KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY TỐI ƯU VÀ TẠO CHẾ PHẨM ĐÔNG KHÔ TỪ HAI CHỦNG VI KHUẨN Acinetobacter calcoaceticus anitratus VPI SD VÀ Acinetobacter venetianus VPI VT1 CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HUỶ DẦU MỎ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NI CẤY TỐI ƯU VÀ TẠO CHẾ PHẨM ĐÔNG KHÔ TỪ HAI CHỦNG VI KHUẨN Acinetobacter calcoaceticus anitratus VPI - SD VÀ Acinetobacter venetianus VPI - VT1 CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HUỶ DẦU MỎ Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : HÀN THỊ THANH Niên khóa : 2009 - 2013 Tháng 06/2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY TỐI ƯU VÀ TẠO CHẾ PHẨM ĐÔNG KHÔ TỪ HAI CHỦNG VI KHUẨN Acinetobacter calcoaceticus anitratus VPI - SD VÀ Acinetobacter venetianus VPI - VT1 CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HUỶ DẦU MỎ Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS NGUYỄN THỊ NGỌC TĨNH HÀN THỊ THANH Tháng 06/2013 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: Ban giám hiệu trường Đại học Nơng lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, Cô giáo chủ nhiệm Tơ Thị Nhã Trầm tồn thể Thầy (Cô) truyền đạt kiến thức cho suốt trình học tập trường TS Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh tận tình hướng dẫn, dìu dắt tơi q trình nghiên cứu hồn thành luận văn ThS Văn Thị Thúy, KS Mai Hưng Kiên tạo điều kiện thuận lợi, tận tình giúp đỡ tơi q trình thực tập Viện Nghiên cứu Ni trồng Thủy Sản II Bạn Lý Vũ Minh Thư người giúp đỡ tơi suốt q trình thực tập Tơi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Ni trồng Thuỷ sản II Các Anh (Chị) Phòng Sinh học Thực nghiệm, đặc biệt người bạn trường Đại học Kĩ thuật Công nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh Bạn bè thân u lớp Cơng nghệ Sinh học DH09SH chia sẻ vui buồn hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ, động viên tơi suốt năm qua Thành kính ghi nhớ công ơn cha mẹ người thân gia đình ln chỗ dựa vững cho con, động viên, khuyến khích, tạo điều kiện cho học tập tốt Với lòng biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ q báu đó! TP Hồ Chí Minh, tháng năm 2013 Sinh viên thực HÀN THỊ THANH TÓM TẮT Dầu mỏ sản phẩm dầu mỏ khai thác sử dụng với khối lượng ngày tăng giới Việt Nam Bên cạnh ưu điểm mặt kinh tế xã hội, sản phẩm dầu mỏ mối đe dọa ô nhiễm mơi trường chúng gây Tuy tính chất hóa học dầu trơ hầu hết chúng bị phân hủy cách hiệu nhờ vào số chủng vi sinh vật Trước thực trạng đề tài tiến hành nghiên cứu “Khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu tạo chế phẩm từ hai chủng vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus anitratus VPI - SD Acinetobacter venetianus VPI - VT1 có khả phân hủy dầu mỏ” Đề tài thực Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II từ ngày 15/12/2012 đến ngày 31/5/2013 Thí nghiệm thực qua hai giai đoạn đạt số kết sau: Giai đoạn tiến hành khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu (khảo sát công thức môi trường, hai giá trị nhiệt độ 25oC 30oC) hai chủng vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus anitratus VPI - SD Acinetobacter venetianus VPI - VT1 có khả phân hủy dầu mỏ Từ kết đo mật độ quang xác định đường cong tăng trưởng, cho thấy môi trường nuôi cấy theo công thức (có hàm lượng peptone = 20 g/l; hàm lượng yeast extract 