút ra được bao gồm: biểu hiện T7 RNA polymerase trong những dịng tế bào ổn định, thiết kế những plasmid biểu hiện protein và những kỹ thuật sốc nhiệt để nâng cao hiệu suất tái bản virus.
Việc tạo ra virus cúm phức tạp hơn nhiều vì quá trình tái bản virus cần đủ 8 phân đoạn và 4 protein. Hơn nữa, virus cúm tái bản trong nhân tế bào bị nhiễm, nên các vRNA và protein phải đi vào được trong nhân. Hobom và cộng sự đã sử dụng hệ RNA polymerase I để sinh tổng hợp vRNAs (của virus cúm) nội bào. Hệ RNA pol I bao gồm 1 cDNA của virus cúm nằm giữa RNA pol I promoter và terminator. Cũng nhờ giải pháp này, năm 1999, virus cúm đã được tạo ra từ plasmid mà khơng cần sự cĩ mặt của virus trợ giúp. Hiệu suất của phương pháp này là tạo ra 108 virus (cĩ khả năng lây nhiễm)/ml huyền phù tế bào sau 2 ngày chuyển nhiễm.
Hoffmann và Webster đã cải tiến hệ RNA pol I trên nhằm tổng hợp được cả (-) vRNA và (+) mRNA từ cùng một khuơn, nhờ đĩ giảm được số lượng plasmid cần thiết (12 → 8 plasmid). Plasmid chủng A/WSN/33 (H1N1) được tạo thành cơng bằng phương pháp này với hiệu suất 1×103 virus/ml
26
huyền phù tế bào sau 24 giờ nuơi cấy. Tác dụng gây độc tế bào xuất hiện sau 48 giờ và hiệu suất virus thu được sau 72 giờ là 2×107 virus/ml. Chủng A/WSN/33 tái tổ hợp cĩ nguồn gốc từ chủng gây đại dịch cúm ở người (1918) cĩ khả năng tái bản trong não chuột và phát triển trong hệ tế bào nuơi cấy (tế bào MDCK và 293T).
Bằng cách này chủng vắc xin NIBRG-14 ra đời được TCYTTG cơng nhận và khuyến cáo là chủng sản xuất vắc xin chính thức (hình 1.8).
Sử dụng tế bào Vero, Nicolson và cộng sự đã tạo thành cơng những chủng virus tái tổ hợp khác nhau cĩ khả năng tái bản cao trong trứng hoặc tế bào MDCK. Những chủng này đều cĩ tính kháng nguyên giống chủng gốc (chứa HA và NA) ban đầu được kiểm tra độc tính trên gà và chuột. HA được loại đoạn độc bằng cách PCR riêng rẽ từng phân đoạn HA1 và HA2, sau đĩ gắn hai phân đoạn lại nhờ hai đầu dính tại vị trí SapI, nhân sản phẩm gắn kết (recombinant PCR) để gắn vào vector pPST phục vụ cho biến nạp. Bằng phương pháp này, nhĩm nghiên cứu đã tạo được chủng NIBRG-14 khơng độc trong vịng 20 ngày, đạt tiêu chuẩn để sử dụng làm chủng sản xuất Vắc xin. Tồn bộ quá trình được thực hiện trong phịng thí nghiệm cĩ độ an tồn sinh học cao (BSL 4).
Tế bào 293T được biến nạp với những plasmid được đánh dấu (+). Sau 48 hoặc 72 giờ, hiệu giá virus được xác định bằng kỹ thuật vết tan trên tế bào MDCK. 3 thí nghiệm được lặp lại và lấy kết quả trung bình. Tất cả các giá trị TCID50/ml phản ánh số liệu thu được sau 48 giờ nhiễm nạp.
Cách tạo ra chủng virus cúm A/H5N1 cĩ khả năng nhân lên bằng cơng nghệ phơi trứng gà ở hình 1.9 [1], [2].
27
Hình 1.9. Bằng kĩ thuật di truyền ngược chủng gốc NIBRG-14 được tạo ra từ 6 gen của virus A/PR8/34(H1N1) và 2 gen của virus A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), trong đĩ gen HA bị đột biến mất đoạn để giảm độc lực, cho phép virus
này tái tổ hợp này nhân lên bằng cơng nghệ phơi trứng gà
Hệ thống kể trên đã cho phép tạo ra virus tái tổ hợp theo nguyên tắc “6+2” một cách chính xác và khơng cần bất kỳ một kỹ thuật sàng lọc nào thêm. Để tăng thêm hiệu suất tạo thành virus, số lượng plasmid biến nạp vào tế bào đã được nghiên cứu. Cĩ thể nĩi việc sử dụng kĩ thuật di truyền ngược là một hướng đi hợp lý để tạo chủng virus phục vụ cho sản xuất vắc xin cúm gia cầm với tốc độ nhanh, áp dụng được trên dịng tế bào đã được cơng nhận, áp dụng được với mọi chủng virus gây bệnh thuộc các phân type khác nhau được cơng bố, loại bỏ được đoạn độc trên gene HA, tránh được sự tạp nhiễm (virus hoang dại từ dịng tế bào khơng chuẩn hoặc virus chứa các độc tố khác).
Chủng NIBRG-14 đã chứng minh được tính an tồn và tính ổn định di truyền và chính thức được TCYTTG cơng nhận là chủng dùng cho sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 cho người.
• Tiêu chuần chất lượng của chủng sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 (Tiêu chuẩn cơ sở)
Căn cứ theo các yêu cầu của TCYTTG qui định về việc dùng chủng virus cúm trong sản xuất vắc xin cúm, Viện Vắc xin đã xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cơ sở cho chủng dùng sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 như sau:
28
• Tiêu chuẩn chủng NIBRG-14 gốc giống (MSL)
- Nhận dạng: trình tự của gen HA và NA khơng khác biệt so với chủng nguyên gốc (theo TRS 927, 2005).
- Vơ trùng: khơng cĩ sự phát triển của vi khuẩn và nấm trên mơi trường nuơi cấy TSB và Thioglycolate (theo DĐVN IV, 2009).
- Hiệu giá kháng nguyên ngưng kết hồng cầu (HA/ml) phải ≥1/640 (dựa trên TRS 927, 2005)
- Hiệu giá chủng (EID50/ml) phải ≥ 106,5 (theo TRS 927, 2005)
• Tiêu chuẩn chủng NIBRG-14 làm việc (WSL)
- Vơ trùng: khơng cĩ sự phát triển của vi khuẩn và nấm trên mơi trường nuơi cấy TSB và Thioglycolate (theo DĐVN IV, 2009)
- Mycoplasma: khơng cĩ sự hiện diện của Mycoplasma gallisepticum, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mycoplasma synoviae và Mycobacterium avium (theo TRS 927, 2005).
- Hiệu giá kháng nguyên ngưng kết hồng cầu (HA/ml) phải ≥ 1/640 (TRS 927, 2005).
29
Chương II
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU