Khảo sát điều kiện nuôi cấy chủng virus NIBRG 267 (a shanghai 2 2013(H7N9)xPR8) trên trứng gà có phôi để sản xuất vắc xin cúm a h7n9 ở quy mô công nghiệp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG - - TRẦN THỊ THÚY NGA KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY CHỦNG VI RÚT NIBRG-267 (A/SHANGHAI/2/2013(H7N9)XPR8) TRÊN TRỨNG GÀ CĨ PHƠI ĐỂ SẢN XUẤT VẮC XIN CÚM A/H7N9 Ở QUY MÔ CÔNG NGHIỆP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC GVHD : ThS DƯƠNG HỮU THÁI : ThS KHÚC THỊ AN NHA TRANG – 07/2016 i LỜI CẢM ƠN Từ lòng biết ơn sâu sắc mình, em xin dành trang đồ án để bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến: Ban giám hiệu trường Đại học Nha Trang, Phịng Đào tạo, Ban giám đốc Viện Cơng nghệ Sinh học Mơi trường tồn thể q thầy giảng dạy tận tình giúp đỡ em trình học tập trường Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Vắc xin Nha Trang tạo điều kiện thuận lợi cho em thực tập Viện Thạc Sỹ Dương Hữu Thái (Viện phó Viện Vắc xin Sinh phẩm Y tế Nha Trang), người thầy quan tâm hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho em trình thực tập Viện Anh Đàm Xuân Cường, Chị Nguyễn Thùy Đoan, tồn thể anh chị – phịng Vắc xin cúm trực tiếp hướng dẫn, bảo nhiệt tình, chu đáo tạo điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành đồ án Thạc Sỹ Khúc Thị An nhiệt tình giúp đỡ, góp ý động viên em thời gian thực tập hoàn thành đồ án Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, anh chị, em quan tâm, giúp đỡ, chia sẻ, động viên em suốt thời gian qua Nha Trang, tháng năm 2016 Sinh viên Trần Thị Thúy Nga ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan vi rút A/H7N9 1.1.1 Vi rút cúm A/H7N9 1.1.2 Tình hình mắc bệnh Cúm A/H7N9 người giới Việt Nam 14 1.2 Tổng quan vắc xin cúm 18 1.2.1 Vắc xin cúm 18 1.2.2 Các loại vắc xin cúm 19 1.2.3 Các công nghệ sản xuất vắc xin cúm 22 1.2.4 Nghiên cứu sản xuất vắc xin H7N9 nước 25 1.2.5 Quy trình sản xuất vắc xin IVAC 28 1.2.6 Tiêu chuẩn vắc xin 29 1.3 Quy mô sản xuất vắc xin cúm 30 1.3.1 Các quy mô nghiên cứu sản xuất 30 1.3.2 Những yêu cầu quy mô sản xuất lớn 31 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Đối tượng nghiên cứu 33 2.2 Vật liệu 33 2.2.1 Trứng gà nguyên liệu 33 2.2.2 Thiết bị 33 2.2.3 Dụng cụ 33 2.2.4 Dung dịch 34 2.3 Phương pháp nghiên cứu 34 2.3.1 Xác định điều kiện tối ưu 36 iii 2.3.2 Phương pháp gây nhiễm vi rút trứng gà có phơi 11 ngày tuổi 37 2.3.3 Lấy mẫu dịch vi rút sau trứng gây nhiễm 37 2.3.4 Phương pháp kiểm tra chất lượng 38 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47 3.1 Kết khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình ni cấy vi rút cúm A/H7N9 lơ 47 3.1.1 Kết khảo sát hiệu giá HA 47 3.1.2 Kết khảo sát liều gây nhiễm (EID50) 49 3.1.3 Kết khảo sát hàm lượng HA (SRID) 51 3.2 Kết khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến q trình ni cấy vi rút cúm A/H7N9 lô 54 3.2.1 Kết khảo sát hiệu giá HA 54 3.2.2 Kết khảo sát liều gây nhiễm (EID50) 55 3.2.3 Kết khảo sát hàm lượng HA (SRID) 57 