Lượng sinh khối tế bào thu được phụ thuộc vào thời gian nuôi cấy, do đó, cần xác định thời điểm thích hợp để thu được lượng sinh khối là lớn nhất.
Để khảo sát sự tăng lên của sinh khối, đề tài lựa chọn phương pháp đo độ hấp thụ quang A (hay mật độ quang OD) của dịch nuôi cấy. So với phương pháp ly tâm cân lượng sinh khối tươi, phương pháp này nhanh hơn và tiết kiệm được lượng môi trường sử dụng. Độ hấp thụ A tỉ lệ thuận với nồng độ tế bào, thông qua việc đo độ hấp thụ quang có thể xác định được sinh khối vi sinh vật, khi số lượng tế bào tăng lên sẽ dẫn đến trị số OD tăng [2].
Mục tiêu
Lựa chọn thời gian nuôi cấy Lactobacillus sporogenes thích hợp để thu được lượng sinh khối tế bào lớn nhất.
Tiến hành
Tiến hành nuôi cấy L. sporogenes trong môi trường MRS ở nhiệt độ 37oC, tốc độ 110 rpm, thực hiện theo các thao tác như ở mục 2.3.4.
Tại các thời điểm 0h, 3h, 6h, 9h, 24h, 27h, 30h, 33h, 48h tính từ khi bắt đầu cấy giống vào môi trường dinh dưỡng, tiến hành trích mẫu dịch nuôi cấy đem thử pH sơ bộ và đo quang tại bước sóng 610 nm.
Kết quả
Giá trị mật độ quang và pH của dịch nuôi cấy tại các thời điểm được thể hiện trong bảng sau:
Bảng 3.3. Giá trị pH và mật độ quang của dịch nuôi cấy L. sporogenes tại các thời điểm khảo sát Thời điểm (giờ) OD Tỉ lệ so với OD(0) pH Thời điểm (giờ) OD Tỉ lệ so với OD(0) pH 0 0,105 - 6 27 2,381 22,68 5 3 0,369 3,51 6 30 2,372 22,59 5 6 1,050 10,00 6 33 2,344 22,32 5 9 1,709 16,28 6 48 2, 403 22,86 5 24 2,369 22,56 5 51 - - 5 Ghi chú: (-): thí nghiệm không tiến hành.
Dựa vào giá trị OD từ bảng trên, ta xây dựng được đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Lactobacillus sporogenes.
Hình 3.7. Đường cong sinh trưởng của Lactobacillus sporogenes khi nuôi cấy trong môi trường MRS ở 37o
C, 110 rpm Nhận xét
Khi nuôi cấy Lactobacillus sporogenes trong môi trường MRS ở 37oC, trong điều kiện có cấp khí, nhận thấy có sự tăng lên về lượng sinh khối tế bào và sự giảm xuống của pH dịch lên men (từ 6 xuống 5).
- Trong khoảng từ 0 – 3 giờ đầu sau khi cấy giống, lượng sinh khối tăng dần lên, nhưng tốc độ tăng còn chậm, giá trị OD tăng gấp 3,51 lần so với ban đầu. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 OD giờ
- Khoảng thời gian từ 3 – 9 giờ sau khi cấy giống, lượng vi khuẩn tăng lên nhanh chóng, đồ thị biểu diễn giai đoạn này gần như là đường thẳng, giá trị OD tại thời điểm 9h là 1,709, cao gấp 16,28 lần so với lúc 0h.
- Lượng sinh khối trong dịch lên men đạt mốc cao nhất vào thời điểm 24 giờ (giá trị OD là 2,369, cao gấp 22,56 lần so với lúc 0h) và thay đổi hầu như không đáng kể trong 24 giờ tiếp theo của quá trình nuôi cấy (khoảng thời gian từ 24 – 48 giờ).
