Bảng 3.5. Kết quả HA thử nghiệm đối với lơ 3
Đơn vị: HAU/ml V (ml) T( giờ) 340C - 350C 350C - 360C 360C - 370C 24 80 80 80 0,1 ml 48 80 80 80 72 80 160 80 24 80 80 80 0,2 ml 48 160 160 160 72 160 160 160 24 80 160 80 0,3 ml 48 160 160 160 72 160 160 160
45
Từ kết quả bảng 3.5 cho thấy:
Xét ảnh hưởng của thể tích tiêm đến quá trình nuơi cấy virus
• Hiệu giá HA ở thể tích tiêm V = 0,3 ml cao nhất
• Hiệu giá HA ở thể tích tiêm V = 0,2 ml thấp hơn tại V = 0,3 ml khơng
đáng kể.
• Hiệu giá HA ở thể tích tiêm V= 0,1 ml thấp nhất trong 3 thể tích tiêm.
Xét ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình nuơi cấy virus
• Ở khoảng nhiệt độ 350C - 360C cĩ hiệu giá HA cao nhất
• Khoảng nhiệt độ 340C - 350C cĩ hiệu giá HA thấp hơn so với khoảng nhiệt độ 350C - 360C
• Khoảng nhiệt độ 360C - 370C cĩ hiệu giá HA thấp nhất trong 3 khoảng
nhiệt độ
Xét ảnh hưởng của thời gian đến quá trình nuơi cấy virus
• Ở 72 giờ cĩ hiệu giá HA cao nhất
• Ở 48 giờ cĩ hiệu giá HA thấp hơn 72 giờ • Ở 24 giờ cĩ hiệu giá HA thấp nhất
Kết luận : Ở thể tích tiêm V = 0,3 ml, khoảng nhiệt độ 350C - 360C , thời gian 72 giờ cĩ giá trị HA cao và ổn định
Bảng 3.6. Kết quả kiểm nghiệm EID50 đối với lơ 3 theo ảnh hưởng của nhiệt độ Đơn vị: EID50/ml V (ml) T (Giờ) 340C - 350C 350C - 360C 360C - 370C 24 7,92 8,00 7,65 0,1 ml 48 7,75 7,76 7,74 72 7,85 8,10 7,82 24 7,84 7,91 7,71 0,2 ml 48 7,91 8,00 7,84 72 8,09 8,18 8,10 24 7,91 7,83 7,89 0,3 ml 48 8,00 8,09 7,79 72 8,10 8.,29 8,11
46
Từ kết quả bảng 3.6 cho thấy:
Xét ảnh hưởng của thể tích tiêm đến quá trình nuơi cấy virus
• Giá trị EID50 ở thể tích tiêm V = 0,3 ml cao nhất
• Giá trị EID50 ở thể tích tiêm V = 0,3 ml thấp hơn tại V = 0,3 ml khơng
đáng kể.
• Giá trị EID50 ở thể tích tiêm V= 0,1 ml thấp nhất trong 3 thể tích tiêm.
Xét ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình nuơi cấy virus
• Ở khoảng nhiệt độ 350C - 360C cĩ giá trị EID50 cao nhất
• Khoảng nhiệt độ 340C - 350C cĩ giá trị EID50 thấp hơn so với khoảng nhiệt độ 350C - 360C
• Khoảng nhiệt độ 360C - 370C cĩ giá trị EID50 thấp nhất trong 3 khoảng
nhiệt độ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Xét ảnh hưởng của thời gian đến quá trình nuơi cấy virus
• Ở 72 giờ cĩ giá trị EID50 cao nhất
• Ở 48 giờ cĩ giá trị EID50 thấp hơn 72 giờ • Ở 24 giờ cĩ giá trị EID50 thấp nhất
Kết luận : Ở thể tích tiêm V = 0,3 ml, khoảng nhiệt độ 350C - 360C , thời gian 72 giờ cĩ giá trị EID50 cao và ổn định
Với thể tích tiêm V =0,2 ml, khoảng nhiệt độ 350C - 360C và thời gian 72 giờ là điều kiện nuơi cấy tối ưu cho chủng virus
47
Chương IV
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. KẾT LUẬN
Virus Cúm H5N1 phát triển tối ưu ở điều kiện nuơi cấy như sau:
• Nhiệt độ từ 350C - 360C. • Thời gian 72h.
• Thể tích tiêm V = 0,2 ml.
2. KIẾN NGHỊ
Từ các nghiên cứu ở trên, cho phép kiến nghị như sau:
• Nuơi cấy chủng virus NIBRG - 14 ở thể tích tiêm V = 0,2 ml, nhiệt độ
350C - 360C, thời gian 72h.
• Tiếp tục đánh giá tính ổn định của quy trình sản xuất vắc xin cúm và
thẩm định chất lượng của 03 lơ vắc xin sản xuất thử nghiệm.
48
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TRONG NƯỚC
1. Lê Trần Bình (2007), Nghiên cứu xây dựng qui trình sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho gia cầm năm 2006 - 2007, Báo cáo tổng kết đề tài độc lập cấp nhà nước, Trung tâm Thơng tin và Tư liệu Quốc gia và Bộ Khoa học và Cơng nghệ, Hà Nội.
2. Lê Trần Bình, Lê Thanh Hịa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nơng Văn Hải, Nguyễn Thị Bích Nga, Trương Nam Hải (2006), Phân tích mối tương đồng kháng nguyên và miễn dịch của virus cúm A, các chủng cường độc đương nhiễm và các chủng vaccine cúm A/H5N1, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 4(3): 291-296.
3. Bộ Y tế (2002), Dược điển Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
4. Phan Văn Chi, Lê Thanh Hịa, Đinh Duy Kháng, Nơng Văn Hải, Trương Nam Hải, Nguyễn Thị Bích Nga, Quyền Đình Thi, Phạm Việt Cường, Lê Trần Bình (2008), Phân tích đặc tính glycosyl hĩa gen kháng nguyên H5 ở các chủng virus cúm A/H5N1 vaccine và cường độc gây bệnh, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học (đã nhận đăng).
5. Nguyễn Tiến Dũng (2008), Vài nét về virus cúm gia cầm H5N1, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y 14(4): 80-86.
6. Lê Văn Hiệp (2006), Vắcxin học những vấn đề căn bản, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
7. Lê Thanh Hịa (2006), “Chiến lược nghiên cứu ứng dụng virus vector tái tổ hợp trong sản xuất vaccine thế hệ mới”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học
4(4): 397-416.
8. Lê Thanh Hịa (2006), Y-sinh học phân tử, quyển 1, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 9. Lê Thanh Hịa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nơng Văn Hải, Trương
Nam Hải, Lê Trần Bình (2004), “Virus cúm A của gia cầm và mối quan hệ lây nhiễm động vật sang người”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 2(1): 1-18.
10.Lê Thanh Hịa, Nguyễn Thị Bích Nga, Lê Trần Bình (2008), So sánh và phân tích đặc tính đột biến trượt-xĩa gen NA(N1) theo thời gian tiến hĩa (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
49
của virus cúm A/H5N1 ở các chủng của Việt Nam và thế giới, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 6(2): 153-159.
11.Nguyễn Thị Lan Phương, Lê Văn Hiệp (2006), Nghiên cứu sản xuất vaccine phịng chống cúm A/H5N1 cho người trên phơi gà từ chủng NIBRG-14 tại Viện vaccine và sinh phẩm y tế, Tạp chí Y học dự phịng
5(84): 5-10.
12.Bạch Thi Như Quỳnh (2006), Nghiên cứu tạo giống từ chủng gốc NIBRG - 14 để phục vụ sản xuất vaccine cúm H5N1, Luận văn Thạc sĩ sinh học, Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật.
13.Nguyễn Thị Kim Tiến (2005), Dịch tễ học, virus học bệnh cúm A(H5N1) trên người tại khu vực phía Nam, Tạp chí Y học thực hành 517(8): 46-49.
TÀI LIỆU NƯỚC NGỒI
14.Baigent SJ, McCauley JW (2001), Glycosylation of haemagglutinin and stalk-length of neuraminidase combine to regulate the growth of avian influenza viruses in tissue culture. Virus Res 79(1-2): 177-185.
15.Basler CF (2007), Influenza viruses: basic biology and potential drug targets. Infect Disord Drug Targets 7(4): 282-93.
16.Bender C, Hall H, Huang J, Klimov A, Cox N, Hay A, Gregory V, Cameron K, Lim W and Subbarao K (1999), Characterization of the surface proteins of influenza A (H5N1) viruses isolated from humans in 1997 – 1998, Virology 254: 115-123.
17.Fang LQ, de Vlas SJ, Liang S, Looman CW, Gong P, Xu B, Yan L, Yang H, Richardus JH, Cao WC (2008), Environmental factors contributing to the spread of H5N1 avian influenza in mainland China. PLoS o¬nE 3(5): e2268.
18.Hilleman M (2002), Realities and enigmas of human viral influenza: pathogenesis, epidemiology and control. Vaccine 20(25-26): 3068-3087. 19.Horimoto T, Kawaoka Y (2001), Pandemic threat posed by avian
50
20.Horimoto T, Kawaoka Y (2006), Strategies for developing vaccines against H5N1 influenza A viruses. Trends Mol Med 12(11): 506-514. 21.Ito T, Couceiro JN, Kelm S, Baum LG, Krauss S, Castrucci MR, Donatelli I,
Kida H, Paulson JC, Webster RG and Kawaoka Y (1998), Molecular basis for the generation in pigs of influenza A viruses with pandemic potential. J Virol 72: 7367-7373.
22.Murphy BR, Webster RG (1996), Orthomyxoviruses. In Fields BN, Knipe DM, Howley PM, (eds.) Fields Virology, 3rd ed, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia: 1397-1445.
23.Nayak D, Hui E, Barman S (2004), Assembly and budding of influenza virus, Virus Res 106(2):147-165.