10 g/l) nhiệt độ nuôi cấy 30oC tốt Giai đoạn tiến hành lên men tăng sinh khối với thể tích V = 40 lít mơi trường theo cơng thức 3, thời gian ni cấy 48 giờ, to = 30oC Chế phẩm vi sinh tạo phương pháp đông khô dạng bột với chất mang Skim milk bột lõi ngơ, có mật độ vi khuẩn khoảng 109 CFU/g Kết nghiên cứu đề tài tiền đề để đưa thị trường chế phẩm xử lý môi trường ô nhiễm dầu biện pháp sinh học ứng dụng vào việc xử lý nước thải nhiễm dầu mỏ SUMMARY Pollution of oil and water environment by crude oil has been and is still today, an important problem Although crude oil products are chemically very inert, most of them can be efficiently degraded by a number of microorganisms The thesis entitled “Study on the optimal culture conditions and production of probiotic preparations from the oildegrading bacterial strains (Acinetobacter calcoaceticus anitratus VPI - SD and Acinetobacter venetianus VPI - VT1)” was carried out at the Research Institute for Aquaculture No2 from December 2012 to May 2013 The experiments were conducted in two stages and the following results were obtained Stage Investigation of the optimal culture conditions (two temperature values 25oC and 30oC, three formulas of organic components of the culture medium) of two oildegrading bacterial strains (Acinetobacter calcoaceticus anitratus VPI - SD and Acinetobacter venetianus VPI - VT1) As a result, culture temperature of 30oC and culture medium with 20 g/l peptone and 10 g/l yeast were selected as optimal culture conditions Stage Based on the optimal culture conditions selected, we carried out fermentation experiments with fermentation volume of 40 liters, temperature 30oC, culture duration 48 h The harvested microbial biomass was freeze-dried with skim milk as carrier The bacterial density in the final product was about 109 CFU/g The results of our study show a great potential to treat oil spill-contaminated water by means of biological treatment Keywords: Acinetobacter calcoaceticus anitratus; Acinetobacter venetianus; oildegrading bacteria; oil spill MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Summary iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vii  Danh sách bảng sơ đồ viii Danh sách hình đồ thị ix Chương MỞ ĐẦU 1  1.1 Đặt vấn đề 1  1.2 Yêu cầu 2  1.3 Nội dung thực 2  Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3  2.1 Tổng quan tượng tràn dầu 3  2.1.1 Định nghĩa tràn dầu 2.1.2 Tình trạng tràn dầu giới Việt Nam 4  2.1.3 Các nguyên nhân tràn dầu 5  2.1.4 Hậu tràn dầu 5  2.2 Các phương pháp xử lý tràn dầu 6  2.2.1 Phương pháp xử lý tràn dầu tác nhân học 6  2.2.2 Phương pháp xử lý tràn dầu tác nhân hóa học 6  2.2.3 Phương pháp xử lý tràn dầu tác nhân sinh học 7  2.3.Tổng quan vi sinh vật phân hủy dầu mỏ 9  2.3.1 Sự phân bố vi sinh vật phân hủy dầu mỏ 9  2.3.2 Các nhóm vi sinh vật có khả phân hủy dầu mỏ 10  2.3.3 Các nhân tố ảnh hưởng đến phân hủy sinh học 10  2.3.4 Cơ chế phân hủy hydrocarbon 13  2.3.5 Ứng dụng xử lý tràn dầu phương pháp sinh học 14  2.4 Tổng quan nhóm vi khuẩn Acinetobacter 15  2.4.1 Phân loại Acinetobacter 16  2.5.2 Các nghiên cứu Acinetobacter 17  Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20  3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 19  3.2 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 19  3.3 Vật liệu, dụng cụ thiết bị nghiên cứu 19  3.3.1 Vật liệu nghiên cứu 19  3.3.2 Dụng cụ trang thiết bị nghiên cứu 20  3.3.3 Hóa chất dùng nghiên cứu 20  3.4 Phương pháp nghiên cứu 21  3.4.1 Các bước tiến hành thí nghiệm 22 3.4.1.1 Khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu hai chủng vi khuẩn Acinetobacter 22 3.4.1.2 Lên men nhân sinh khối tạo chế phẩm đông khô 24 3.4.