Dựa vào các số liệu trong bảng 3.1 và hình 3.8, có thể thấy được Lactobacillus sporogenes sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện nuôi cấy, giá trị OD tăng biểu thị cho sự tăng lên của lượng sinh khối tế bào, vi khuẩn có khả năng tổng hợp acid lactic nên làm giảm pH của môi trường.
Bàn luận
Lượng sinh khối tế bào tăng mạnh mẽ sau khi nuôi cấy và đạt mốc cao nhất kể từ thời điểm 24h. Vì vậy, để thu được lượng sinh khối tế bào là lớn nhất và đạt hiệu quả về kinh tế, đề tài lựa chọn thời điểm thu sản phẩm lên men là 24h tính từ lúc bắt đầu cấy giống vi sinh vật vào môi trường dinh dưỡng.
3.2.3. Sơ bộ lựa chọn môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp để nuôi cấy
Lactobacillus sporogenes
Vi sinh vật sử dụng nguồn dinh dưỡng từ môi trường để phục vụ cho các hoạt động sống của chúng. Muốn nghiên cứu và ứng dụng bất kỳ một vi sinh vật nào thì trước hết đều phải tìm hiểu và xác định được môi trường dinh dưỡng thích hợp cho sự sinh trưởng của từng loài.
Mục tiêu
Sơ bộ lựa chọn môi trường dinh dưỡng thích hợp cho nuôi cấy Lactobacillus sporogenes để lượng sinh khối tế bào thu được lớn nhất.
Tiến hành
Tiến hành nuôi cấy L. sporogenes trong các môi trường MRS, GYE, canh thang ở 37o
C, 110 rpm trong 24 giờ, các thao tác nuôi cấy được thực hiện như đã nêu ở mục 2.3.3.
Sau 24h, tiến hành xử lý dịch lên men bằng phương pháp ly tâm thu sinh khối tế bào như mục 2.3.4.
Kết quả
Lượng sinh khối tươi thu được sau ly tâm dịch lên men khi nuôi cấy
Lactobacillus sporogenes trong các môi trường được xử lý số liệu trong Microsoft Office Excel và thể hiện trong bảng sau:
Bảng 3.4. Lượng sinh khối tươi thu được khi nuôi cấy Lactobacillus sporogenes
trên các môi trường khác nhau
Dựa vào kết quả lượng sinh khối trung bình trong bảng, ta vẽ được đồ thị:
Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên lượng sinh khối tươi thu được khi nuôi cấy
L. sporogenes với các môi trường dinh dưỡng khác nhau Nhận xét
- Lactobacillus sporogenes có khả năng sinh trưởng khi nuôi cấy trong cả ba môi trường dinh dưỡng đã khảo sát.
0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000
MRS Canh thang GYE
L ượng s inh khố i ( gam ) Môi trường Môi trƣờng
Lƣợng sinh khối (gam) Độ lệch chuẩn (SD) Tỉ lệ Xmôi trƣờng/XMRS Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình (X) MRS 0,82 0,80 0,82 0,813 0,012 - Canh thang 0,59 0,61 0,59 0,597 0,012 73,43% GYE 0,60 0,60 0,61 0,603 0,006 75,09%
- Lượng sinh khối tươi thu được từ dịch nuôi cấy trong môi trường MRS là lớn nhất (0,813 gam).
- So với môi trường MRS, lượng sinh khối tươi thu được từ dịch nuôi cấy trong môi trường canh thang là 73,43%, trong môi trường GYE là 75,09%. Bàn luận
Kết quả thí nghiệm có thể giải thích do vi sinh vật sẽ phát triển tốt hơn trong môi trường giàu dinh dưỡng và đa dạng về thành phần do mỗi nguồn dinh dưỡng lại có những vai trò riêng đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật [2]. Trong ba môi trường đã khảo sát: môi trường canh thang không có nguồn hydrat carbon, môi trường MRS đa dạng về thành phần dinh dưỡng hơn môi trường GYE, do đó, vi sinh vật có thể sinh trưởng tốt nhất trong môi trường MRS.