3.3 Kết khảo sát yếu tố ảnh đến q trình ni cấy vi rút cúm A/H7N9 lô 60 3.3.1 Kết khảo sát hiệu giá HA 60 3.3.2 Kết khảo sát liều gây nhiễm (EID50) 62 3.3.3 Kết khảo sát hàm lượng HA (SRID) 64 3.4 Xây dựng quy trình ni cấy 65 3.5 Thẩm định quy trình ni cấy vi rút cúm A/H7N9 xây dựng 66 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68 4.1 Kết luận 68 4.2 Kiến nghị 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 PHỤ LỤC 72 iv CÁC CHỮ VIẾT TẮT CAIV Cold-adapted Attenuated Influenza Vaccine (Vắc xin cúm giảm độc lực thích ứng lạnh) CDC Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm phịng ngừa kiểm sốt bệnh, Hoa kỳ) DĐVN Dược điển Việt Nam EID50 Egg Infectious Dose 50 (Liều gây nhiễm 50 vi rút trứng gà) FAO Food and Agriculture Organization (Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên Hợp Quốc) GMP Good manufacturing Practice (Thực hành sản xuất tốt) GSVS Giám sát vi sinh HA Haemagglutinin (Protein ngưng kết hồng cầu) HAU Haemagglutination Unit (Đơn vị Haemagglutinin) HI Haemagglutination Inhibition (Ức chế ngưng kết hồng cầu) HPAI Highly pathogenic avian ifluenza (Chủng vi rút cúm gia cầm độc lực cao) IVAC Institute of Vaccine and Medical Biological (Viện Vắc xin Sinh phẩm Y tế) LPAI Low pathogenic avian influenza (Chủng vi rút cúm gia cầm độc lực thấp) MDCK Madin-Darby Canine Kydney cells (Tế bào thận chó Madin-Darby) v MSL Master seed lot (Loạt chủng gốc giống) NA Neuraminidase (Enzyme bề mặt vi rút cúm) NIBSC National Institute for Biological Sandards and Control (Viện Quốc gia tiêu chuẩn kiểm định Sinh học, Anh) PBS Phosphate Buffer Saline (Dung dịch đệm photphat) PER.C6 Tế bào võng mạc người PR8 Chủng vi rút cúm A/H1N1/ có nguồn gốc từ Puerto Rico RIV Residual Infectious Virus (Vi rút sống tồn lưu) SPF Specific Pathogen Free (Không có tác nhân gây bệnh đặc biệt) SRID Single radial immuno diffusion (Khuyếch tán miễn dịch vòng đơn) TCYTTG Tổ chức Y tế Thế giới Vero Tế bào thận khỉ xanh Châu Phi WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) WSL Working seed lot (Loạt chủng sản xuất) vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Lấy mẫu thử nghiệm với liều lượng gây nhiễm V1=0,1ml 35 Bảng 2.2 Lấy mẫu thử nghiệm với liều lượng gây nhiễm V2=0,2ml 35 Bảng 2.3 Lấy mẫu thử nghiệm với liều lượng gây nhiễm V3=0,3ml 36 Bảng 2.4 Cách pha loãng mẫu thành độ pha khác để gây nhiễm 37 Bảng 2.5 Phản ứng ngưng kết hồng cầu phiến 96 giếng 39 Bảng 2.6 Cách pha loãng mẫu thành độ pha khác test EID50 40 Bảng 2.7 Cách tính EID50 liều gây nhiễm 41 Bảng 2.8 Cách lấy mẫu xử lý với Swittegent 43 Bảng 2.9 Cách pha kháng nguyên chuẩn 43 Bảng 2.10 Cách pha mẫu thử 44 Bảng 2.11 Vị trí cấy mẫu tiêu 45 Bảng 3.1 Kết qủa khảo sát hiệu giá HA lô 48 Bảng 3.2 Kết qủa khảo sát EID50 lô 50 Bảng 3.3 Kết qủa khảo sát SRID lô 52 Bảng 3.4 Kết qủa khảo sát hiệu giá HA lô 54 Bảng 3.5 Kết qủa khảo sát EID50 lô 56 Bảng 3.6 Kết qủa khảo sát SRID lô 58 Bảng 3.7 Kết qủa khảo sát hiệu giá HA lô 60 Bảng 3.8 Kết qủa khảo sát EID50 lô 62 Bảng 3.9 Kết