Bước đầu khảo sát điều kiện nuôi cấy lactobacillus sporogenes

ĐẶT VẤN ĐỀ Trên thế giới, các bệnh loãng xương, gãy xương là những vấn đề về sức khỏe nghiêm trọng và chi phí chăm sóc y tế và quản lý là rất lớn. Ở Mỹ năm 1995, chi phí chăm sóc sức khỏe liên quan đến gãy xương do loãng xương là khoảng 13,8 tỷ USD 34. Theo một nghiên cứu về tỉ lệ loãng xương ở bệnh nhân trên 50 tuổi ở bệnh viện đa khoa huyện Cái Nước tỉnh Cà Mau, kết quả cho thấy tỷ lệ loãng xương chiếm 21,53 % 11. Ngoài ra các vấn đề về còi xương ở trẻ nhỏ cũng đang là một vấn đề cần được quan tâm. Một nghiên cứu cho thấy tỷ lệ còi xương ở trẻ em 136 tháng tuổi ở vùng miền núi phía Bắc là 14,4% 1. Trước đây, con người thường ít quan tâm đến vấn đề chăm sóc sức khỏe của xương từ lúc ban đầu và thường chỉ phát hiện ở giai đoạn sau của bệnh và thường phải dùng thuốc điều trị triệu chứng. Các thuốc điều trị loãng xương như Calci, vitamin D, Calcitonin. Tuy nhiên các thuốc này thường gây ra các tác dụng không mong muốn. Hiện nay, một số loại thực phẩm giúp phòng và điều trị loãng xương, giúp xương chắc khỏe có tác dụng rất tốt. Năm 2004, Tsukamoto nghiên cứu tác động trong quá trình chuyển hóa xương và vai trò ngăn ngừa loãng xương của MK7 46. Ngoài tác dụng trên xương MK7 cũng đã được chứng minh ngăn ngừa quá trình vôi hóa thành mạch, cải thiện sức khỏe tim mạch 22. Từ đây con người mới bắt đầu chú ý và nghiên cứu MK7. MK7 là một loại vitamin K2 có nguồn gốc tự nhiên, có trong các thực phẩm lên men đặc biệt có nhiều trong Natto một loại thực phẩm truyền thống của người Nhật được lên men bằng cách ủ đậu tương nấu chín với Bacillus subtilis natto 9. B. subtilis natto có khả năng sinh tổng hợp MK7 và khi thay đổi các điều kiện môi trường như nhiệt độ, cấp khí, dinh

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THANH QUỲNH TRANG BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY Lactobacillus sporogenes KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI – 2015 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THANH QUỲNH TRANG BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY Lactobacillus sporogenes KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: ThS. Kiều Thị Hồng DS. Tô Ngọc Sắc Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược HÀ NỘI – 2015 LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS. Kiều Thị Hồng, người đã trực tiếp hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em có thể hoàn thành khóa luận. Em xin chân thành cảm ơn TS. Đàm Thanh Xuân và DS. Tô Ngọc Sắc đã đóng góp nhiều ý kiến quý báu và tận tình giúp đỡ em thực hiện đề tài này. Em cũng xin cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Công nghiệp Dược đối với em trong suốt quá trình nghiên cứu và làm thực nghiệm tại bộ môn. Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn gia đình, thầy cô, bạn bè, những người luôn động viên, giúp đỡ em trong học tập và trong cuộc sống. Em xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 13 tháng 5 năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thanh Quỳnh Trang MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Đại cƣơng về probiotic 2 1.2. Lactobacillus sporogenes 3 1.2.1.  4 1.2.2. Lactobacillus sporogenes 7 1.2.3. Lactobacillus sporogenes  7 1.3. Đại cƣơng về sinh trƣởng và phát triển của vi sinh vật 8 1.3.1. ng 8 1.3.2. ng cu kin nuôi cn s ng và phát trin ca vi sinh vt 10 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu 12 2.1.1. Nguyên vt liu 12 ng s dng trong nghiên cu 12 2.1.3. Thit b. 13 2.2. Nội dung nghiên cứu. 13 2.2.1. Phân lp vi khun Lactobacillus sporogenes t ch phm Estromineral và nhn bit mt s m ca vi khun trong quá trình nuôi cy. 13 2.2.2. Kh ng cu kin nuôi cng sinh khi t c ca Lactobacillus sporogenes. 