KHẢO sát điều KIỆN NUÔI cấy nấm MEN RHODOTOR ULA SP TRÊN môi TRƯỜNG bán rắn

Nấm men là tên chung để chỉ nhóm nấm thường có cấu tạo đơn bào và thường sinh sản vô tính theo lối nảy chồi. Nấm men không thuộc về một nhóm phân loại nào nhất định, chúng có thể thuộc ngành Nấm túi (Ascomycota) hoặc ngành Nấm đảm (Basidiomycota). Nấm men phân bố hết sức rộng rãi trong tự nhiên: đất, nước, lương thực thực phẩm, rau quả,… Đặc biệt chúng hiện diện nhiều ở các môi trường chứa đường, pH thấp: đất trồng nho và cây ăn quả. Nấm men có khả năng sinh sản nhanh chóng, sinh khối giàu protein, vitamin và lipid. Vì vậy chúng được sử dụng rộng rãi trong công nghệ chế biến rượu trắng, rượu vang, bia, cồn, thức ăn bổ sung cho người và gia súc, làm nở bột mì, gây hương nước chấm, làm dược phẩm, sản xuất enzym, sản xuất acid citric từ khí thiên nhiên, sản xuất riboflavin (vitamin B2), .... Bên cạnh rất nhiều nấm men có ích còn có những loại nấm men có thể gây bệnh (Candida, Mycoderma). 2.1.2 Hình dạng và kích thước của tế bào nấm men 3, 7 · Hình dạng nấm men 7 Nấm men thường có cấu tạo đơn bào. Hình dạng tế bào nấm men thường thay đổi tùy theo loài, ngoài ra một phần còn phụ thuộc vào tuổi giống và điều kiện ngoại cảnh, điều kiện nuôi cấy. Nói chung nấm men thường có hình trứng, bầu dục (Saccharomyces serevisiae), hình cầu (Candida utilis), hình oval hoặc elip, hình ống (Pychia), hình trụ, hình quả chanh, hình tam giác,…và một số hình dạng đặc biệt. Hình dạng của nấm men hầu như không ổn định, nó phụ thuộc vào tuổi của nấm men và điều kiện nuôi cấy. Ngoài ra một số loài nấm men có tế bào hình que nối với nhau thành những sợi gọi là khuẩn ty hoặc khuẩn ty giả, thường gặp ở các giống Endomycopsis, Candida, Trichosporon. · Kích thước tế bào nấm men 7 Kích thước tế bào nấm men thay đổi rất nhiều, theo từng giống, từng loài, hay tuổi sinh lý. Nói chung thường to hơn tế bào vi khuẩn từ 5 ÷ 10 lần. Kích thước trung bình của tế bào nấm men. · Chiều dài: 9 ÷ 10 μm. · Chiều rộng: 2 ÷ 7 μm. Các loài nấm men đơn bào trong công nghiệp thường có kích thước 3 – 5 μm. x 5 10 μm.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÌNH DƯƠNG KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN CNSH ĐỀ TÀI: KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY NẤM MEN RHODOTOR ULA SP TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN GVHD: Th.S NGUYỄN MINH KHANG Th.S TRƯƠNG HUỲNH HUY SVTH: NGUYỄN THANH TRÚC BÌNH DƯƠNG – 2009 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÌNH DƯƠNG KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THANH TRÚC KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY NẤM MEN ROHODOTO RULA SP TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC: CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC Th.S Nguyễn Minh Khang Th.S Trương Huỳnh Huy Bình Dương – 2009 Chương MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Xã hội ngày phát triển kéo theo phát triển ngành khoa học kỹ thuật Công nghệ sinh học trở thành ngành quan tâm hàng đầu giới nói chung Việt Nam nói riêng Công nghệ sinh học phát triển nhanh chóng tạo cách mạng sinh học ngành nông nghiệp công nghiệp thực phẩm, làm thay đổi phương thức sản xuất ngành y dược, lượng khai khoáng bảo vệ môi trường Đối với Việt Nam, đất nước nông nghiệp việc ứng dụng xử lý tái chế nguồn phế phụ phẩm từ động vật thực vật ngành sản xuất nông nghiệp công nghệ thực phẩm, biến đổi nguồn nguyên liệu rẻ tiền để tạo sản phẩm có chất lượng cao, giảm nguy ô nhiễm môi trường mang lại hiệu kinh tế cho xã hội Vitamin A có vai trò quan trọng đời sống người vật nuôi Nguồn nguyên liệu thực vật vi sinh vật xem nguồn cung cấp dồi sắc tố carotenoid nói chung tiền vitamin A nói riêng Và giống nấm men có khả tổng hợp sắc tố carotenoid chủ yếu beta-caroten Rhodotorula sp Beta-caroten hợp chất có hoạt tính sinh học cao có vai trò quan trọng người động vật Các nhà khoa học chứng minh tỷ lệ beta-caroten thức ăn gắn liền với việc giảm nguy nhiều bệnh ung thư, trẻ hóa da, giảm tỷ lệ tử vong bệnh tim mạch,… Với lợi ích vậy, ứng dụng trình lên men bán rắn từ phụ phẩm dồi rẻ tiền ngành công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp,… Đây mục tiêu đề tài “Khảo sát điều kiện nuôi cấy nấm men Rhodotorula sp môi trường bán rắn” 1.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Lựa chọn môi trường bán rắn thích hợp cho việc nuôi cấy nấm men đỏ Rhodotorula sp - Tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy - Thử nghiệm sản xuất kiểm tra hàm lượng beta-caroten chế phẩm từ nấm men đỏ Rhodotorula sp môi trường tối ưu 1.3 MỤC ĐÍCH ĐỀ TÀI Khảo sát điều kiện tối ưu cho phát triển nấm men đỏ Rhodotorula sp môi trường bán rắn thông qua việc tận dụng nguồn nguyên vật liệu phụ phẩm rẻ tiền từ ngành nông nghiệp, công nghiệp, công nghiệp thực phẩm,… để thu lượng sinh khối cao Canh trường giai đoạn sấy khô Chế phẩm beta-caroten dạng bột mịn Chế phẩm beta-caroten đóng gói dán nhãn PHỤ LỤC CÁC BẢNG PHÂN TÍCH VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU 4.1 CÁC BẢNG PHÂN TÍCH 4.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát môi trường nuôi cấy bán rắn thích hợp 4.1.1.1 Bảng phân tích ANOVA ANOVA Table for Mat te bao by Moi truong Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 7.80803 3.90402 Within groups 0.79345 0.264483 14.76 0.0280 Total (Corr.) 8.60148 4.1.1.2 Bảng Trắc nghiệm LSD Multiple Range Tests for Mat te bao by Moi truong Method: 95.0 percent LSD Moi truong Count Mean Homogeneous Groups 4.36 X 4.76 X 2 6.955 X Contrast Difference +/- Limits - *-2.595 1.63667 - -0.4 1.63667 - *2.195 1.63667 * denotes a statistically significant difference 4.