qủa khảo sát SRID lô 64 Bảng 3.10 Kết trình thẩm định lô 66 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc vi rút cúm A (H7N9) Hình 1.2 Sự tái tổ hợp genome vi rút A/H7N9 Hình 1.3 Sơ đồ minh họa đột biến điểm tượng “kháng nguyên” (antigenic drift) (A) đột biến tái tổ hợp tượng “trộn kháng nguyên” (antigenic shift) vi rút cúm A (B) 11 Hình 1.4 Cơ chế xâm nhiễm nhân lên vi rút cúm A tế bào 12 Hình 1.5 Phân bố trường hợp mắc bệnh cúm A/H7N9 15 Hình 1.6 Số trường hợp mắc cúm A/H7N9 theo thời gian 16 Hình 1.7 Các hệ vắc xin cúm 20 Hình 1.8 Quy trình lõi sản xuất vắc xin cúm IVAC 28 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 34 Hình 2.2 Sơ đồ xác định điều kiện tối ưu 36 Hình 3.1 Kết qủa khảo sát hiệu giá HA lô 48 Hình 3.2 Kết qủa khảo sát EID50 lô 50 Hình 3.3 Kết qủa khảo sát SRID lô 52 Hình 3.4 Kết qủa khảo sát hiệu giá HA lô 54 Hình 3.5 Kết qủa khảo sát EID50 lô 56 Hình 3.7 Kết qủa khảo sát hiệu giá HA lô 60 Hình 3.8 Kết qủa khảo sát EID50 lô 62 Hình 3.9 Kết qủa khảo sát SRID lô 64 Hình 3.10 Quy trình ni cấy vi rút cúm A/H7N9 66 ĐẶT VẤN ĐỀ Dịch cúm gia cầm H7N9 xuất gây bệnh Trung Quốc vào tháng 2/2013 Từ đến nay, số ca mắc tử vong người tiếp tục tăng lên Thống kê Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG) Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc đến ngày 19/5/2016 tồn cầu ghi nhận 786 trường hợp dương tính với cúm A/H7N9 người (Trung Quốc (763), Đài Loan (4), Hồng Kơng (16), Malaysia (1) Canada (2)), 307 trường hợp tử vong Riêng trường hợp nhiễm cúm A/H7N9 báo cáo từ Malaysia Canada có tiền sử từ Trung Quốc TCYTTG nhận định vi rút A/H7N9 “một vi rút cúm gây nguy hiểm chết người đáng ý nhất” Nguồn gốc vi rút A/H7N9 xác định từ gia cầm gây bệnh cho người, chưa có chứng vi rút lây lan từ người sang người nguy bùng phát dịch khả lan tràn sang các quốc gia lớn Trước tình hình này, WHO (Tổ chức Y tế Thế giới) phát triển mở rộng chương trình phịng chống cúm tồn cầu nhằm tìm biện pháp kiểm sốt phịng ngừa nguy bùng phát đại dịch Tại Việt Nam, chưa phát trường hợp nhiễm cúm A/H7N9 Tuy nhiên, có đường biên giới dài với Trung Quốc, giao lưu lại, có trao đổi thương mại, dịch vụ du lịch phát triển, có tương đồng điều kiện địa lý khí hậu Do vậy, Chính phủ, Bộ Y tế ngành liên quan đánh giá nguy xâm nhập vi rút cúm A/H7N9 vào nước ta lớn Chính phủ Việt Nam Bộ Y tế chủ động đạo, lập kế hoạch triển khai nhiều biện pháp nhằm phát hiện, ngăn chặn phòng chống bệnh cúm có xuất Việt Nam Vắc xin biện pháp hữu hiệu để phịng ngừa, kiểm sốt đẩy lùi dịch bệnh nói chung bệnh cúm nói riêng Tuy vắc xin cúm sản xuất từ thập niên 60 tập trung nước Châu Âu Bắc Mỹ Với lực sản xuất vắc xin giới 300 triệu liều/năm, đại dịch cúm người xảy lượng vắc xin đáp ứng cho khoảng 10% dân số giới Việc sản xuất lượng vắc xin đủ đáp ứng nhu cầu sử dụng tồn giới cịn gặp khó khăn lực sản xuất quốc gia không đồng thách thức công nghệ Để giải vấn đề này, WHO (Tổ chức Y tế Thế giới) khuyến cáo tất nước, đặc biệt quốc gia Châu Á, chủ động nghiên cứu sản xuất vắc