24.Nicholson KG, Wood JM, Zambon M (2003), Influenza, Lancet 362(93970: 1733-1745.
25.Nicolson C, Major D, Wood JM, Robertson JS (2005)
26.OIE - World organisation for animal health (2005), Avian influenza, Manual of diagnostic test and vaccines for terrestrial animals, (http://www.oie.int/ Eng/info_ev/en_AI_avianinfluenza.htm)
27.Prel A, Le Gall-Reculé G, Jestin V (2008), Achievement of avian influenza virus-like particles that could be used as a subunit vaccine against low-pathogenic avian influenza strains in ducks. Avian Pathol 37(5): 513-520.
28.Suzuki Y (2005), Sialobiology of influenza: molecular mechanism of host range variation of influenza viruses. Biol Pharm Bull 28(3): 399-408. Review
29.Webster RG (1998), Influenza: an emerging disease, Emerg Infect Dis 4: 436-441. 30. Weber TP, Stilianakis NI (2007), Ecologic immunology of avian influenza (H5N1) in migratory birds. Emerg Infect Dis 13(8): 1139-1143.
30. “Who expert committee on biological standardization, world health organization, geneva 2005”
31.WHO/OIE/FAO H5N1 Evolution Working Group (2008), Toward a unified nomenclature system for highly pathogenic avian influenza virus (H5N1).
51
CÁC TRANG WEB ĐÃ THAM KHẢO
32.“Avian influenza”, http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/en
33.http://www.soytedaklak.gov.vn/modules.php?name=News&opcase=de tailsnews&mcid=331&mid=1848
34.http://www.kilobooks.com/threads/58487-Tổng-quan-về-virus-cúm-A- H5N1-vấn-đề-dịch-tễ-học-tiến-hĩa-hình-thành-genotype-và-tương- đồng-kháng-nguyên-miễn-dịch-vaccine#ixzz1zEu9ixws (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Thành phần dung dịch đệm PBS (Phosphate Buffer Saline) 0.01M, pH =7.2 STT Thành phần Số lượng Đơn vị 1 NaCl 8.015 G 2 Na2HPO4.7H20 2.6807 G 3 KH2PO4 0.0408 G 4 Nước cất 1000 Ml
Đo pH, chỉnh pH =7.2. Khử trùng 0.8 atm, 15 phút. Bảo quản 40C
Phụ lục 2: Pha dung dịch hồng cầu gà 1%
STT Thành phần Số lượng Đơn vị 1 Hồng cầu 10% 4 Ml 2 Dung dịch PBS 0.01M + 0.5% BSA 36 Ml Phụ lục 3: Thành phần dung dịch PBS 7.2+ 0.5% BSA STT Thành phần Số lượng Đơn vị 1 BSA 0.5 G 2 Dung dịch đệm PBS 0.01M, pH =7.2 100 Ml
Phụ lục 4: Tiêu chuẩn chủng NIBRG-14 gốc giống (MSL)
STT Chỉ tiêu Phương pháp Tiêu chuẩn chấp nhận
Tiêu chuẩn áp
dụng
1 Vơ trùng
Nuơi cấy trực tiếp trên mơi trường TSB và Thioglycolate
Khơng cĩ sự phát triển của vi khuẩn và nấm trên cả 2 loại mơi trường nuơi cấy DĐVN IV, 2009 2 Hiệu giá kháng nguyên ngưng kết hồng cầu (HA/ml) Phản ứng ngưng kết với hồng cầu gà (CRBC) ≥ 1/640 TCCS dựa trên TRS 927, 2005 3 Hiệu giá chủng (EID50/ml) Chuẩn độ trên trứng gà cĩ phơi 10 ngày tuổi ≥ 106,5 TCCS dựa trên TRS 927, 2005
Phụ lục 5: Tiêu chuẩn chủng NIBRG-14 làm việc (WSL)
TT Chỉ tiêu Phương pháp Tiêu chuẩn chấp nhận
Tiêu chuẩn áp
dụng
1 Vơ trùng
Nuơi cấy trực tiếp trên mơi trường
TSB và Thioglycolate
Khơng cĩ sự phát triển của vi khuẩn và nấm trên cả 2
loại mơi trường nuơi cấy
DĐVN IV, 2009
2 Nhận dạng
Khuếch đại và giải trình tự 2 gen mã hĩa protein HA và
NA
Trình tự của gen HA và NA khơng khác biệt so với
chủng nguyên gốc TRS 927, 2005 3 Xác định khơng cĩ sự hiện diện của Mycoplasma PCR hoặc phương pháp nuơi cấy
Khơng cĩ sự hiện diện của
Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae và Mycobacterium avium TRS 927, 2005 4 Hiệu giá kháng nguyên ngưng kết hồng cầu (HA/ml) Phản ứng ngưng kết với hồng cầu gà (CRBC) ≥ 1/640 TCCS dựa trên TRS 927, 2005 5 Hiệu giá chủng (EID50/ml) Chuẩn độ trên trứng gà cĩ phơi 10 ngày tuổi ≥ 106,5 TCCS dựa trên TRS 927, 2005
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});