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát đường cong tăng trưởng 25 3.4.3 Phương pháp đo mật độ quang 24 3.4.4 Phương pháp xây dựng đường chuẩn tương quan mật độ quang .26 3.4.5 Phương pháp lên men nhân sinh khối 24  3.4.6 Phương pháp đông khô tạo chế phẩm 25  3.4.7 Phương pháp trộn chế phẩm sau đông khô với chất mang 27 3.4.8 Phương pháp xác định mật độ tế bào 28  3.4.9 Phương pháp thu thập xử lí số liệu 27  Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28  4.1 Kết khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu 29 4.1.1 Kết khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu chủng VPI - VT1 29 4.1.2 Kết khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu chủng VPI - SD .31 4.2 Kết xây dựng đường chuẩn tương quan mật độ quang mật độ tế bào 33 4.3 Kết trình lên men nhân sinh khối tạo chế phẩm đông khô 34  4.4 Kết kiểm tra mật độ tế bào chế phẩm sau đông khô sau 36 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38 5.1 Kết luận .38 5.2 Đề nghị 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 PHỤ LỤC DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT alk gen alkane hydrocarbon mã hoá enzyme n - alkane monooxygenases ANOVA Analysis of Variance CFU Colony forming unit DO Dầu diezel FO Dầu nhiên liệu LB Luria Bertani μl Microlit NA Nutrient Agar OD Optical Density PAH Polycyclic aromatic hydrocacbon (Hydrocarbon thơm đa nhân) SPSS Statistical Package for Social Sciences TSA Tryptic Soy Agar USEPA US Environmental Protection Agenc UV UltraViolet VPI - SD Chủng Acinetobacter calcoaceticus anitratus VPI - SD VPI - VT1 Chủng Acinetobacter venetianus VPI - VT1 DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ Bảng 2.1 Các cố tràn dầu nghiêm trọng giới Bảng 2.2 Các vụ tràn dầu lớn xảy Việt Nam Bảng 2.3 Các vi sinh vật có khả phân hủy dầu mỏ 10 Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát đường cong tăng trưởng 25 Bảng 4.1 Mật độ quang trung bình cực đại hai chủng 29 Bảng 4.2 Kết khảo sát nhiệt độ nuôi cấy chủng VPI - VT1 31 Bảng 4.3 Kết khảo sát công thức môi trường nuôi cấy chủng VPI - VT1 31 Bảng 4.4 Kết khảo sát nhiệt độ nuôi cấy chủng VPI - SD 33 Bảng 4.5 Kết khảo sát công thức môi trường nuôi cấy chủng VPI - SD 33 Bảng 4.6 Kết mật độ quang mật độ tế bào nồng độ pha loãng 34 Bảng 4.7 Các thơng số q trình lên men hai chủng Acinetobacter sp .35 Bảng 4.8 Mật độ quang mật độ tế bào dịch khuẩn sau lên men 48 35 Bảng 4.9 Mật độ quang mật độ tế bào dịch khuẩn sau lên men 48 .36 Bảng 4.10 Mật độ tế bào sau lên men, sau đông khô chế phẩm 37 Sơ đồ 3.1 Các bước tiến hành thí nghiệm 22 Sơ đồ 3.2 Khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu hai chủng vi khuẩn Acinetobacter 23 Sơ đồ 3.3 Lên men nhân sinh khối tạo chế phẩm đông khô 24 Sinh khối sau đông khô trộn với bột lõi ngơ máy trộn vi sinh có cơng suất 100 kg/mẻ, tốc độ quay 200 vòng/phút Sản phẩm cuối kiểm tra mật độ tế bào phương pháp trải đĩa đếm khuẩn lạc đạt kết 1,3 x 109 CFU/g chủng VPI - SD 1,4 x 109 