xin cúm A/H7N9 để kịp thời cung ứng cho nhu cầu bảo vệ sức khỏe cộng đồng xảy đại dịch Cùng với diễn biến phức tạp khó lường vi rút cúm A/H7N9 Viện Vắc xin Sinh phẩm Y tế Nha Trang (IVAC) nghiên cứu sản xuất thành công vắc xin cúm A/H7N9 bất hoạt trứng gà có phơi quy mơ thí nghiệm Hiện việc mở rộng sản xuất quy mơ lớn, việc tìm điều kiện tối ưu để nuôi cấy chủng vi rút sản xuất vắc xin cúm A/H7N9 để nâng cao hiệu suất vấn đề quan tâm Với ý nghĩa thực đề tài nghiên cứu “Khảo sát điều kiện nuôi cấy chủng vi rút NIBRG-267 (A/Shanghai/2/2013(H7N9)xPR8) trứng gà có phơi để sản xuất vắc xin cúm A/H7N9 quy mô công nghiệp” Mục tiêu đề tài: Tìm điều kiện tối ưu ni cấy vi rút H7N9 trứng gà có phơi để đem vào thử nghiệm ứng dụng quy mô công nghiệp Nội dung nghiên cứu: - Xác định điều kiện tối ưu để nuôi cấy chủng vi rút cúm H7N9: thể tích gây nhiễm, thời gian, nhiệt độ, độ ẩm - Thử nghiệm áp dụng điều kiện vào quy trình sản xuất vắc xin cúm quy mô 5000 - 10000 liều/lô 60 3.3 Kết khảo sát yếu tố ảnh đến q trình ni cấy vi rút cúm A/H7N9 lô 3.3.1 Kết khảo sát hiệu giá HA Khảo sát hiệu giá HA lô tương tự lô lô Bảng 3.7 Kết qủa khảo sát hiệu giá HA lơ Đơn vị: HAU/ml KẾT QUẢ HA LƠ Thể tích gây nhiễm (ml) Thời gian (giờ) 24h 48h 72h 96h 24h 48h 72h 96h 24h 48h 72h 96h 0.1 ml 0.2 ml 0.3 ml 34°C-35°C 160 160 320 320 160 160 320 320 160 320 320 160 Nhiệt độ 35°C36°C 160 160 320 320 160 320 320 320 160 320 320 160 36°C37°C 160 160 160 320 160 160 320 160 160 160 320 160 350 300 250 HAU/ml 200 34°C-35°C 150 35°C-36°C 100 36°C-37°C 50 24h 48h 72h 96h 24h 48h 72h 96h 24h 48h 72h 96h 0.1 ml 0.2 ml 0.3 ml Hình 3.7 Kết qủa khảo sát hiệu giá HA lô 61 Từ kết bảng 3.7 hình 3.7 cho thấy: - Tại thể tích gây nhiễm 0,1ml Ở khoảng nhiệt độ 340C-350C, 350C-360C, 360C-370C hiệu giá HA tăng theo thời gian Nhưng khoảng nhiệt độ 340C-350C, 350C-360C, 72h hiệu giá HA đạt mức cao 320 HAU/ml - Tại thể tích gây nhiễm 0,2ml Ở khoảng nhiệt độ 350C-360C, 48h hiệu giá HA đạt mức cao 320 HAU/ml trì đến 96h - Tại thể tích gây nhiễm 0,3ml Trong khoảng nhiệt độ khảo sát khoảng nhiệt độ 340C-350C, 350C360C 48h hiệu giá HA đạt mức cao 320 HAU/ml Kết luận: Từ kết ta thấy thể tích gây nhiễm tăng thời gian ni cấy vi rút NIBRG-267 rút ngắn khoảng nhiệt độ 350C-360C cho hiệu giá HA cao Nhưng phương pháp có độ xác khơng cao cần thực phương pháp khác: xác định liều gây nhiễm hàm lượng HA 62 3.3.2 Kết khảo sát liều gây nhiễm (EID50) Bảng 3.8 Kết qủa khảo sát EID50 lô Đơn vị: logEID50/ml KẾT QỦA KHẢO SÁT EID50 LÔ Nhiệt độ Thể tích gây nhiễm Thời gian 34°C35°C(giờ) (ml) 35°C 36°C 24h 7.50 7.65 48h 7.62 7.75 0.1 ml 72h 8.18 8.29 96h 8.42 8.54 24h 7.60 7.71 48h 7.89 8.00 0.2 ml 72h 8.32 8.65 96h 8.09 8.40 24h 7.62 7.75 48h 8.00 8.42 0.3 ml 72h 8.45 8.70 96h 7.54 7.79 36°C-37°C 7.32 7.42 7.82 8.11 7.40 7.65 8.00 7.65 7.50 7.90 8.00 7.33 9.00 LogEID50/ml 8.50 8.00 34°C-35°C 35°C-36°C 7.50 36°C-37°C 7.00 6.50 24h 48h 72h 96h 24h 48h 72h 96h 24h 48h 72h 96h 0.1 ml 0.2 ml 0.3 ml Hình 3.8 Kết qủa khảo sát EID50 lô 63 