Do đó, đề tài quyết định lựa chọn MRS làm môi trường nuôi cấy Lactobacillus sporogenes để lượng sinh khối tế bào thu được là lớn nhất.
3.2.4. Khảo sát sơ bộ ảnh hƣởng của nguồn hydrat carbon
Vi sinh vật cần sử dụng nguồn carbon cho sự tồn tại và phát triển của chúng, carbon có thể chiếm đến khoảng một nửa trọng lượng khô của tế bào. Đường nói chung là nguồn carbon và nguồn năng lượng tốt cho vi sinh vật. Nhưng tuỳ từng loại đường mà vi sinh vật có những khả năng sử dụng khác nhau. Do đó, cần phải xác định được nguồn đường và nồng độ sử dụng thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của từng loài.
Mục tiêu
Lựa chọn được nguồn đường và nồng độ sử dụng thích hợp cho nuôi cấy
Lactobacillus sporogenes để thu được lượng sinh khối lớn nhất.
3.2.4.1. Sơ bộ lựa chọn loại đƣờng thích hợp cho nuôi cấy L. sporogenes
Tiến hành
Tiến hành nuôi cấy L. sporogenes trong các môi trường MRS có sử dụng các loại đường: glucose, lactose, maltose, saccharose ở 37oC, 110 rpm trong 24 giờ, các thao tác nuôi cấy được thực hiện như đã nêu ở mục 2.3.3.
Sau 24h, tiến hành xử lý dịch lên men bằng phương pháp ly tâm thu sinh khối tế bào như mục 2.3.4.
Kết quả
Bảng 3.5. Lượng sinh khối tươi thu được khi nuôi cấy Lactobacillus sporogenes
trong các môi trường MRS có sử dụng các loại đường khác nhau
Loại đƣờng
Lƣợng sinh khối (gam) Độ lệch chuẩn (SD) Tỉ lệ Xđƣờng/XGlucose Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình (X) Glucose 0,80 0,82 0,79 0,803 0,015 - Lactose 0,70 0,70 0,69 0,697 0,006 86,80% Maltose 0,68 0,70 0,70 0,693 0,012 86,30% Saccharose 0,61 0,62 0,61 0,613 0,006 76,34%
Dựa vào kết quả lượng sinh khối trung bình trong bảng, ta vẽ được đồ thị:
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên lượng sinh khối tươi thu được khi nuôi cấy
L. sporogenes với các loại đường khác nhau 0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000
Glucose Lactose Maltose Saccharose
L ượ ng s inh khối (g am ) Loại đường
Nhận xét
Lượng sinh khối tươi thu được từ dịch nuôi cấy Lactobacillus sporogenes trong các bình môi trường không giống nhau. Lượng sinh khối tươi thu được từ dịch nuôi cấy Lactobacillus sporogenes trong môi trường có chứa glucose là lớn nhất (0,803 gam). So với khi sử dụng glucose, lượng sinh khối tươi thu được khi sử dụng lactose là 86,80%, khi sử dụng maltose là 86,30%, khi sử dụng saccharose là 76,34%.
Bàn luận
Kết quả này có điểm tương đồng với nghiên cứu của DS. Nguyễn Thị Bích Ngọc năm 2011 khi “Lựa chọn nguồn hydrat carbon cho nuôi cấy Bacillus clausii”
[4]. Glucose là một đường đơn được sử dụng thường xuyên trong công nghiệp lên men mà vi khuẩn dễ dàng sử dụng. Điều này có thể giải thích do glucose được vận chuyển qua màng tế bào chất của vi khuẩn và tham gia vào quá trình đường phân sinh năng lượng nhờ các enzym của vi sinh vật.
Từ kết quả thí nghiệm trên, đề tài quyết định lựa chọn sử dụng glucose cho nuôi cấy Lactobacillus sporogenes để lượng sinh khối tế bào thu được là lớn nhất.