CFU/g chủng VPI - VT1 Bảng 4.10 Mật độ tế bào sau lên men, sau đông khô chế phẩm vi sinh chủng VPI - SD chủng VPI - VT1 Thông số Chủng VPI – SD Chủng VPI - VT1 Mật độ sau lên men (CFU/ml) 2,915 x 109 3,057 x 109 Mật độ sau đông khô (CFU/g) 6,72 x 1010 1,21 x 1011 170 300 1,3 x 109 1,4 x 109 11,4 36,3 Sinh khối sau đông khô (g) Mật độ chế phẩm (CFU/g) Khối lượng chất mang (kg) 36 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết thí nghiệm rút số kết luận sau: Khi so sánh mật độ quang cực đại hai nhiệt độ 25oC 30oC chủng VPI - SD có khác biệt có ý nghĩa thống kê, chủng VPI - VT1 khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê Ở nhiệt độ 30oC, mật độ quang vi khuẩn cao so với nhiệt độ 25oC Mật độ quang cực đại hai chủng vi khuẩn so sánh công thức môi trường khác biệt có ý nghĩa thống kê Cơng thức cho mật độ quang vi khuẩn cao Ở điều kiện ni cấy lắc thể tích 100 ml sử dụng công thức 3, mật độ quang cực đại chủng VPI - VT1 đạt 2,917 sau 72 tương ứng mật độ tế bào 2,595 x 109 CFU/ml chủng VPI - SD đạt 3,022 sau 48 tương ứng mật độ tế bào 2,690 x 109 CFU/ml Mật độ tế bào sau thời gian lên men thể tích 40 lít sau 48 chủng VPI SD 2,915 x 109 CFU/ml chủng VPI - VT1 3,057 x 109 CFU/ml Mật độ tế bào chế phẩm sau đông khô chủng VPI - SD 6,72 x 1010 CFU/g chủng VPI VT1 1,12 x 1011 CFU/g Mật độ tế bào chế phẩm sau trộn với chất mang bột lõi ngô chủng VPI - SD 1,3 x 109 CFU/g chủng VPI - VT1 1,4 x 109 5.2 Đề nghị Khảo sát điều kiện bảo quản chế phẩm ảnh hưởng đến mật độ vi khuẩn Khảo sát loại chất mang thứ cấp khác để chọn chất mang rẻ tiền cho thời gian bảo quản lâu Cần tiến hành nghiên cứu thời gian bảo quản chế phẩm vi sinh tạo được, thử nghiệm hiệu chế phẩm điều kiện môi trường thực tế Cần mở rộng nghiên cứu nhiều chủng vi khuẩn có khả phân hủy dầu mỏ Việt Nam để tạo chế phẩm xử lý môi trường từ chủng vi khuẩn nội địa 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Đặng Thị Cẩm Hà 2004 Nghiên cứu làm ô nhiễm dầu mỏ vùng đất đá ven biển cặn dầu phương pháp phân hủy sinh học quy mơ pilot Tạp chí cơng nghệ sinh học 3: 377 – 386 Lê Tiến Mạnh 2008 Phân lập, tuyển chọn nghiên cứu khả phân hủy sinh học hydrocarbon thơm vài chủng vi khuẩn phân lập từ nước ô nhiễm dầu Quảng Ninh Luận văn thạc sĩ sinh học, Đại học Thái Nguyên Đinh Thị Ngọ 2006 Giáo trình hóa học dầu khí NXB Khoa học Kĩ Thuật Trần Linh Thước 2002 Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mĩ phẩm NXB Giáo Dục Tài liệu Tiếng Anh Atlas R.M 1981 Microbial Degradation of Petroleum Hydrocarbons: an Environmental Perspective Microbiollogical review 45: 180 - 209 Scragg A 1998 Bioremendiation Environment biotechnology 44: 111 - 129 El – Haleem A.D 2003 Acinetobacter: environmental and biotechnological applications African Journal of Biotechnology 2: 71 - 74 Koma, D., Sakashi, Y., Kubota, K., Fujii, Y., Hasumi, F., Chung, S.Y and Kubo, M 2003 Degradation of car engine base oil by Rhodococcus sp NDKK48 and Gordonia sp NDKY76A Biosci Biotech Biochem 67: 1590 - 1593 Lakshmi M.B., Velan M 2001 Biodegradation of the toxic polycyclic aromatic hydrocarbon, phenanthrene by an indigenously isolated Alcaligenes faecalis MVMB1strain International Conference on Environmental Science and Technology IPCBEE 6: 440 - 444 10 Megan, M.C 2000 Determination of the presence of the catabolic alkane monooxygenase gene