Từ kết bảng 3.8, hình 3.8 cho thấy: - Tại thể tích gây nhiễm 0,1ml Ở khoảng nhiệt độ 340C-350C, 350C-360C, 360C-370C giá trị EID50 tăng lên thời gian tăng từ 24h đến 96h, cao 96h Tại 96h, nhiệt độ 350C-360C giá trị EID50 đạt mức cao (8,54 logEID50/ml), thấp 340C-350C (8,42 logEID50/ml) thấp 360C-370C (8,11 logEID50/ml) - Tại thể tích gây nhiễm 0,2ml Ở khoảng nhiệt độ 340C-350C, 350C-360C, 360C-370C giá trị EID50 tăng thời gian tăng từ 24h đến 72h, cao 72h, 96h giá trị EID50 giảm xuống Tại 72h, nhiệt độ 350C-360C giá trị EID50 đạt mức cao (8,65 logEID50/ml), thấp 340C-350C (8,32 logEID50/ml) thấp 360C-370C (8 logEID50/ml) - Tại thể tích gây nhiễm 0,3ml Ở khoảng nhiệt độ 340C-350C, 350C-360C, 360C-370C giá trị EID50 tăng thời gian tăng từ 24h đến 72h, cao 72h, 96h giá trị EID50 giảm xuống Tại 72h, nhiệt độ 350C-360C giá trị EID50 đạt mức cao (8,7 logEID50/ml), thấp 340C-350C (8,45 logEID50/ml) thấp 360C-370C (8 logEID50/ml) Như thể tích gây nhiễm 0,3ml, nhiệt độ 350C-360C, thời gian 72h có giá trị EID50 cao (8,7 logEID50/ml), thể tích gây nhiễm 0,2ml, nhiệt độ 350C-360C, thời gian 72h có giá trị EID50 thấp không đáng kể (8,65 logEID50/ml) Kết luận: Kết cho thấy thể tích gây nhiễm 0,2ml; thời gian 72h; nhiệt độ 350C360C cho thấy giá trị EID50 cao tối ưu để nuôi cấy chủng vi rút NIBRG267 để sản xuất vắc xin cúm A/H7N9, kết phù hợp với khuyến cáo NIBSC 64 3.3.3 Kết khảo sát hàm lượng HA (SRID) Bảng 3.9 Kết qủa khảo sát SRID lơ Đơn vị: µgHA/ml KẾT QUẢ KHẢO SÁT SRID LƠ Thể tích gây nhiễm (ml) 0.1 ml 0.2 ml 0.3 ml Thời gian (giờ) 24h 48h 72h 34°C35°C 8.00 8.16 10.40 96h 24h 48h 72h 10.82 8.10 9.80 10.70 96h 24h 48h 72h 10.10 8.16 10.00 10.90 96h 8.06 Nhiệt độ 35°C36°C 8.20 8.70 10.60 11.00 8.50 10.00 11.80 10.80 8.70 10.82 11.90 9.00 36°C-37°C 7.62 7.82 9.20 10.20 7.80 8.20 10.00 8.20 8.00 9.90 10.00 7.63 14 12 µgHA/ml 10 34°C-35°C 35°C-36°C 36°C-37°C 24h 48h 72h 96h 24h 48h 72h 96h 24h 48h 72h 96h 0.1 ml 0.2 ml 0.3 ml Hình 3.9 Kết qủa khảo sát SRID lơ 65 Từ kết bảng 3.9, hình 3.9 cho thấy: - Tại thể tích gây nhiễm 0,1ml Ở khoảng nhiệt độ 340C-350C, 350C-360C, 360C-370C hàm lượng HA tăng lên thời gian tăng từ 24h đến 96h, cao 96h Tại 96h, nhiệt độ 350C-360C hàm lượng HA đạt mức cao (11 µgHA/ml), thấp 340C-350C (10,82 µgHA/ml) thấp 360C-370C (10,2 µgHA/ml) - Tại thể tích gây nhiễm 0,2ml Ở khoảng nhiệt độ 340C-350C, 350C-360C, 360C-370C hàm lượng HA tăng thời gian tăng từ 24h đến 72h, cao 72h, 96h hàm lượng HA giảm xuống Tại 72h, nhiệt độ 350C-360C hàm lượng HA đạt mức cao (11,8 µgHA/ml), thấp 340C-350C (10,7 µgHA/ml) thấp 360C-370C (10 µgHA/ml) - Tại thể tích gây nhiễm 0,3ml Ở khoảng nhiệt độ 340C-350C, 350C-360C, 360C-370C hàm lượng HA tăng thời gian tăng từ 24h đến 72h, cao 72h, 96h hàm lượng HA giảm xuống Tại 72h, nhiệt độ 350C-360C hàm lượng HA đạt mức cao (11,9 µgHA/ml), thấp 340C-350C (10,9 µgHA/ml) thấp 360C-370C (10 µgHA/ml) Kết luận: Kết cho thấy thể tích gây nhiễm 0,2ml; thời gian 72h; nhiệt độ 350C-360C cho thấy hàm lượng HA cao tối ưu để nuôi