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng pH thời gian ngâm gạo 4.1.2.1 Bảng phân tích ANOVA Analysis of Variance for Mat te bao - Type III Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:pH 4.81125 1.60375 9.30 0.0006 B:Thoi gian 15.1233 7.56167 43.84 0.0000 3.105 18 0.1725 RESIDUAL TOTAL (CORRECTED) 23.0396 23 All F-ratios are based on the residual mean square error 4.1.2.2 Bảng Trắc nghiệm LSD Multiple Range Tests for Mat te bao by pH Method: 95.0 percent LSD pH Count LS Mean Homogeneous Groups 5.86667 X 6.33333 X 6.36667 X 7.11667 X Contrast Difference +/- Limits - *0.75 0.503784 - *0.783333 0.503784 - *1.25 0.503784 - 0.0333333 0.503784 - 0.5 0.503784 - 0.466667 0.503784 · denotes a statistically significant difference Multiple Range Tests for Mat te bao by Thoi gian Method: 95.0 percent LSD Thoi gian Count LS Mean Homogeneous Groups - 30 5.7625 X 5.9625 X 24 7.5375 X Contrast Difference +/- Limits 24 - 30 *1.775 0.43629 24 - *1.575 0.43629 30 - -0.2 0.43629 * denotes a statistically significant difference 4.1.3 Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy 4.1.3.1 Tối ưu tỉ lệ cơm bổ sung vào thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn a Bảng phân tích ANOVA ANOVA Table for Mat te bao by Ti le com tam Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 4.336 1.084 Within groups 0.325 0.065 16.68 0.0043 Total (Corr.) 4.661 b Bảng trắc nghiệm LSD Multiple Range Tests for Mat te bao by Ti le com tam Method: 95.0 percent LSD Ti le com tam Count Mean Homogeneous Groups 100 7.5 X 95 8.1 XX 80 8.7 XX 85 9.0 X 90 9.35 X Contrast Difference +/- Limits 100 - 80 *-1.2 0.655374 100 - 85 *-1.5 0.655374 100 - 90 *-1.85 0.655374 100 - 95 -0.6 0.655374 80 - 85 -0.3 0.655374 80 - 90 -0.65 0.655374 80 - 95 0.6 0.655374 85 - 90 -0.35 0.655374 85 - 95 *0.9 0.655374 90 - 95 *1.25 0.655374 * denotes a statistically significant difference Multiple Range Tests for Mat te bao by Ti le com tam Method: 95.0 percent LSD Ti le com tam Count Mean Homogeneous Groups 100 13.56 X 95 14.065 XX 80 14.605 XX 85 14.885 X 90 15.16 X Contrast Difference +/- Limits 100 - 80 *-1.045 0.555092 100 - 85 *-1.325 0.555092 100 - 90 *-1.6 0.555092 100 - 95 -0.505 0.555092 80 - 85 -0.28 0.555092 80 - 90 -0.555 0.555092 80 - 95 0.54 0.555092 85 - 90 -0.275 0.555092 85 - 95 *0.82 0.555092 90 - 95 *1.095 0.555092 * denotes a statistically significant difference 4.1.3.2 Tối ưu tỉ lệ lõi bắp bổ sung vào thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn a Bảng phân tích ANOVA ANOVA Table for Mat ta bao by Ti le loi bap Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 38.885 12.9617 0.63 0.1575 Within groups 82.30 0.0005 Total (Corr.) 39.515 b Bảng trắc nghiệm LSD Multiple Range Tests for Mat ta bao by Ti le loi bap Method: 95.0 percent LSD Ti le loi bap Count Mean Homogeneous Groups 30 4.1 20 5.9 7.15 10 10.15 X X X X Contrast Difference +/- Limits - - 10 *-3.0 1.10187 - 20 *1.25 1.10187 - 30 *3.05 1.10187 10 - 20 *4.25 1.10187 10 - 30 *6.05 1.10187 20 - 30 *1.8 1.10187 * denotes a statistically significant difference 4.2 CÁC BẢNG XỬ LÝ SỐ LIỆU 4.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát môi trường nuôi cấy bán rắn thích hợp Kết khảo sát môi trường lên men bán rắn Môi trường Mật độ tế bào Log (CFU/g) 3,0 108 3,82 4,1 108 4,90 7,2 108 6,86 7,6 108 7,05 4,3 108 5,07 3,6 108 4,45 Trung bình 4,36 6,96 4,76 Kết theo dõi phát triển nấm men theo ngày Thời điểm Môi trường (Ngày) (CFU/g) 2,46 108 3,13 3,23 108 4,07 1,65 108 1,74 2,92 108 3,72 3,49 108 4,34 1,99 108 2,39 4,06 108 4,87 7,62 108 7,06 3,56 108 4,41 3,39 108 4,24 6,37 108 6,43 2,85 108 3,64 Log Môi trường (CFU/g) Log Môi trường (CFU/g) Log 4.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng pH thời gian ngâm gạo Kết khảo sát ảnh hưởng pH thời gian ngâm gạo STT pH nước ngâm Thời gian ngâm Mật độ tế bào nấm men Log (Giờ) (CFU/g) 6,8 108 6,7 2 6,5 108 6,5 24 12,5 108 8,8 24 12,6 108 8,8 30 5,6 108 5,9 30 5,7 108 6,0 5,5 108 5,9 5,4 108 5,8 24 8,9 108 7,6 10 24 8,4 108 7,4 11 30 5,2 108 5,7 12 30 5,4 108 5,8 13 5,3 108 5,7 14 5,5 108 6,0 15 24 8,4 108 7,4 16 24 9,1 108 7,7 17 30 5,1 108 5,7 18 30 4,9 108 5,5 19 5,2 108 5,7 20 4,8 108 5,4 21 24 5,8 108 6,1 22 24 6,5 108 6,5 23 30 5,5 108 5,9 24 30 5,0 108 5,6 Kết ảnh hưởng pH ngâm gạo đến mật độ nấm men phát triển trình nuôi cấy pH nước ngâm Mật độ tế bào nấm men (CFU/g) Log 8,3 108 7,4 6,5 108 6,5 6,3 108 6,4 5,5 108 5,9 Kết ảnh hưởng thời gian ngâm gạo đến mật độ tế bào nấm men phát triển trình nuôi cấy Thời gian ngâm Mật độ tế bào nấm men (Giờ) (CFU/g) 5,8 108 6,1 24 9,0 108 7,6 30 5,3 108 5,8 Log 4.2.3 Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy 4.2.3.1 Tối ưu tỉ lệ cơm bổ sung vào thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn Kết thí nghiệm tối ưu hóa thành phần cơm Tỉ lệ cơm Mật độ tế bào nấm men (%) (CFU/g) 80 11,6 108 8,5 80 12,9 108 8,9 85 13,4 108 9,0 85 13,5 108 9,0 90 15,4 108 9,5 90 14,0 108 9,2 95 11,2 108 8,4 95 9,5 108 7,8 100 8,8 108 7,6 10 100 8,5 108 7,4 STT Log Trung bình 8,7 9,0 9,35 8,1 7,5 4.2.3.2 Tối ưu tỉ lệ lõi bắp bổ sung vào thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn Kết thí nghiệm tối ưu hóa tỉ lệ lõi bắp Tỉ lệ lõi bắp Mật độ tế bào nấm men (%) (CFU/g) 8,4 108 7,4 7,2 108 6,9 10 19,1 108 10,2 10 18,5 108 10,1 20 5,9 108 6,2 20 5,0 108 5,6 30 3,7 108 4,5 30 2,9 108 3,7 STT Log Trung bình 7,15 10,15 5,9 4,1 [...]... · Họ: Sporidiobolaceae · Giống: Rhodotorula Hình 2.1 Nấm men Rhodotorula sp [20], [21] Hình 2.2 Tế bào nấm Nấm tố men Rhodotorula glutinis [19] men Rhodotorula sp còn được gọi là nấm men sinh sắc carotenoid (carotengensis), là một trong rất ít các chi nấm men có khả năng tổng hợp tích luỹ một lượng lớn các sắc tố carotenoid trong đó chủ yếu là β-carotene, torulene, torularhodin Năm 1921, A Harden là... B2), Bên cạnh rất nhiều nấm men có ích còn có những loại nấm men có thể gây bệnh (Candida, Mycoderma) 2.1.2 Hình dạng và kích thước của tế bào nấm men [3], [7] · Hình dạng nấm men [7] Nấm men thường có cấu tạo đơn bào Hình dạng tế bào nấm men thường thay đổi tùy theo loài, ngoài ra một phần còn phụ thuộc vào tuổi giống và điều kiện ngoại cảnh, điều kiện nuôi cấy Nói chung nấm men thường có hình trứng,... Đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp sắc tố carotenoid trên nhiều các nguồn cơ chất khác nhau, với các phương pháp nuôi cấy khác nhau: như nuôi cấy gián đoạn, bán liên tục, lên men dịch thể, lên men bán rắn, … chỉ từ giống Rhodotorula sp hay nuôi cấy kết hợp với một chủng vi sinh vật khác như: nấm men, nấm mốc, vi khuẩn 2.3 BETA CAROTENE (β-Carotene) 2.3.1 Giới thiệu về Carotenoids... thí nghiệm nuôi cấy ở phòng thí nghiệm vi sinh vật hoặc ở quy mô nhỏ có thể dùng các dịch chiết từ giá đậu, từ rau cải, bắp cải, cà chua, cà rốt, khoai tây,…làm nguồn vitamin bổ sung vào môi trường 2 NẤM MEN RHODOTORULA SP 2.2.1 Phân loại [20] Theo phân loại Harison (1927) nấm men Rhodotorula sp thuộc: · Giới: Nấm (fungi) · Ngành: Basidiomycota · Lớp: Urediniomycetes · Bộ: Sporidiales · Họ: Sporidiobolaceae... của nấm men Trong môi trường nuôi cấy nấm men thường có (NH4)2SO4 làm nguồn amon và nguồn lưu huỳnh Trong môi trường với hàm lượng lưu huỳnh nhỏ làm tăng sự nảy chồi của nấm men Nhưng ở nồng độ 1mg/l lưu huỳnh đã kìm hãm quá trình này Do vậy, khi sử dụng các nguồn lưu huỳnh dinh dưỡng cho vi sinh vật nói chung, trong đó có nấm men, cần phải thận trọng · Các ion K+, Ca2+, Mg2+ cũng cần có trong môi trường. .. trong điều kiện kị khí là 66 ÷ 67 mgN, trong điều kiện hiếu khí là 37 ÷ 53 mgN Tuy nhiên hàm lượng nitơ trong nấm men phụ thuộc vào thành phần môi trường, điều kiện hiếu khí và số lượng các chất dinh dưỡng bổ sung vào môi trường đối với từng chủng nấm men Các hợp chất hữu cơ chứa nitơ của tế bào là các acid amin, các nucleotic purin và pyrimidin, protein và một số vitamin Nguồn nitơ vô cơ được nấm men. .. lạc tuỳ môi trường, có thể đạt từ 1 – 10 mm Quan sát dưới kính hiển vi không hình thành sợi nấm, một số có sinh sợi nấm giả nhưng rất kém phát triển, không hình thành bào tử túi.[4] 2.2.2 Hình dạng và kích thước [3], [4], [12] Rhodotorula sp có nhiều hình dạng khác nhau tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy và loài khác nhau Gồm hình trứng, hình dài, hình elip, hình cầu, tròn và hình gậy Rhodotorula sp có... giác,…và một số hình dạng đặc biệt Hình dạng của nấm men hầu như không ổn định, nó phụ thuộc vào tuổi của nấm men và điều kiện nuôi cấy Ngoài ra một số loài nấm men có tế bào hình que nối với nhau thành những sợi gọi là khuẩn ty hoặc khuẩn ty giả, thường gặp ở các giống Endomycopsis, Candida, Trichosporon · Kích thước tế bào nấm men [7] Kích thước tế bào nấm men thay đổi rất nhiều, theo từng giống, từng... vận chuyển năng lượng Nấm men sử dụng rất tốt nguồn phospho vô cơ là orthophosphate Hợp chất này sẽ chuyển thành polyphosphate và sau khi được hoạt hóa sẽ dùng vào các quá trình tổng hợp Khi không đủ phospho trong môi trường sự trao đổi chất ở nấm men bị thay đổi đáng kể liên quan tới sự phá vỡ nhu cầu sử dụng hydratcacbon và nitơ Nhu cầu sinh lý về phospho đối với 10 tỷ tế bào nấm men vào khoảng 10 ÷... của Rhodotorula sp nhanh, thời gian để số tế bào tăng gấp đôi thường từ 2 ÷ 6 giờ Quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men gồm bốn giai đoạn: Giai đoạn thích nghi, giai đoạn phát triển, giai đoạn ổn định và giai đoạn diệt vong Thời gian sinh trưởng tốt nhất của Rhodotorula sp trong khoảng 24 - 48 giờ nếu môi trường cung cấp đủ các chất cần thiết 2.2.4 Đặc điểm sinh hóa [19], [22] Nấm men Rhodotorula