from soil microorganisms isolated from coastal sand dunes California Polytechnic State University 44: - 15 11 Salleh, A.B and etc 2003 Bioremediation of petroleum hydrocarbon pollution Indian Journal of Biotechnology 2: 411 - 425 12 Pavitran, S and etc 2006 Microbial bioremediation of fuel oil hydrocarbons in marine enviroment Defence Science Journal 56: 209 - 224 13 Rojo, F 2005 Specificity at the End of the Tunnel: Understanding Substrate Length Discrimination by the AlkB Alkane Hydroxylase J Bacteriol 11: 190 - 242 14 Rojo, F 2009 Degradation of alkanes by bacteria Environmental Microbiology 11: 2477 - 2490 15 Vaneechoutte, M and etc 1997 Description of Acinetobacter Venetianus ex Di Cello et al 1997 sp nov International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 59: 1376 - 1380 38 PHỤ LỤC Phụ lục Kết khảo sát mật độ quang bước sóng 600 nm chủng Acinetobacter venetianus VPI - VT1 nhiệt độ 25oC với mật độ tế bào ban đầu 106 CFU/ml Thời gian (giờ) Công thức 12 18 24 36 48 72 96 0,001 0,058 0,798 1,444 1,556 1,720 1,828 1,756 VT 1.1 0,001 0,060 0,824 1,420 1,556 1,708 1,824 1,756 0,001 0,095 0,906 1,416 1,536 1,700 1,768 1,720 VT 1.2 0,001 0,095 0,900 1,424 1,524 1,688 1,768 1,728 VT 1.3 0,001 0,103 0,870 1,424 1,532 1,692 1,824 1,700 0,001 0,110 0,880 1,412 1,532 1,672 1,812 1,700 Trung bình 0,001 0,087 0,863 1,423 1,539 1,697 1,804 1,727 Công thức VT 2.1 0,001 0,099 0,920 1,536 1,756 2,212 2,556 2,464 0,001 0,098 0,930 1,528 1,776 2,216 2,544 2,452 VT 2.2 0,001 0,117 0,840 1,356 1,716 2,016 2,420 2,412 0,001 0,112 0,840 1,364 1,708 2,004 2,420 2,404 VT 2.3 0,001 0,110 0,932 1,716 1,900 2,176 2,496 2,396 0,001 0,109 0,924 1,680 1,908 2,172 2,488 2,440 Trung bình 0,001 0,108 0,898 1,530 1,794 2,133 2,487 2,428 Cơng thức VT 3.1 0,001 0,100 0,860 1,484 1,684 1,992 2,612 3,106 0,001 0,098 0,866 1,476 1,680 1,940 2,624 3,156 VT 3.2 0,001 0,104 0,822 1,356 1,620 1,856 2,624 3,180 0,001 0,104 0,820 1,364 1,600 1,872 2,628 3,184 VT 3.3 0,001 0,095 0,820 1,416 1,612 1,920 2,688 3,200 0,001 0,097 0,814 1,412 1,624 1,920 2,672 3,212 Trung bình 0,001 0,100 0,838 1,419 1,639 1,916 2,635 3,176 - Phụ lục Kết khảo sát mật độ quang bước sóng 600 nm chủng Acinetobacter venetianus VPI - VT1 nhiệt độ 30oC với mật độ tế bào ban đầu 106 CFU/ml Thời gian (giờ) 12 18 24 36 48 72 96 Công thức VT 1.1 0,001 0,275 0,964 1,504 1,636 1,756 1,740 1,828 0,001 0,273 0,966 1,512 1,624 1,728 1,744 1,860 VT 1.2 0,001 0,235 0,956 1,460 1,652 1,724 1,728 1,620 0,001 0,244 0,952 1,440 1,656 1,720 1,732 1,852 VT 1.3 0,001 0,316 0,990 1,452 1,632 1,696 1,676 1,600 0,001 0,331 0,986 1,468 1,616 1,700 1,668 1,600 Trung bình 0,001 0,279 0,969 1,473 1,636 1,721 1,715 1,727 Công thức VT 2.1 0,001 0,230 0,864 1,584 1,988 2,352 2,544 2,392 0,001 0,226 0,862 1,568 1,972 2,352 2,532 2,416 VT 2.2 0,001 0,225 0,874 1,580 2,084 2,348 2,560 2,496 0,001 0,230 0,868 1,616 2,080 2,368 2,572 2,520 VT 2.3 0,001 0,232 0,858 1,588 2,000 2,320 2,540 2,436 0,001 0,229 0,858 1,564 1,996 2,324 2,540 2,424 Trung bình 0,001 0,229 0,864 1,583 2,020 2,344 2,548 2,447 Cơng thức VT 3.1 0,001 0,246 0,804 1,392 1,836 2,308 2,876 2,968 0,001 0,245 0,802 1,360 1,832 2,292 2,876 3,000 VT 3.2 0,001 0,195 0,796 1,368 1,620 2,212 2,764 2,924 0,001 0,203 0,796 1,372 1,640 2,188 2,788 2,908 VT 3.3 0,001 0,226 0,808 1,328 1,604 2,036 