cấy chủng vi rút NIBRG-267 để sản xuất vắc xin cúm A/H7N9, kết phù hợp với khuyến cáo NIBSC Dựa vào kết khảo sát HA, EID50, SRID lô lựa chọn thông số tối ưu để nuôi cấy chủng vi rút NIBRG-267 để sản xuất vắc xin cúm A/H7N9 là: thể tích gây nhiễm 0,2ml, nhiệt độ 350C-360C, thời gian 72h 3.4 Xây dựng quy trình ni cấy Các thơng số thích hợp cho q trình ni cấy vi rút khảo sát (liều lượng gây nhiễm 0,2ml, nhiệt độ 350C-360C, thời gian 72h) sử dụng để xây dựng quy trình ni cấy cho vi rút cúm A/H7N9 Quy trình thiết lập dựa 66 giai đoạn tương tự quy trình lõi sản xuất cúm, số thông số quan trọng khảo sát tối ưu hóa Sau khảo sát, quy trình ni cấy vi rút cúm A/H7N9 áp dụng sau: Chủng gốc NIBRG- 267 Độ pha 10-4, liều tiêm 0,2 ml/ trứng Gây nhiễm trứng có phơi 11 ngày Ủ trứng Nhiệt độ 35 – 36oC/72h Thu dịch niệu trứng Hình 3.10 Quy trình ni cấy vi rút cúm A/H7N9 3.5 Thẩm định quy trình ni cấy vi rút cúm A/H7N9 xây dựng Để đưa quy trình ni cấy vi rút vào sản xuất, quy trình cần đảm bảo tính ổn định hiệu Để khảo sát tính ổn định hiệu quy trình ni cấy, tiến hành lấy mẫu sau ni cấy thể tích gây nhiễm 0,2ml, nhiệt độ 35 – 36oC, thời gian 72h để tiến hành kiểm tra HA, EID50 SRID Tiến hành thẩm định lô liên tiếp Bảng 3.10 Kết q trình thẩm định lơ Số lơ Hiệu giá HA/ml Log EID50 µgHA/ml Tỷ lệ trứng sống Lô VXC-01 320 8.58 11.4 95% Lô VXC-02 640 8.83 12.3 98% Lô VXC-03 640 8.75 12 96% 67 Từ kết bảng 3.10 ta thấy rằng: Tỷ lệ số trứng sống sau gây nhiễm thể tích 0,2ml, nuôi nhiệt độ 35-36 oC, thời gian nuôi 72h phù hợp với tiêu chuẩn khuyến cáo NIBSC ≥ 90% Các giá trị kiểm tra hiệu giá HA, liều gây nhiễm, hàm lượng HA phù hợp với thẩm định quy trình ni cấy vi rút cúm phịng Vắc xin cúm Điều chứng tỏ thông số nuôi cấy điều kiện tối ưu cho vi rút phát triển 68 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Từ kết thẩm định lô liên tiếp cho thấy thể tích V=0,2ml, nhiệt độ 350C-360C, 72h điều kiện nuôi cấy tối ưu nuôi cấy chủng vi rút NIBRG-267 để sản xuất vắc xin cúm A/H7N9 - Xây dựng thành cơng quy trình nuôi cấy vi rút cúm A/H7N9 để ứng dụng vào sản xuất vắc xin quy mô công nghiệp - Ứng dụng quy trình ni cấy xây dựng để sản xuất thử nghiệm lô vắc xin cúm A/H7N9 quy mô công nghiệp đạt hiệu cao 4.2 Kiến nghị - Ứng dụng thông số đề tài để sản xuất vắc xin cúm A/H7N9 quy mơ lớn - Tiếp tục đánh giá tính ổn định chủng WSL thẩm định chất lượng chủng thông qua hiệu suất 03 lô vắc xin sản xuất thử nghiệm - Hoàn thiện hồ sơ chủng WSL theo qui định GMP - Đưa chủng WSL vào sản xuất thức sau có kết thẩm định chất lượng chủng 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Bộ Khoa học Công nghệ (2006), Nghiên cứu quy trình sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 bất hoạt dùng cho người kỹ thuật nuôi cấy tế bào vero trứng gà có phơi, thuyết minh đề tài cấp nhà nước, thành phố Hồ Chí Minh, trang 2-24 Bộ Khoa học công nghệ, Bộ Y tế (2010) Kết nghiên cứu đề tài nghiên cứu quy trình sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 dùng cho người kỹ thuật nuôi