3.2.4.2 Sơ bộ lựa chọn nồng độ đƣờng thích hợp cho nuôi cấy L. sporogenes
Tiến hành
Tiến hành nuôi cấy L. sporogenes trong các môi trường MRS có sử dụng glucose với các nồng độ: 0%, 1%, 2% và 4% ở 37oC, 110 rpm trong 24 giờ, các thao tác nuôi cấy được thực hiện như đã nêu ở mục 2.3.3.
Sau 24h, tiến hành xử lý dịch lên men bằng phương pháp ly tâm thu sinh khối tế bào như mục 2.3.4.
Kết quả
Bảng 3.6. Lượng sinh khối tươi thu được khi nuôi cấy Lactobacillus sporogenes
trong các môi trường dinh dưỡng có đường với các nồng độ khác nhau
Nồng độ đƣờng
Lƣợng sinh khối (gam) Độ lệch chuẩn (SD) Tỉ lệ Xnồng độ/X2% Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình (X) 0% 0,20 0,19 0,20 0,197 0,006 24,63% 1% 0,73 0,74 0,72 0,730 0,010 91,25% 2% 0,79 0,80 0,81 0,800 0,010 - 4% 0,59 0,60 0,62 0,603 0,015 75,38%
Dựa vào kết quả lượng sinh khối trung bình trong bảng, ta vẽ được đồ thị:
Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên lượng sinh khối tươi thu được khi nuôi cấy L. sporogenes với các nồng độ đường khác nhau
Nhận xét
Lượng sinh khối tươi thu được từ dịch nuôi cấy Lactobacillus sporogenes trong các bình môi trường không giống nhau. Lượng sinh khối tươi thu được từ dịch nuôi cấy Lactobacillus sporogenes trong môi trường có chứa glucose ở nồng độ 2% là lớn nhất (0,8 gam). So với khi sử dụng glucose nồng độ 2%, lượng sinh khối tươi thu được khi không bổ sung glucose là 24,63%, khi sử dụng glucose nồng độ 1% là 91,25%, khi sử dụng glucose nồng độ 4% là 75,38%. 0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 0% 1% 2% 4% L ượ ng s in h kh ối (g am ) Nồng độ đường
Bàn luận
Khi không bổ sung glucose vào môi trường dinh dưỡng hoặc có bổ sung với nồng độ 1%, lượng hydrat carbon chưa đủ để vi khuẩn đồng hóa, do đó vi khuẩn sinh trưởng kém hơn, lượng sinh khối thu được thấp hơn khi sử dụng glucose với nồng độ 2%. Mặt khác, màng tế bào chất của vi khuẩn là màng bán thấm, do đó khi sử dụng glucose với nồng độ 4% có thể tạo môi trường ưu trương, tế bào bị mất nước và các chất hòa tan bao quanh: tế bào chịu trạng thái khô sinh lý, bị co sinh chất, có thể bị chết nếu kéo dài [2]. Do đó, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn, lượng sinh khối thu được thấp hơn khi sử dụng glucose ở nồng độ 2%.
Từ kết quả thí nghiệm trên, đề tài quyết định lựa chọn sử dụng glucose với nồng độ 2% cho nuôi cấy L. sporogenes để lượng sinh khối tế bào thu được là lớn nhất.