2,492 2,856 0,001 0,252 0,808 1,336 1,580 2,076 2,508 2,844 Trung bình 0,001 0,228 0,802 1,359 1,685 2,185 2,717 2,917 - Phụ lục Kết khảo sát mật độ quang bước sóng 600 nm chủng Acinetobacter calcoaceticus anitratus VPI - SD nhiệt độ 25oC với mật độ ban đầu 106 CFU/ml Thời gian (giờ) 96 12 18 24 36 48 72 Công thức SD 1.1 0,001 0,046 0,852 1,300 1,460 1,612 1,884 1,704 0,001 0,052 0,860 1,288 1,452 1,624 1,896 1,696 SD 1.2 0,001 0,089 0,908 1,368 1,500 1,660 1,712 1,660 0,001 0,092 0,912 1,368 1,516 1,648 1,700 1,664 SD 1.3 0,001 0,093 0,864 1,312 1,464 1,592 1,660 1,576 0,001 0,095 0,868 1,324 1,484 1,556 1,652 1,584 Trung bình 0,001 0,078 0,877 1,327 1,479 1,615 1,751 1,647 Công thức SD 2.1 0,001 0,079 0,890 1,528 1,784 2,096 2,384 2,348 2,392 0,001 0,079 0,888 1,512 1,768 2,080 2,376 2,352 2,392 SD 2.2 0,001 0,100 0,892 1,548 1,760 2,108 2,336 2,424 2,252 0,001 0,099 0,890 1,556 1,780 2,104 2,360 2,424 2,276 SD 2.3 0,001 0,106 0,918 1,564 1,848 2,128 2,352 2,404 2,300 0,001 0,103 0,926 1,576 1,848 2,096 2,340 2,400 2,304 Trung bình 0,001 0,094 0,901 1,547 1,798 2,102 2,358 2,392 2,319 Công thức 0,001 0,097 0,830 1,448 1,720 1,976 2,572 3,020 3,164 SD 3.1 0,001 0,092 0,828 1,468 1,712 1,996 2,568 3,012 3,164 0,001 0,101 0,820 1,360 1,572 1,880 2,496 2,992 2,824 SD 3.2 0,001 0,100 0,832 1,356 1,584 1,876 2,492 3,020 2,816 0,001 0,105 0,834 1,388 1,608 1,904 2,584 3,036 2,968 SD 3.3 0,001 0,106 0,824 1,388 1,620 1,896 2,580 3,052 2,968 Trung bình 0,001 0,100 0,828 1,401 1,636 1,921 2,549 3,022 2,984 Phụ lục Kết khảo sát mật độ quang bước sóng 600 nm chủng Acinetobacter calcoaceticus anitratus VPI – SD nhiệt độ 30oC với mật độ ban đầu 106 CFU/ml Thời gian (giờ) 12 18 24 36 48 72 96 Công thức SD 1.1 0,001 0,286 0,828 1,364 1,904 2,128 2,476 2,240 0,001 0,298 0,826 1,376 1,900 2,128 2,480 2,256 SD 1.2 0,001 0,296 0,830 1,408 1,944 2,116 2,436 2,256 0,001 0,298 0,826 1,420 1,952 2,108 2,424 2,260 SD 1.3 0,001 0,221 0,804 1,340 1,856 2,020 2,184 1,968 0,001 0,225 0,802 1,340 1,868 2,020 2,192 1,980 Trung bình 0,001 0,271 0,819 1,375 1,904 2,087 2,365 2,160 Công thức SD 2.1 0,001 0,220 0,796 1,288 2,148 2,216 2,856 2,856 2,392 0,001 0,218 0,808 1,280 2,172 2,212 2,856 2,856 2,392 SD 2.2 0,001 0,227 0,798 1,424 2,356 2,432 3,000 3,000 2,252 0,001 0,227 0,806 1,460 2,364 2,440 3,016 3,016 2,276 SD 2.3 0,001 0,238 0,810 1,292 2,180 2,256 2,856 2,792 2,300 0,001 0,251 0,820 1,288 2,172 2,248 2,852 2,800 2,304 Trung bình 0,001 0,230 0,806 1,339 2,232 2,301 2,906 2,887 2,319 Công thức SD 3.1 0,001 0,201 0,758 1,200 2,048 2,324 3,052 3,020 3,164 0,001 0,199 0,746 1,192 2,040 2,340 3,068 3,012 3,164 SD 3.2 0,001 0,188 0,806 1,308 2,196 2,268 3,004 2,992 2,824 0,001 0,188 0,820 1,284 2,208 2,260 3,000 3,000 2,816 SD 3.3 0,001 0,139 0,794 1,256 2,124 2,352 3,048 2,972 2,968 0,001 0,135 0,822 1,268 2,128 2,336 3,040 2,932 2,968 Trung bình 0,001 0,175 0,791 1,251 2,124 2,313 3,035 2,988 2,984 Phụ lục Kết phân tích số liệu mật độ quang bước sóng 600 nm khảo sát chủng Acinetobacter venetianus VPI - VT1 phần mềm SPSS 16 Two way - Acinetobacter venetianus VPI – VT1 Between-Subjects Factors Value Label NhietDo N 30oC 18 25oC CTMT CT1 CT2 CT3 Tests of Between-Subjects Effects 18 12 12 12 Dependent Variable:OD600 Source Type III Sum of Squares Df a Mean Square Corrected Model Intercept NhietDo CTMT NhietDo * CTMT Error 9.722 205.330 003 9.606 113 1 2 1.944 205.330 003 4.803 057 220 30 007 Total 215.271 36 9.942 35 Corrected Total a R Squared = 978 (Adjusted R Squared = 974) Estimated Marginal Means Grand Mean Dependent Variable:OD600 Mean Std Error 95% Confidence Interval Lower Bound 2.388 014 NhietDo Dependent Variable:OD600 NhietDo 30oC 25oC CTMT Mean 2.397 2.379 Upper Bound 2.359 2.417 95% Confidence Interval Std Error Lower Bound Upper Bound 020 2.356 2.438 020 2.338 2.421 Dependent Variable:OD600 CTMT CT1 CT2 CT3 Mean 1.719 2.470 2.976 95% Confidence Interval Std Error Lower Bound Upper Bound 025 1.668 1.769 025 2.420 2.520 025 2.926 3.026 F 265.286 2.802E4 388 655.299 7.721 Sig .000 000 538 000 000 Phụ lục (tt) NhietDo * CTMT Dependent Variable:OD600 95% Confidence Interval CTMT Mean Std Error Lower Bound Upper Bound CT1 1.727 035 1.655 1.798 CT2 2.548 035 2.477 2.619 CT3 2.917 035 2.845 2.988 25oC CT1 1.711 035 1.639 1.782 CT2 2.392 035 2.321 2.463 CT3 3.035 035 2.964 3.107 T-Test - Acinetobacter venetianus VPI – VT1 Group Statistics Nhiet N Mean Std Deviation Std Error Mean 30oC 18 2.39711 517927 122077 25oC 18 2.37933 562481 132578 Independent Samples Test OD600 Equal variances Equal variances assumed not assumed Levene's Test for F 6.622 Equality of Variances Sig .015 099 099 t-test for Equality T 33.771 34 of Means Df 089 086 Sig (2-tailed) 017778 017778 Mean Difference 180221 180221 Std Error -.348567 -.348475 Difference 384122 384031 NhietDo 30oC Lower 95% Confidence Upper Interval of the Difference One way - Acinetobacter venetianus VPI – VT1 Descriptives N Mean Std Std Deviation Error 95% Confidence Interval for Mean Lower Bound Upper Bound Minimum Maximum CT1 1.72667 132077 053920 1.58806 1.86527 1.600 1.860 CT2 2.54800 014967 006110 2.53229 2.56371 2.532 2.572 CT3 2.91667 061105 024946 2.85254 2.98079 2.844 3.000 Total 18 2.39711 517927 122077 2.13955 2.65467 1.600 3.000 Test of Homogeneity of Variances OD600 Levene Statistic 43.289 df1 df2 Sig 15 000 Phụ lục (tt) ANOVA OD600 Sum of Squares Between Groups Within Groups Total Df 4.453 107 4.560 Mean Square 15 17 F Sig 2.227 312.110 000 007 Post Hoc Tests Multiple Comparisons OD600 Dunnett T3 (I) CTMT CT1 CT2 CT3 (J) CTMT CT2 95% Confidence Interval Mean Difference Std (I-J) Error -.821333* 054265 Sig .000 Lower Bound -1.00405 Upper Bound -.63862 CT3 -1.190000* 059411 000 -1.37122 -1.00878 CT1 821333* 054265 000 63862 1.00405 * CT3 -.368667 025684 000 -.45252 -.28482 CT1 1.190000* 059411 000 1.00878 1.37122 CT2 * 000 28482 45252 368667 025684 * The mean difference is significant at the 0.05 level Phụ lục Kết phân tích số liệu mật độ quang bước sóng 600 nm khảo sát chủng Acinetobacter calcoaceticus anitratus VPI - SD phần mềm SPSS 16 Two way - Acinetobacter calcoaceticus anitratus VPI - SD Between-Subjects Factors Value Label NhietDo N 30oC 18 25oC 18 CT1 12 CT2 12 CT3 12 Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable:OD600 Source Type III Sum of Squares Df Mean Square Corrected Model 8.074a 1.615 Intercept 238.126 238.126 NhietDo 1.335 1.335 CTMT 5.996 2.998 NhietDo * CTMT 744 372 Error 243 30 008 Total 246.444 36 Corrected Total 8.318 35 a R Squared = 971 (Adjusted R Squared = 966) Estimated Marginal Means Grand Mean Dependent Variable:OD600 95% Confidence Interval CTMT Mean Std Error Lower Bound 2.572 015 NhietDo Dependent Variable:OD600 NhietDo 30oC 25oC CTMT Mean 2.764 2.379 Upper Bound 2.541 2.603 95% Confidence Interval Std Error Lower Bound Upper Bound 021 2.721 2.808 021 2.336 2.423 Dependent Variable:OD600 CTMT CT1 CT2 CT3 Mean 2.038 2.649 3.029 95% Confidence Interval Std Error Lower Bound Upper Bound 026 1.985 2.091 026 2.596 2.702 026 2.976 3.082 F 199.303 2.939E4 164.735 369.974 45.916 Sig .000 000 000 000 000 Phụ lục (tt) NhietDo * CTMT Dependent Variable:OD600 NhietDo 30oC 25oC CTMT CT1 95% Confidence Interval Std Error Lower Bound Upper Bound 037 2.290 2.440 Mean 2.365 CT2 2.906 037 2.831 2.981 CT3 3.022 037 2.947 3.097 CT1 1.711 037 1.636 1.786 CT2 2.392 037 2.317 2.467 CT3 3.035 037 2.960 T-Test – Acinetobacter calcoaceticus anitratus VPI - SD Group Statistics OD600 NhietDo 30oC N Mean Std Deviation 18 2.76444 307187 25oC 18 2.37933 Independent Samples Test Levene's Test for Equality of Variances t-test for Equality of Means Std Error Mean 072405 562481 F Sig T Df Sig (2-tailed) Mean Difference Std Error Difference 95% Confidence Interval of the Difference 3.110 Lower Upper 132578 Equal variances assumed 4.716 037 2.527 34 015 385111 151061 078119 692104 OD600 Equal variances not assumed 2.527 26.856 017 385111 151061 074781 695442 Descriptives OD600 N Mean Std Deviation Std Error 95% Confidence Interval for Mean Lower Bound Upper Bound Minimum Maximum CT1 2.36533 139110 056791 2.21935 2.51132 2.184 2.480 CT2 2.90600 079186 032327 2.82290 2.98910 2.852 3.016 CT3 3.02200 020513 008375 3.00047 3.04353 2.992 3.052 2.61168 2.91721 2.184 3.052 Tot 18 2.76444 307187 072405 al Test of Homogeneity of Variances OD600 Levene Statistic 13.935 df1 df2 Sig 15 000 Phụ lục (tt) ANOVA OD600 Sum of Squares Df Mean Square F Sig Between Groups 1.474 737 84.898 000 Within Groups 130 15 009 Total 1.604 17 Post Hoc Tests - Acinetobacter calcoaceticus anitratus VPI - SD Multiple Comparisons OD600 Dunnett T3 95% Confidence Interval (I) (J) Mean Difference Std CTMT CTMT (I-J) Error Sig Lower Bound Upper Bound CT1 CT2 -.540667* 065348 000 -.73434 -.34700 CT2 CT3 CT3 -.656667* 057405 000 -.84874 -.46459 CT1 540667* 065348 000 34700 73434 CT3 * 033395 039 -.22457 -.00743 CT1 656667* 057405 000 46459 84874 CT2 * 033395 039 00743 22457 -.116000 116000 * The mean difference is significant at the 0.05 level Phụ lục Hình ảnh Hình Giống chủng VPI - VT1 đĩa Hình Giống chủng VPI - SD đĩa petri petri Hình Bố trí thí nghiệm tủ ấm lắc Hình Hệ thống lên men tự động Hình Máy ly tâm liên tục Hình Hệ thống máy đơng khơ Hình Các bao chế phẩm sau đơng khơ bảo quản tủ lạnh 4oC Hình Máy trộn vi sinh ... sát điều kiện nuôi cấy tối ưu tạo chế phẩm từ hai chủng vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus anitratus VPI - SD Acinetobacter venetianus VPI VT1 có khả phân hủy dầu mỏ 1.2 Yêu cầu Khảo sát điều. .. VÀ THẢO LUẬN 28  4.1 Kết khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu 29 4.1.1 Kết khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu chủng VPI - VT1 29 4.1.2 Kết khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu. .. kiện nuôi cấy tối ưu hai chủng vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus anitratus VPI - SD Acinetobacter venetianus VPI - VT1 có khả phân hủy dầu mỏ Từ kết chọn môi trường nhiệt độ nuôi cấy tối ưu