cấy tế bào vero trứng gà có phơi, Báo cáo tổng hợp đề tài cấp nhà nước, TP Hồ Chí Minh Bộ Y tế (2002), Dược điển Việt nam IV, nhà xuất Y học, Hà Nội 2009 Lê Văn Bé, (2015), Ứng dụng công nghệ ni cấy trứng gà có phơi để sản xuất vắc xin cúm A/H7N9, Đề tài nghiên cứu khoa học công nghệ cấp nhà nước Lê Văn Hiệp cs (2008), Nghiên cứu qui trình sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 bất hoạt dùng cho người kỹ thuật ni cấy trứng gà có phơi, Đề tài nhánh nghiên cứu khoa học công nghệ cấp nhà nước Nguyễn Đăng Hiền, Đặng Mai Dung, Nguyễn Thị Qùy, Vũ Cơng Long, Nguyễn Huy Phương, Trần Bích Hạnh, Lê Trung Dũng, Ngô Thu Hường, Lê Thị Luân (2010), Thử nghiệm vắc xin cúm A/H1N1 sản xuất POLYVAC khỉ M.Mulata, Tạp chí Y học Dự phịng, tập XX, số (115), trang 29-35 Tài liệu tiếng anh Bosch FX, Garten W, Klenk HD, Rott R (1981) Proteolytic cleavage of influenza virus heamagglutinins; primary structure of the connecting peptide between HA1 and HA2 determines proteolytic cleavability and pathogenicity of avian influenza viruses Virology 113: 725-735 Center for disease control and Prevention, Department of Health & Human services (2009), Novel Influenza A (H1N1) candidate vaccine virus and biocontainment requirements for handling, Washington, USA 70 Couch RB, Patel SM, Wade-Bowers CL et al A randomized clinical trial of an inactivated avian influenza A (H7N7) vaccine PLoS One 2012;7(12):e49704 doi:10.1371/journal.pone.0049704119 10 Julian Hickling and Erik D’Hondt (2006) A review of production techologies for influenza virus vaccines, and their suitability for deployment in developing contries for influenza pandemic preparedness, Influenza vaccine production technology 11 Executive office of the President – US (2010) Report to the president on reengineering the influenza vaccine production enterprise to meet challenges of pandemic influenza, President’s Council of Advisors on Science and Technology 12 Fang LQ, de Vlas SJ, Liang S, Looman CW, Gong P, Xu B, Yan L, Yang H, Richardus JH, Cao WC (2008), Environmental factors contributing to the spread of H5N1 avian influenza in mainland China PLoS o¬nE 3(5): e2268 13 Hilleman M (2002), Realities and enigmas of human viral influenza: pathogenesis, epidemiology and control Vaccine 20(25-26): 3068-3087 14 Horimoto T, Kawaoka Y (2001), Pandemic threat posed by avian influenza A viruses Clin Microbiol Rev 14(1): 129-149 15 Ito T, Couceiro JN, Kelm S, Baum LG, Krauss S, Castrucci MR, Donatelli I, Kida H, Paulson JC, Webster RG and Kawaoka Y (1998), Molecular basis for the generation in pigs of influenza A viruses with pandemic potential J Virol 72: 7367-7373 16 Murphy BR, Webster RG (1996) Orthomyxoviruses In Fields BN, Knipe DM, Howley PM, (eds.) Fields Virology, 3rd ed, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia: 1397-1445 17 NVI-WHO (2010), Egg-base influenza vaccine manufacturing course manual part II 71 18 Otfried Kistner, Keith Howard, Martin Spruth et al (2007), Cell culture (Vero) divired virus (H5N1) vaccine base on wild-type virus strain induces crossprotective immune response, Vaccine, Pages 6028-6036 19 Ph Eur (2001), Inactivated Influenza vaccine (Whole virion) 20 Riedmann EM Human vaccines & immunotherapeutics: news Hum Vaccin Immunother.2013;9(6):1187 21 Smith GE, Flyer DC, Raghunandan R, Development of influenza H7N9 virus like particle (VLP) vaccine: Homologous A/Anhui/1/2013(H7N9) protection and heterologous A/chicken/Jalisco/CPA1/2012(H7N3) cross-protection in vaccinated mice challenged with H7N9 virus.Vaccine 2013 22 WHO, Technical Report Series 927 (2005) WHO expert committee on biological Standardization, Fifty- four report 23 WHO (2013), China—WHO Joint Mission on Human Infection with Avian Influenza A(H7N9) Virus Mission Report 18 – 24 April 2013 24 WHO (2013), Update of WHO biosafety risk assessment and guidelines for the production and quality control of human influenza vaccines against avian influenza A(H7N9) virus Geneva, World Health Organization, 2013 25 WHO (2015), Update of WHO biosafety risk assessment and guidelines for the production and quality control of human influenza vaccines against avian influenza A(H7N9) virus Geneva, World Health Organization, 2013 26 FAO (2016), H7N9 situation update - Avian influenza A(H7N9) virus Food and Agriculture Organization of the United Nations 72 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần dung dịch đệm PBS (Phosphate Buffer Saline) 0.01M, pH =7.2 STT Thành phần Số lượng Đơn vị NaCl 8.015 g Na2HPO4.7H20 2.6807 g KH2PO4 0.0408 g Nước cất 1000 ml Đo pH, chỉnh pH =7.2 Khử trùng 0.8 atm, 15 phút Bảo quản 40C Phụ lục 2: Pha dung dịch hồng cầu gà 1% STT Thành phần Số lượng Đơn vị Hồng cầu 10% ml Dung dịch PBS 0.01M + 0.5% BSA 36 ml Phụ lục 3: Thành phần dung dịch PBS 7.2+ 0.5% BSA STT Thành phần Số lượng Đơn vị BSA 0.5 g Dung dịch đệm PBS 0.01M, pH =7.2 100 ml 73 Phụ lục 4: Tiêu chuẩn chủng NIBRG-267 gốc giống (MSL) STT Chỉ tiêu Phương pháp Tiêu chuẩn chấp Tiêu chuẩn nhận áp dụng Khơng có phát Vô trùng Nuôi cấy trực tiếp triển vi khuẩn môi trường TSB nấm Thioglycolate loại môi trường DĐVN IV, 2009 nuôi cấy Hiệu giá kháng nguyên ngưng kết TCCS dựa Phản ứng ngưng kết với hồng cầu gà ≥ 1/640 TRS 927, (CRBC) 2005 Hiệu giá Chuẩn độ trứng TCCS dựa chủng gà (EID50/ml) có phơi 11 ngày tuổi hồng cầu (HA/ml) ≥ 106,5 TRS 927, 2005 74 Phụ lục 5: Tiêu chuẩn chủng NIBRG-267 làm việc (WSL) STT Chỉ tiêu Phương pháp Tiêu chuẩn chấp nhận Tiêu chuẩn áp dụng Khơng có phát triển Nuôi cấy trực tiếp Vô trùng môi trường TSB Thioglycolate vi khuẩn nấm DĐVN IV, loại môi 2009 trường nuôi cấy Nhận dạng Khuếch đại giải trình tự gen mã hóa protein Trình tự gen HA NA không khác TRS 927, biệt so 2005 HA NA với chủng ngun gốc Xác định Khơng có diện khơng có Mycoplasma PCR phương pháp gallisepticum, TRS 927, diện nuôi cấy Mycoplasma synoviae 2005 Mycoplas Mycobacterium ma avium Hiệu giá kháng nguyên Phản ứng ngưng kết với ngưng kết hồng cầu gà (CRBC) hồng cầu (HA/ml) TCCS dựa ≥ 1/640 TRS 927, 2005