13 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu. 14 p L. sporogenes t ch phm Estromineral 14  ging trên thch nghiêng 14 y ging trong bình nón 14  ng ca vi khun 15 m màu quan sát bào t  15 nh tính ion lactat trong dch nuôi cy 16 Chƣơng 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18 3.1 . Phân lập vi khuẩn Lactobacillus sporogenes từ chế phẩm Estromineral và nhận biết một số đặc điểm của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy 18 3.1.1. Phân lp vi khun Lactobacillus sporogenes t ch phm Estromineral 18 3.1.2. Nhn bit mt s m ca vi khun Lactobacillus sporogenes trong quá trình nuôi cy 20 3.2. Khảo sát sơ bộ ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy đến lƣợng sinh khối tế bào thu đƣợc của Lactobacillus sporogenes 23 3.2.1. La chu kin cp khí thích hp 23 3.2.2. La chn thi gian nuôi cy Lactobacillus sporogenes 25  la chng thích h nuôi cy Lactobacillus sporogenes 27 3.2.4. Kh ng ca ngun hydrat carbon 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid deoxyribo nucleic ATP Adenosin triphosphat B. subtilis Bacillus subtilis B. clausii Bacillus clausii C. butyricum Clostridium butyricum GYE Glucose  cao nm men h Gi L. acidophilus Lactobacillus acidophilus L. kefir Lactobacillus kefir L. sporogenes Lactobacillus sporogenes MRS (de Man, Rogosa and Sharpe) ng nuôi cy vi khun lactic OD (optical density) M quang rpm (revolutions per minute) Vòng mi phút DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 1.1 n ca Lactobacillus sporogenes vi các chi Bacillus và Lactobacillus 5 1.2 Mt s ch phm probiotic cha Lactobacillus sporogenes trên th ng 8 2.1 Các hóa cht s d tài 12 2.2 Các thit b s d tài 13 3.1 Giá tr    ca dch nuôi cy Lactobacillus sporogenes ng MRS ti các thm kho sát 21 3.2 ng sinh kh   c khi nuôi cy Lactobacillus sporogenes u kin cp khí khác nhau. 24 3.3 Giá tr pH và m  quang ca dch nuôi cy Lactobacillus sporogenes ti các thm kho sát 26 3.4 ng sinh kh   c khi nuôi cy Lactobacillus sporogenes ng khác nhau 28 3.5 ng sinh kh   c khi nuôi cy Lactobacillus sporogenes      ng có s dng các long khác nhau 30 3.6 ng sinh kh   c khi nuôi cy Lactobacillus sporogenes ng vi các n khác nhau. 32 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ STT Tên hình vẽ, đồ thị Trang 1.1 S  cha t probioticc g d liu PubMed NIH (t  3 1.2 Hình nh nhum Gram t bào vi khun Lactobacillus sporogenes 4 1.3 Gi cu to bào t Lactobacillus sporogenes 6 1.4 ng ca vi sinh vt trong h thng kín (Theo sách ca Prescott, Harley và Klein) 9 2.1  phn nh tính (1) ion lactat  16 2.2  phn nh tính (2) ion lactate 17 3.1 Hình nh khun lc Lactobacillus sporogenes petri 19 3.2 Hình nh t ng ca Lactobacillus sporogenes ti thi m 24h 19 3.3 Hình nh t ng và bào t ca Lactobacillus sporogenes ti thm 48h 21 3.4 Kt qu phn nh tính ion lactat (1) 21 3.5 Kt qu phn nh tính ion lactat (2) 21 3.6  th biu din s bing sinh khc khi nuôi cy L. sporogenes vu kin cp khí khác nhau 24 3.7 ng ca Lactobacillus sporogenes khi nuôi cy ng MRS, 37 o C, 110 rpm 26 3.8  th biu din s bing sinh khc khi nuôi cy L. sporogenes vng khác nhau 28 3.9  th biu din s bing sinh khc khi nuôi cy L. sporogenes vi các long khác nhau 30 3.10  th biu din s bing sinh khc khi nuôi cy L. sporogenes vi các n ng khác nhau 32 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Probiotic c bin là các li khun có nhiu giá tr thit thi vi sc khng nhing tiêu hóa, ci thin kh  nng min dch, gi[23]. Probiotic  c s dng t r rong vài thp k tr l ng nghiên cu v probiotic  ch phm probiotic có mt trên th ng xut hin ngày càng nhiu [22]. Trong s các probiotic c s dng, không th không k n Lactobacillus sporogenest chng vi khun có rt nhic tính ni tri: có kh  sinh bào t giúp chng chu tt vu kin bt li c l su qu u tr; có kh ng hình to acid L (+)  có th chuyn hóa h[6]. Ti Vit Nam, vi khun Lactobacillus sporogenes c nghiên cu trong nh ng nghiên cu và tp trung ch yu vào nhóm ngành thc phm và thú y. Vi mong mun góp phn nh vào nghiên cu L. sporogenes  Vi tài “Bƣớc đầu khảo sát điều kiện nuôi cấy Lactobacillus sporogenes” c thc hin vi các mc tiêu: 1. Phân lp vi khun Lactobacillus sporogenes t ch phm Estromineral và nhn bit mt s m ca vi khun trong quá trình nuôi cy. 2. Kh ng cu kin nuôi cn ng sinh khi t bào c ca Lactobacillus sporogenes. 2 Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1. Đại cƣơng về probiotic Thut ng probiotic có ngun gc t Hy L       ch i sn, nên probiotic có th hiu n vi si. Hi cht b ng cha nhng vi khun hay vi nm có ích [17], [19]. t s dng các thc phm có vi sinh vt sng có l       nhng sc khe, nmãi n hái nim probiotic mc nêu ra ln u tiên bi nhà khoa hc Eli Metchnikoff trong cu sa ông. Ông   ph thuc ca h vi sinh vt trong rut vào thc phng rut có kh p nhn  m i các h vi khu và thay th vi khun có hi bng vi khun có l[13], [20]. Theo Parker (1974), probiotic là nhng vi sinh vn hay nm men mà có th thêm vào thc phm vi mu chnh qun th sinh vng rut ca sinh vt ch. Van De Kerkove (1979), Barrows và Deam (1985), Lestradet (1995) cùng cho rng probiotic c s dt liu pháp trong viu tr bnh tiêu chnh  ng v gin mc ti thiu s phát tán ca vi sinh vng rut, s kháng li liu pháp sinh hc và s a chng viêm d dày ru  rnh ng v probioticProbiotic là các vi khu l hay hn hp các vi sinh vt sng khi i hong vt s có ng có li cho sinh vt ch bng cách ci thin h vi khung rut[20].   T ch    gii (FAO) và T chc Y t th gii (WHO)  probiotic Probiotic là nhng vi sinh vt s vi m ln s ng có li cho sc khe vt ch [19], [20].  không phi tt c nhng vi sinh vt s là probiotic, ta t chc FAO và WHO, vi khuc s dng trong các ch phm probiotic dng thc phm phu kin: có ngun [...]... Nhận biết một số đặc điểm của vi khuẩn L sporogenes trong quá trình nuôi cấy 2.2.2 Khảo sát sơ bộ ảnh hƣởng của các điều kiện nuôi cấy đến lƣợng sinh khối tế bào thu đƣợc của Lactobacillus sporogenes  Lựa chọn điều kiện cấp khí thích hợp  Lựa chọn thời gian nuôi cấy L sporogenes 14  Sơ bộ lựa chọn môi trường dinh dưỡng thích hợp để nuôi cấy L sporogenes  Khảo sát sơ bộ ảnh hưởng của nguồn hydrat carbon... sinh khối tế bào của quá trình nuôi cấy Do đó, phải khảo sát để tìm ra điều kiện cấp khí thích hợp nhất cho nuôi cấy vi khuẩn  Mục tiêu Lựa chọn được điều kiện cấp khí thích hợp cho nuôi cấy Lactobacillus sporogenes để thu được lượng sinh khối tế bào lớn nhất  Tiến hành Tiến hành nuôi cấy L sporogenes trong môi trường MRS ở 37oC trong 24 giờ tại hai điều kiện có cấp khí (nuôi trong máy lắc với tốc độ... tổng hợp acid lactic, có khả năng sinh bào tử (quan sát được tại thời điểm 48h tính từ khi bắt đầu nuôi cấy) 23 3.2 Khảo sát sơ bộ ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy đến lƣợng sinh khối tế bào thu đƣợc của Lactobacillus sporogenes Vi sinh vật sinh trưởng và phát triển chịu ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố như thành phần môi trường dinh dưỡng hay các điều kiện bên ngoài Các yếu tố khác nhau lại có những ảnh... thu được khi nuôi cấy L sporogenes với các điều kiện cấp khí khác nhau  Nhận xét - Sau 24 giờ đều thu được sinh khối từ dịch lên men trong cả 2 điều kiện có và không có cấp khí - Lượng sinh khối tế bào thu được khi ly tâm dịch lên men trong điều kiện có cấp khí lớn hơn (0,813 gam) Lượng sinh khối tế bào thu được từ dịch lên men trong điều kiện không có cấp khí đạt 57,44% so với trong điều kiện có cấp... [16] Vì vậy, đề tài lựa chọn điều kiện nuôi cấy có cấp khí, cụ thể là nuôi trong máy lắc với tốc độ quay 110 rpm, để thu được lượng sinh khối tế bào là lớn nhất 3.2.2 Lựa chọn thời gian nuôi cấy Lactobacillus sporogenes Lượng sinh khối tế bào thu được phụ thuộc vào thời gian nuôi cấy, do đó, cần xác định thời điểm thích hợp để thu được lượng sinh khối là lớn nhất Để khảo sát sự tăng lên của sinh khối,... ta xây dựng được đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Lactobacillus sporogenes OD 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 giờ Hình 3.7 Đường cong sinh trưởng của Lactobacillus sporogenes khi nuôi cấy trong môi trường MRS ở 37oC, 110 rpm  Nhận xét Khi nuôi cấy Lactobacillus sporogenes trong môi trường MRS ở 37oC, trong điều kiện có cấp khí, nhận thấy có sự tăng lên về lượng... có cấp khí (nuôi trong tủ ấm) Các thao tác nuôi cấy được thực hiện như đã nêu ở mục 2.3.3 Sau 24h, tiến hành xử lý dịch lên men bằng phương pháp ly tâm thu sinh khối tế bào như mục 2.3.4  Kết quả Xử lý số liệu lượng sinh khối thu được từ các bình dịch nuôi cấy trong các điều kiện cấp khí được bằng Microsoft Office Excel: 24 Bảng 3.2 Lượng sinh khối tươi thu được khi nuôi cấy Lactobacillus sporogenes. .. Đặc điểm hình thái: - Lactobacillus sporogenes được mô tả là trực khuẩn Gram dương, hình que, kích thước 0,5 – 0,7µm × 1,6 – 7,1 µm, có khả năng di động, có khả năng sinh bào tử [10], [14] - Tế bào Lactobacillus sporogenes có xu hướng mọc đơn hoặc hiếm khi ở dạng chuỗi ngắn [10], [14] Hình 1.2 Hình ảnh nhuộm Gram tế bào vi khuẩn Lactobacillus sporogenes  Điều kiện nuôi cấy: - L sporogenes là vi khuẩn... trạng nhiễm toan chuyển hóa cho cơ thể [8], [22] Lactobacillus sporogenes có các đặc tính chung của cả hai chi Lactobacillus và Bacillus, bảng dưới đây so sánh các đặc tính cơ bản của Lactobacillus sporogenes với hai chi này Bảng 1.1 So sánh các đặc tính cơ bản của Lactobacillus sporogenes với các chi Bacillus và Lactobacillus [10] Đặc tính L sporogenes Lactobacillus Bacillus Catalase + - + Oxidase -... này được biết đến với cả hai tên gọi trên, nhưng tên gọi Lactobacillus sporogenes vẫn được sử dụng nhiều hơn trong các chế phẩm thương mại xuất hiện trên thị trường Do nguồn gốc của giống vi sinh vật trong khóa luận, tên gọi Lactobacillus sporogenes sẽ được sử dụng 1.2.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, điều kiện nuôi cấy Lactobacillus sporogenes tồn tại trong tự nhiên ở hai dạng: dạng tế bào . nghiên cu L. sporogenes  Vi tài “Bƣớc đầu khảo sát điều kiện nuôi cấy Lactobacillus sporogenes c thc hin vi các mc tiêu: 1. Phân lp vi khun Lactobacillus sporogenes t. TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THANH QUỲNH TRANG BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY Lactobacillus sporogenes KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: ThS. Kiều. BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THANH QUỲNH TRANG BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY Lactobacillus sporogenes KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI – 2015 BỘ