Kết luận:
Từ kết quả các thí nghiệm đã nghiên cứu, rút ra kết luận: khi nuôi cấy
Lactobacillus sporogenes trong môi trường MRS (có bổ sung glucose với nồng độ 2%) trong máy lắc có ủ ấm ở nhiệt độ 37oC, tốc độ lắc 110 rpm thì sau 24 giờ lượng sinh khối thu được lớn nhất. So với lượng sinh khối thu được từ dịch lên men trong điều kiện trên, lượng sinh khối thu được trong điều kiện nuôi cấy không có cấp khí chỉ đạt 57,44%; lượng sinh khối trong dịch nuôi cấy trong môi trường canh thang chỉ là 73,43%, trong môi trường GYE chỉ là 75,09%; lượng sinh khối thu được khi sử dụng lactose, maltose, saccharose lần lượt là 86,80%, 86,30% và 76,34%; lượng sinh khối thu được khi bổ sung glucose với các nồng độ 0%, 1%, 4% lần lượt là 24,63%, 91,25% và 75,38%.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
I. Kết luận
Đề tài đã thu được các kết quả như sau:
1. Phân lập được vi khuẩn Lactobacillus sporogenes thuần nhất từ chế phẩm Estromineral của Rottapharm | Madaus (Italia). Nhận biết một số đặc điểm của
Lactobacillus sporogenes trong quá trình nuôi cấy: có khả năng sinh acid lactic, có khả năng tạo bào tử (quan sát được tại thời điểm 48h).
2. Sơ bộ xác định được ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến lượng sinh khối tế bào thu được của Lactobacillus sporogenes. Khi nuôi cấy vi khuẩn
Lactobacillus sporogenes trong môi trường MRS (bổ sung glucose với nồng độ 2%) trong điều kiện có cấp khí (tốc độ lắc 110 rpm) ở 37oC thì lượng sinh khối tế bào thu được sau 24 giờ lớn nhất.
II. Kiến nghị
Do thời gian nghiên cứu có hạn nên khóa luận vẫn chưa giải quyết hết được các vấn đề liên quan. Vì vậy, chúng tôi đề xuất một số hướng nghiên cứu tiếp như sau:
- Xác định ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ, pH, tốc độ cấp khí… đến sự sinh trưởng của vi khuẩn Lactobacillus sporogenes.
- Nghiên cứu khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn Lactobacillus sporogenes: các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hình thành bào tử, thời điểm tối ưu để thu bào tử, khả năng sống của bào tử trong các điều kiện bảo quản…
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Bộ Y tế (2009), Dược Điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản Y học.
2. Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (2011), Vi sinh vật học, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
3. Nguyễn Văn Minh, Kỹ thuật vi sinh cơ sở, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 39 – 41.
4. Nguyễn Thị Bích Ngọc (2012), Khảo sát điều kiện nuôi cấy vi khuẩn Baccillus clausii, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội.
5. Lê Xuân Phương (2008), Thí nghiệm vi sinh vật học, Đại học Đà Nẵng. 6. Trần Hạnh Triết (2005), Nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng và phát triển của
vi khuẩn Lactobacillus sporogenes, Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
7. Huỳnh Đặng Hà Uyên (2009), Tuyển chọn vi khuẩn lên men lactic có tiềm năng probiotic, Đồ án tốt nghiệp, Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.
Tài liệu tiếng Anh
8. Ali O. Büyükkileci, Sebnem Harsa (2004), “Batch production of L (+) lactic acid from whey by Lactobacillus casei”, Journal of Chemical Technology and Biotechnology, Vol. 79, Issue 9, 1036 – 1040.
9. Bergey D. (1993), Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 9th edition, Baltimore, MD: The Williams and Wilkens Company.
10.L. Drago, E. De Vecchi (2006), “Lactobacillus sporogenes or Bacillus coagulans: Misidentification or mislabeling?”, International Journal of Probiotic and Prebiotics Vol. 1, No. 1, 3 -10.
11.L. Drago, E. de Vecchi (2009), “Should Lactobacillus sporogenes and
Bacillus coagulans Have a Future?”, Journal of Chemotherapy, Vol. 21, No. 4, 371 – 377.
12.FAO/WHO (2002), "Guidelines for the evaluation of probiotic in food. Joint FAO/WHO working group report on drafting guidelines for the evaluation of probiotic in food”, London, Ontario, Canada.
13.FAO/WHO (2001), Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation on