KHẢO sát điều KIỆN NUÔI cấy nấm MEN RHODOTOR ULA SP TRÊN môi TRƯỜNG bán rắn

Nấm men là tên chung để chỉ nhóm nấm thường có cấu tạo đơn bào và thường sinh sản vô tính theo lối nảy chồi. Nấm men không thuộc về một nhóm phân loại nào nhất định, chúng có thể thuộc ngành Nấm túi (Ascomycota) hoặc ngành Nấm đảm (Basidiomycota). Nấm men phân bố hết sức rộng rãi trong tự nhiên: đất, nước, lương thực thực phẩm, rau quả,… Đặc biệt chúng hiện diện nhiều ở các môi trường chứa đường, pH thấp: đất trồng nho và cây ăn quả. Nấm men có khả năng sinh sản nhanh chóng, sinh khối giàu protein, vitamin và lipid. Vì vậy chúng được sử dụng rộng rãi trong công nghệ chế biến rượu trắng, rượu vang, bia, cồn, thức ăn bổ sung cho người và gia súc, làm nở bột mì, gây hương nước chấm, làm dược phẩm, sản xuất enzym, sản xuất acid citric từ khí thiên nhiên, sản xuất riboflavin (vitamin B2), .... Bên cạnh rất nhiều nấm men có ích còn có những loại nấm men có thể gây bệnh (Candida, Mycoderma). 2.1.2 Hình dạng và kích thước của tế bào nấm men 3, 7 · Hình dạng nấm men 7 Nấm men thường có cấu tạo đơn bào. Hình dạng tế bào nấm men thường thay đổi tùy theo loài, ngoài ra một phần còn phụ thuộc vào tuổi giống và điều kiện ngoại cảnh, điều kiện nuôi cấy. Nói chung nấm men thường có hình trứng, bầu dục (Saccharomyces serevisiae), hình cầu (Candida utilis), hình oval hoặc elip, hình ống (Pychia), hình trụ, hình quả chanh, hình tam giác,…và một số hình dạng đặc biệt. Hình dạng của nấm men hầu như không ổn định, nó phụ thuộc vào tuổi của nấm men và điều kiện nuôi cấy. Ngoài ra một số loài nấm men có tế bào hình que nối với nhau thành những sợi gọi là khuẩn ty hoặc khuẩn ty giả, thường gặp ở các giống Endomycopsis, Candida, Trichosporon. · Kích thước tế bào nấm men 7 Kích thước tế bào nấm men thay đổi rất nhiều, theo từng giống, từng loài, hay tuổi sinh lý. Nói chung thường to hơn tế bào vi khuẩn từ 5 ÷ 10 lần. Kích thước trung bình của tế bào nấm men. · Chiều dài: 9 ÷ 10 μm. · Chiều rộng: 2 ÷ 7 μm. Các loài nấm men đơn bào trong công nghiệp thường có kích thước 3 – 5 μm. x 5 10 μm.

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÌNH DƯƠNG

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN CNSH

ĐỀ TÀI:

KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY NẤM MEN

RHODOTOR ULA SP

TRÊN

MÔI

TRƯỜNG BÁN RẮN

GVHD: Th.S NGUYỄN MINH KHANG Th.S TRƯƠNG HUỲNH HUY SVTH: NGUYỄN THANH TRÚC

BÌNH DƯƠNG – 2009

TRƯỜNG ĐẠI HỌCBÌNH DƯƠNGKHOA CÔNG NGHỆSINH HỌC

NGUYỄN THANH

TRÚC

KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY NẤM MEN

ROHODOTO RULA SP

TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC

PHẨM

NGƯỜI HƯỚNG DẪNKHOA HỌC

1 Th.S Nguyễn Minh Khang

2 Th.S Trương Huỳnh Huy

Bình Dương – 2009

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Xã hội ngày càng phát triển kéo theo sự phát triển của các ngành khoa học kỹ thuật Công nghệ sinh học

đã và đang trở thành một trong những ngành được quan tâm hàng đầu trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nóiriêng Công nghệ sinh học phát triển nhanh chóng đang tạo ra một cuộc cách mạng sinh học trong các ngànhnông nghiệp và công nghiệp thực phẩm, làm thay đổi phương thức sản xuất trong các ngành y dược, năng lượngkhai khoáng và bảo vệ môi trường

Đối với Việt Nam, một đất nước nông nghiệp việc ứng dụng xử lý và tái chế các nguồn phế phụ phẩm từđộng vật và thực vật trong các ngành sản xuất nông nghiệp và công nghệ thực phẩm, biến đổi những nguồnnguyên liệu rẻ tiền để tạo ra những sản phẩm có chất lượng cao, giảm nguy cơ ô nhiễm môi trường mang lạihiệu quả kinh tế cho xã hội

Vitamin A có vai trò rất quan trọng trong đời sống con người và vật nuôi Nguồn nguyên liệu thực vật và

vi sinh vật được xem là các nguồn cung cấp dồi dào sắc tố carotenoid nói chung và tiền vitamin A nói riêng Vàmột trong rất ít giống nấm men có khả năng tổng hợp được sắc tố carotenoid trong đó chủ yếu là beta-caroten

đó là Rhodotorula sp.

Beta-caroten một hợp chất có hoạt tính sinh học cao có vai trò quan trọng đối với con người và động vật.Các nhà khoa học đã chứng minh được rằng tỷ lệ beta-caroten trong thức ăn gắn liền với việc giảm nguy cơ củanhiều căn bệnh ung thư, trẻ hóa làn da, giảm tỷ lệ tử vong do bệnh tim mạch,… Với những lợi ích như vậy, ứngdụng quá trình lên men bán rắn từ những phụ phẩm dồi dào và rẻ tiền của các ngành như công nghiệp thực

phẩm, nông nghiệp,… Đây cũng chính là mục tiêu của đề tài “Khảo sát điều kiện nuôi cấy nấm men

Rhodotorula sp trên môi trường bán rắn”.

1.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Lựa chọn ra môi trường bán rắn thích hợp nhất cho việc nuôi cấy nấm men đỏ Rhodotorula sp.

- Tối ưu hóa các thành phần môi trường nuôi cấy

- Thử nghiệm sản xuất và kiểm tra hàm lượng beta-caroten trong chế phẩm từ nấm men đỏ Rhodotorula sp

trên môi trường tối ưu

1.3 MỤC ĐÍCH ĐỀ TÀI

Khảo sát những điều kiện tối ưu cho sự phát triển của nấm men đỏ Rhodotorula sp trên môi trường bán

rắn thông qua việc tận dụng các nguồn nguyên vật liệu phụ phẩm rẻ tiền từ các ngành nông nghiệp, côngnghiệp, công nghiệp thực phẩm,… để thu được lượng sinh khối cao nhất

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ NẤM MEN

2.1.1 Tổng quan về nấm men [2], [6], [7], [12]

Nấm men là tên chung để chỉ nhóm nấm thường có cấu tạo đơn bào và thường sinh sản vô tính theo lốinảy chồi Nấm men không thuộc về một nhóm phân loại nào nhất định, chúng có thể thuộc ngành Nấm túi(Ascomycota) hoặc ngành Nấm đảm (Basidiomycota)

Nấm men phân bố hết sức rộng rãi trong tự nhiên: đất, nước, lương thực thực phẩm, rau quả,… Đặc biệtchúng hiện diện nhiều ở các môi trường chứa đường, pH thấp: đất trồng nho và cây ăn quả

Nấm men có khả năng sinh sản nhanh chóng, sinh khối giàu protein, vitamin và lipid Vì vậy chúng được

sử dụng rộng rãi trong công nghệ chế biến rượu trắng, rượu vang, bia, cồn, thức ăn bổ sung cho người và giasúc, làm nở bột mì, gây hương nước chấm, làm dược phẩm, sản xuất enzym, sản xuất acid citric từ khí thiênnhiên, sản xuất riboflavin (vitamin B2), Bên cạnh rất nhiều nấm men có ích còn có những loại nấm men có

thể gây bệnh (Candida, Mycoderma).

2.1.2 Hình dạng và kích thước của tế bào nấm men [3], [7]

như không ổn định, nó phụ thuộc vào tuổi của nấm men và điều kiện nuôi cấy

Ngoài ra một số loài nấm men có tế bào hình que nối với nhau thành những sợi gọi là khuẩn ty hoặc khuẩn

ty giả, thường gặp ở các giống Endomycopsis, Candida, Trichosporon.

· Kích thước tế bào nấm men [7]

Kích thước tế bào nấm men thay đổi rất nhiều, theo từng giống, từng loài, hay tuổi sinh lý Nói chungthường to hơn tế bào vi khuẩn từ 5 ÷ 10 lần Kích thước trung bình của tế bào nấm men

· Chiều dài: 9 ÷ 10 μm

· Chiều rộng: 2 ÷ 7 μm

Các loài nấm men đơn bào trong công nghiệp thường có kích thước 3 – 5 μm x 5- 10 μm.

2.1.3 Dinh dưỡng nấm men

· Thành phần hóa học của tế bào nấm men [12]

Thành phần cơ bản và chủ yếu là nước (nước liên kết và nước tự do) - khoảng 75% khối lượng chung.Thành phần sinh khối khô của nấm men như sau (%):

Chất khô của tế bào nấm men gồm có 23 – 28 % là chất hữu cơ và 5 – 7 % chất tro

Chất hữu cơ gồm có (%): Protein 13 -14 %, glucogen 6 – 8 %, xenluloza 1,8 -2 %, chất béo 0,5 – 2 %

· Dinh dưỡng nấm men [12]

Dinh dưỡng nấm men thường chia làm hai nguồn dinh dưỡng Đó là dinh dưỡng ngoại bào và dinh dưỡngnội bào Chất dinh dưỡng ngoại bào được thấm qua màng vào tế bào từ các chất của môi trường nuôi cấy bênngoài Khi tế bào ở trạng thái đối với môi trường bên ngoài nghèo hoặc cạn các chất dinh dưỡng thì những chất

dự trữ nội bào như glycogen, tregeloza, lipit, các hợp chất chứa N sẽ được sử dụng – dinh dưỡng nội bào

Các chất dinh dưỡng khi được sử dụng sẽ hoặc là đi vào thành phần tế bào phục vụ cho sinh trưởng hoặc

là cung cấp năng lượng cần thiết cho đời sống tế bào

· Dinh dưỡng cacbon [12], [4]

Nguồn dinh dưỡng carbon của nấm men bao gồm các loại hợp chất hữu cơ khác nhau như đường, rượu,acid hữu cơ, acid amin,… Hầu hết các loài nấm men đều không có enzyme polyhydrolase trong đó có amylase

và cellulase Vì vậy, nấm men không sử dụng trực tiếp được tinh bột cũng như cellulose và hemicellulose.Đường là một trong những nguồn carbon quan trọng cho nấm men sử dụng đặc biệt là đường glucosethuộc loại đường 6 (hexose) là thông dụng nhất cho tất cả các loài nấm men Glucose được coi như nguồncarbon vạn năng đối với vi sinh vật

Tỷ số đường sử dụng là đặc điểm riêng của từng loài nấm men Đối với các nguồn carbon khác như rượu

và acid hữu cơ thì đặc điểm này là giống nhau ở tất cả các loài nấm men Các loài Saccharomyces lên men rượu

vang sử dụng glucose, fructose, maltose, saccharose và galactose, với rafinose chỉ sử dụng được một phần Vớilactose, melibiose, dextrin, pentose và tinh bột lại hoàn toàn không sử dụng được

Trong môi trường có một hỗn hợp các nguồn carbon dinh dưỡng thì nguồn nào cung cấp cho nấm mensinh trưởng tốt sẽ được ưu tiên sử dụng trước, tính sử dụng kế tiếp các nguồn carbon trong canh trường đượcgọi là tính đa dưỡng của nấm men Trong quá trình nuôi cấy glucose và fructose sẽ được sử dụng trước hết.

Những loài nấm men cùng một giống không phải bao giờ cùng đồng hóa vật chất như nhau Các loài khácnhau (dù là một giống) sẽ đồng hóa các nguồn dinh dưỡng khác nhau

Những disaccharide (maltose và saccharose) trước khi được nấm men sử dụng phải qua thủy phân sơ bộthành đường đơn nhờ enzyme tương ứng của nấm men Các acid hữu cơ cũng chiếm một vị trí quan trọng trongtrao đổi chất của nấm men Chúng có thể kích thích hoặc ức chế sinh trưởng của nấm men Chúng cũng có thể

là nguồn dinh dưỡng carbon và năng lượng duy nhất

Các acid béo có mạch carbon tương đối dài (từ 6 ÷ 10) nấm men chỉ sử dụng ở nồng độ trong môi trườngrất thấp (0,02 ÷ 0,05 %) Ở nồng độ cao sẽ ức chế nấm men phát triển Acid béo có từ C12 ÷ C17 carbon trongphân tử được sử dụng tùy thuộc vào từng chủng loại nấm men

· Dinh dưỡng nitơ [12], [4]

Nguồn nitơ cần thiết cho tế bào nấm men thường là các hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ có sẵn trong môitrường

Thông thường, nitơ của tế bào nấm men thường vào khoảng 7 ÷ 10 %, đôi khi lên tới 12% vật chất khô

Để tạo thành 10 tỷ tế bào nấm men chi phí nitơ trong điều kiện kị khí là 66 ÷ 67 mgN, trong điều kiện hiếu khí

là 37 ÷ 53 mgN Tuy nhiên hàm lượng nitơ trong nấm men phụ thuộc vào thành phần môi trường, điều kiện hiếukhí và số lượng các chất dinh dưỡng bổ sung vào môi trường đối với từng chủng nấm men

Các hợp chất hữu cơ chứa nitơ của tế bào là các acid amin, các nucleotic purin và pyrimidin, protein vàmột số vitamin

Nguồn nitơ vô cơ được nấm men sử dụng tốt là các muối amoni của acid vô cơ cũng như hữu cơ Đó làcác muối amoni sunfat, amoni phosphat rồi đến các muối amoni acetat, amoni lactat, amoni maltat và amonisucxinat Trong môi trường có muối amoni đặc biệt là sunfat thì nấm men sẽ sử dụng gốc amoni trước, gốc acidcòn lại sẽ sử dụng sau hoặc ít sử dụng do vậy có thể làm môi trường acid hóa, giảm pH

Các nguồn nitơ hữu cơ thường là hỗn hợp các acid amin, các peptid, các nucleic, Trong thực tế người tahay dùng cao ngô, cao nấm men, dịch thủy phân protein tự nhiên (đậu tương, khô lạc, ) làm nguồn nitơ hữu cơ.Xếp theo thứ tự nấm men tiêu hóa tốt nhất là các muối amon, tiếp theo là các acid amin, sử dụng peptonkém và hoàn toàn không sử dụng được protein Trong quá trình nuôi cấy nấm men các acid amin vừa là nguồn

nitơ vừa là nguồn carbon dinh dưỡng Chúng đồng thời tham gia vào phản ứng cetoacid để tạo thành các acidamin mới như là chất cho nhóm amin (NH2-).

· Dinh dưỡng các nguyên tố vô cơ [12], [4]

Các nguyên tố vô cơ trong nuôi cấy vi sinh vật nói chung, trong đó có nấm men thì phospho được quantâm trước hết, sau đó là kali, magiê và lưu huỳnh,…

Phospho: tham gia vào các thành phần quan trọng của tế bào, như các nucleoproteic, acid nucleic,

polyphosphate, phospholipid,… Các hợp chất phospho đóng vai trò xác định trong các biến đổi hóa sinh khácnhau, đặc biệt là trong trao đổi chất hydrocacbon và trong vận chuyển năng lượng Nấm men sử dụng rất tốtnguồn phospho vô cơ là orthophosphate Hợp chất này sẽ chuyển thành polyphosphate và sau khi được hoạt hóa

sẽ dùng vào các quá trình tổng hợp

Khi không đủ phospho trong môi trường sự trao đổi chất ở nấm men bị thay đổi đáng kể liên quan tới sựphá vỡ nhu cầu sử dụng hydratcacbon và nitơ Nhu cầu sinh lý về phospho đối với 10 tỷ tế bào nấm men vàokhoảng 10 ÷ 13 mgP

Người ta thường dùng KH2PO4, K2HPO4 hoặc dung dịch chiết từ supephosphat làm nguồn P và K.Trong dịch đường hóa từ tinh bột thường đủ P đáp ứng nhu cầu của nấm men, rỉ đường củ cải cũng như rỉđường mía thường thiếu P, vì vậy cần phải bổ sung vào môi trường acid orthophosphoric hoặc supephosphat

Lưu huỳnh là thành phần của một số acid amin trong phân tử protein và là nhóm phụ (-SH) của một số

enzyme CoA Bởi vậy, khi không có mặt lưu huỳnh trong môi trường sự trao đổi chất có thể không tổng hợpđược protein Những chất chứa lưu huỳnh như acid amin (cystine, cysteine, metionine), vitamin (tiamin, biotin)

và một số hợp chất khác đóng vai trò quan trọng trong hoạt động sống của nấm men Trong môi trường nuôi cấynấm men thường có (NH4)2SO4 làm nguồn amon và nguồn lưu huỳnh Trong môi trường với hàm lượng lưuhuỳnh nhỏ làm tăng sự nảy chồi của nấm men Nhưng ở nồng độ 1mg/l lưu huỳnh đã kìm hãm quá trình này Dovậy, khi sử dụng các nguồn lưu huỳnh dinh dưỡng cho vi sinh vật nói chung, trong đó có nấm men, cần phảithận trọng

· Các ion K+, Ca2+, Mg2+ cũng cần có trong môi trường nuôi cấy hoặc lên men Thông thường ion K+được bổ sung cùng với các muối phosphat hoặc sunfat, ion Ca2+, Mg2+ thường có mặt trong nước sinh hoạt,tuy nhiên khi hàm lượng ion Ca2+, Mg2+ quá cao (nước cứng), cần phải loại bớt hai ion này (làm mềm nước).Giúp cho quá trình nuôi cấy vi sinh vật hiệu quả hơn

· Dinh dưỡng các chất sinh trưởng [12], [4]

Những chất kích thích sinh trưởng là các vitamin, các base purin và pyrimidin Những nhân tố sinh trưởng

cơ bản đối với nấm men không có sắc tố là 6 vitamin nhóm B: inozit (B8), biotin (B7 hay H), acid pantotenic(B3), tiamin (B1), pyridoxine (B6), acid nicotinic (B5 hay PP) Đối với nấm men có sắc tố đỏ cần các chất sinhtrưởng là tiamin, ngoài ra còn có acid paraaminobenzic

Trong công nghiệp thường dùng các nguồn vitamin là cao ngô, cao nấm men (có thể dùng dịch men tựphân hay nước chiết nấm men), nước chiết cám (cám gạo hoặc cám mì), dịch thủy phân đậu tương bằng enzyme

và đặc biệt là rỉ đường (cung cấp bionin) Trong các thí nghiệm nuôi cấy ở phòng thí nghiệm vi sinh vật hoặc ởquy mô nhỏ có thể dùng các dịch chiết từ giá đậu, từ rau cải, bắp cải, cà chua, cà rốt, khoai tây,…làm nguồnvitamin bổ sung vào môi trường

Hình 2.1 Nấm men Rhodotorula sp [20], [21]

Hình 2.2 Tế bào nấm men Rhodotorula glutinis [19]

Nấm men Rhodotorula sp còn được gọi là nấm men sinh sắc

tố carotenoid (carotengensis), là một trong rất ít các chi nấm men

có khả năng tổng hợp tích luỹ một lượng lớn các sắc tố carotenoid trong đó chủ yếu là β-carotene, torulene,torularhodin

Năm 1921, A Harden là người đầu tiên phân lập được loài Rhodotorula mucilaginose, tiếp sau đó năm

1928 Harison và nhiều nhà khoa học khác đã phân lập được 34 loài, trong đó phổ biến nhất là 3 loài

Rhodotorula glutinus, Rh Mucilaginosa và Rhodotorula gracilis Năm 2000, Krutzman và Fell cho rằng giống

nấm men Rhodotorula sp gồm 45 loài, theo mô tả của tác giả cho rằng loài Rh mucilaginosa trước đó có tên gọi

là Rh rubra, loài này tạo ra enzyme urease, không đồng hoá nitrate, không phát triển trên cycloheximide hoặc nhiệt độ 40oC và loài Rh rubra thực ra chỉ là một dạng riêng của loài Rh glutinis, tên gọi Rh ruba ở một số tài liệu hiện nay không còn nữa và được thay thế bằng tên mới là Rh mucilaginosa [10] [11]

Riêng tác giả người Nhật Hasegawa lại dựa vào quang phổ hấp thụ sắc tố carotenoide để chia giống nấm

men Rhodotorula sp thành hai giống phụ là: Rhodotorula (hấp thụ tối đa ở bước sóng 610nm) và Flavotorrula

(hấp thụ tối đa ở bước sóng 450nm)

Theo Lodder (1971), Koneman E.W và Robert (1983), thì Rhodotorula sp thuộc cơ thể đơn bào, nhóm

nấm men không sinh bào tử, không có sợi khuẩn ty hay sợi khuẩn ty giả và là nhóm vi sinh vật ưa ấm, khoảngnhiệt độ hoạt động từ 20 - 400C.Chúng phân bố rộng rãi ở khắp nơi: trong đất, không khí, trên các vỏ lá cây:táo, dưa hấu, dâu tây, dâm bụt,…

Khi quan sát dưới kính hiển vi tế bào nấm men Rhodotorula sp có dạng hình tròn, oval, elip đến dạng thon

dài hoặc gậy Kích thước tế bào dao động trong khoảng 2 ÷ 5 μm chiều rộng, 2,5 – 10 μm chiều dài tùy thuộcvào điều kiện nuôi cấy và độ tuổi

Khuẩn lạc phát triển nhanh, bề mặt trơn nhẵn, bóng sáng hoặc mờ đục, đôi khi ghồ ghề, mịn và nhớt Mépkhuẩn lạc không có răng cưa Khuẩn lạc có màu từ kem, hồng đến đỏ san hô cũng có khi có màu vàng và đỏcam Kích thước khuẩn lạc tuỳ môi trường, có thể đạt từ 1 – 10 mm Quan sát dưới kính hiển vi không hìnhthành sợi nấm, một số có sinh sợi nấm giả nhưng rất kém phát triển, không hình thành bào tử túi.[4]

2.2.2 Hình dạng và kích thước [3], [4], [12]

Rhodotorula sp có nhiều hình dạng khác nhau tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy và loài khác nhau Gồm

hình trứng, hình dài, hình elip, hình cầu, tròn và hình gậy Rhodotorula sp có khuẩn lạc trơn, không nhăn, có

màu từ kem đến vàng hoặc đỏ

Sinh trưởng sinh dưỡng: khuẩn lạc màu cam đến màu đỏ, vàng, dạng bơ hoặc nhầy

Tế bào hình cầu, gần cầu, elip, trứng hoặc trứng kéo dài, thường nảy chồi ở đỉnh Có thể xuất hiện sợi giả

và sợi thật

Bảng 2.1 Hình thái tế bào của một số loài Rhodotorula sp nuôi cấy trên môi trường thạch malt từ các

nguồn phân lập khác nhau [4]

STT Loài Màu khuẩn lạc Hình dạng Nguồn phân lập

1 Rh Acheniorum Hồng Dài Quả dâu, lá lê

2 Rh Araucariae Hồng Tròn cầu Gỗ cây bách tán

3 Rh Aurantiaca Hồng hoặc đỏ Dài Không khí, bia,

đất

4 Rh Bogoriensis Kem hoặc hồng Gậy

5 Rh Diffluens Kem Tròn cầu,

elip

6 Rh Fujisanense Kem hoặc hồng Gậy Cây nho dại

7 Rh Glutinis Hồng hoặc đỏ Tròn cầu

8 Rh Graminis Hồng Tròn cầu

9 Rh Ingeniosa Kem Tròn cầu

10 Rh Javanica Kem Dài

11 Rh Lactosa Vàng, hồng hoặc

đỏ

Tròn cầu Không khí

12 Rh Marina Hồng hoặc đỏ Tròn cầu Con tôm

13 Rh Minuta Hồng hoặc đỏ Tròn cầu Không khí, biển

16 Rh Pallida Kem hoặc hồng Tròn cầu Nước biển, dưa

leo ngâm

17 Rh Pilatii Kem Tròn cầu Cây tùng bách

18 Rh Pilimanae Hồng hoặc đỏ Tròn cầu Nước, đất

2.2.3 Cấu tạo và sinh sản của nấm men Rhodotorula sp [11]

2.2.3.1 Cấu tạo

Các nghiên cứu cho thấy, nấm men Rhodotorula sp có hình thái và cấu tạo tế bào giống như các loài nấm

men khác, được cấu tạo từ các thành phần

a Thành tế bào

Được cấu tạo từ các thành phần khác nhau, trong đó đáng kể nhất là: glucan, manan, protein, lipit và một

số thành phần nhỏ như kitin

· Glucan: là hợp chất cao phân tử của D-glucoza Đó là một polysacharit phân nhánh có liên kết β-1,3 và

β-1,6 Cả hai thành phần này phân bố đều trên thành tế bào

· Manan: là hợp chất cao phân tử của D-manoza, mỗi phân tử thường chứa 200 - 400 thành phần manoza.

Thường manan liên kết với protit theo tỷ lệ 2:1 Manan thường có mối liên kết α-1,6; α-1,3; β-1,3 Phân

tử lượng của chúng khoảng 5.104

· Protein: thường protein liên kết với các thành phần khác như là manan Trong thành phần của chúng

chứa nhiều axit amin Phân bố ở màng tế bào, gần sát bào tương

· Kitin: nằm ở phần nẩy chồi Chúng chiếm số lượng rất nhỏ khoảng 3% Đầu là chất bền vững không bị

enzym phá hủy, vì thế chúng có tác dụng bảo vệ chồi còn non

· Ngoài ra còn thấy trong thành tế bào có lipit ở dạng phospholipit, khoảng 1% - 10 %

b Màng nguyên chất

Màng nguyên sinh gồm các hợp chất phức tạp như protein, phospholipit, enzym permerase

Trong thời kì còn non màng nguyên sinh chất bám sát lấy thành tế bào làm cho khả năng trao đổi chất củanấm men gặp khó khăn Ngược lại ở thời kì tế bào già màng nguyên sinh chất co lại, tạo thành khoảng trốnggiữa tế bào và chất nguyên sinh vì thế mà khả năng trao đổi chất của nấm men gặp khó khăn Hai hiện tượngnày được gọi là co nguyên sinh và trương nguyên sinh chất

c Nguyên sinh chất

Tế bào còn non thì nguyên sinh chất càng đồng nhất, càng về già càng mất tính đồng nhất do xuất hiệnnhiều không bào và hạt voluten Thành phần bao gồm: nước, protit, lipit, gluxit, muối khoáng và enzym Tế bàochất luôn luôn chuyển động, thường chuyển động một chiều xung quanh thành tế bào

d Nhân

Ở Rhodotorula sp đã có nhân thật, nhân hình bầu dục hay hình cầu Nó được bao bọc bởi lớp màng bên

trong là lớp dịch nhân Nhân thường có hình bầu dục và hình cầu Giống như các vi sinh vật khác, nhân nấmmen có chứa protein và acid nucleic Ở trạng thái lên men nhân tăng 20 - 30 lần so với ở trạng thái hô hấp

e Các thành phần khác

- Không bào: là nơi chứa đựng protease.

- Hạt không bào: thường nằm trong không bào, là chất dinh dưỡng của tế bào, nguồn năng lượng cho tế

bào, tham gia điều hoà các quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào

- Ty thể: cung cấp năng lượng hoạt động cho tế bào.

- Riboxom: tham gia vào nhiều quá trình sinh tổng hợp của nấm men.

- Volutin: không phải là thành phần cấu trúc tế bào, chúng xuất hiện ở những điều kiện đặc biệt như khi

nuôi cấy trên môi trường giàu hydratcacbon và phoshat vô cơ Số lượng volutin còn phụ thuộc vào tỷ lệ C : N và

sự có mặt của S cũng như của vitamin Volutin đóng vai trò quan trọng sau:

+ Là chất dự trữ dinh dưỡng cho tế bào

+ Tham gia điều hòa quá trình sinh trưởng, phát triển của tế bào

+ Làm nguồn năng lượng cho tế bào

2.2.3.2 Sinh sản [3], [4], [11]

Đa số loài của nấm men Rhodotorula sp sinh sản bằng cách nẩy chồi như: Rh pilimanae, Rh pilatii, Rh.

javaniti, Rh ingniosa, Rh diffluens và Rh bogoriensis Ngoài ra, Rhodotorula sp còn sinh sản theo kiểu phân

đôi nhưng giống Rhodotorula sp không có kiểu sinh sản theo hữu tính.

a Sinh sản bằng hình thức nẩy chồi

Đầu tiên hạch nấm men bắt đầu dài ra và sau đó hạch bắt đầu thắt lại ở chính giữa Tế bào mẹ bắt đầu pháttriển một chồi con Hạch một phần chuyển vào chồi và một phần ở tế bào mẹ, nguyên sinh chất cũng chuyểnsang chồi con Khi chồi con gần bằng chồi mẹ nó sẽ được tách ra và sống độc lập Đây là phương pháp sinh sản

vô tính chủ yếu nhất ở nấm men

b Sinh sản bằng hình thức phân đôi

Lúc đầu tế bào dài ra, sau đó từ từ thắt lại ở chính giữa, nơi thắt này nhỏ dần, nhỏ dần tới khi đứt hẳn vàtạo thành hai tế bào con độc lập Hai tế bào con này giống hệt nhau và đều mang một nửa vật chất di truyền của

tế bào mẹ

Tốc độ sinh sản của Rhodotorula sp nhanh, thời gian để số tế bào tăng gấp đôi thường từ 2 ÷ 6 giờ.

Quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men gồm bốn giai đoạn: Giai đoạn thích nghi, giai đoạn pháttriển, giai đoạn ổn định và giai đoạn diệt vong

Thời gian sinh trưởng tốt nhất của Rhodotorula sp trong khoảng 24 - 48 giờ nếu môi trường cung cấp đủ

các chất cần thiết

2.2.4 Đặc điểm sinh hóa [19], [22]

Nấm men Rhodotorula sp có một số đặc tính sinh hoá sau:

· Không lên men các loại đường như: D-glucose, D-galactose, maltose, me- α -D glucoide, saccharose vànhiều loại đường khác nhưng chúng lại sử dụng các loại đường này để cung cấp nguồn carbon cho việc xâydựng tế bào

· Tạo ra ezyme urease

· Đồng hoá DBB (Diazonium Blue B)

· Có chứa sắc tố carotenoid

· Không tạo thành hợp chất loại tinh bột

· Không tạo ra acid acetic

· Không đồng hoá được inositol, đây là nét đặc trưng cơ bản nhất của Rhodotorula sp khác với các giống nấm men Cryptococus, Candida.

· Khả năng sinh tổng hợp sắc tố carotenoid

· Coenzym : Q9 hoặc Q10

· Xylose :

-Hình 2.3 Các sắc tố carotenoid chủ yếu của nấm men Rhodotorula sp [19]

Đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp sắc tố carotenoid trên nhiều các nguồn cơchất khác nhau, với các phương pháp nuôi cấy khác nhau: như nuôi cấy gián đoạn, bán liên tục, lên men dịch

thể, lên men bán rắn,… chỉ từ giống Rhodotorula sp hay nuôi cấy kết hợp với một chủng vi sinh vật khác như:

nấm men, nấm mốc, vi khuẩn

2.3 BETA CAROTENE (β-Carotene)

2.3.1 Giới thiệu về Carotenoids

Đến tận năm 1907 nhờ kinh nghiệm mà Willstatter và Mieg đã thiết lập được công thức của beta-carotenC10H56 và cấu trúc này đã được giải thích bởi Karrer trong năm 1930 -1931 Và trong năm 1919, Steenbock

đã đưa ra giả thiết là có thể có mối quan hệ giữa beta-caroten và vitamin A

Năm 1837 Berzelius đã gọi sắc tố có màu vàng trong là cây là xanthophylls Và thập niên 1950,carotenoids đã được sinh tổng hợp để sử dụng như là một chất màu thực phẩm

Trong năm 1954 Roche đã bắt đầu sản xuất thương mại carotenoids Có rất nhiều nghiên cứu đã được thựchiện trong những năm 1970 – 1980 để xác định sự phù hợp của beta-caroten để sử dụng trong thực phẩm vàhoạt động của nó trong cơ thể người Và trong những năm đầu thập niên 80 beta-caroten được đề nghị có thểhữu ích trong việc phòng chống ung thư và nó là một chất chống oxy hoá

Ngày nay số lượng các carotenoids tìm thấy trong tự nhiên lên đấn 700 hợp chất với các màu sắc khácnhau Các carotenoids chủ yếu được tách từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên như thực vật và vi sinh vật

c Danh pháp và cấu tạo [4]

Có hai cách gọi tên carotenoids:

+ Tên truyền thống: tên theo nguồn gốc mà loại carotenoid đó được trích chiết đầu tiên

+ Tên hệ thống: tên theo công thức hóa học Carotenoid được gọi tên theo dẫn xuất carotene với hai nhómcuối được ký hiệu bằng các ký tự Hy Lạp (theo trình tự alphabe)

Các tiếp đầu ngữ, tiếp vị ngữ được sử dụng để chỉ mức độ hydro hóa và sự hiện diện của các nhóm chứcthay thế

Hình 2.4 Công thức cấu tạo của các carotenoids quan trọng [4]

Tất cả các carotenoid có thể được xem như là dẫn xuất của acrylic C40H56 có trung tâm là chuỗi gồmnhiều nối đôi liên hợp, do kết hợp với hydro (hydrogenation), khử hydro (dehydrogenation), hình thành vòng(cyclization), thực hiện quá trình oxy hóa (oxidation) tạo nên

Carotenoid được tổng hợp đầu tiên là các tiền chất C5-terpenoid; isopentyl diphosphat (IPP), hợp chất nàysau đó chuyển thành geranyl diphosphat (C20) Hai phân tử này kết hợp với nhau tạo thành phytoene sau đó tiếptục khử hydro tạo thành phytofluene, zeta-carotene và neurosporence để cho ra lycopene Tiếp theo đó là sự tạovòng, sự khử hydro và sự oxi hóa, để tạo ra các carotenoid riêng biệt thường gặp trong tự nhiên, tuy nhiên cómột số ít các hợp chất được biết có sự chuyển hóa cấu trúc cuối cùng dẫn đến hình thành hàng trăm cáccarotenoid khác nhau

d Phân loại

Carotenoids được chia làm 2 nhóm sắc tố chính:

+ Carotenes: gồm các hợp chất hydrocacbon carotenoid

+ Xanthophylls: gồm các dẫn xuất carotene với nhóm chức có chứa oxy (hydroxy, keto, epoxy, methoxy,các nhóm acid carboxylic)

Hình 2.5 Phân loại carotenoids [4]

Theo Bong và cộng sự (2004) các carotenoid chính có giống men nghiên cứu Rhodotorula sp hiện điện đủ hai nhóm, trong đó torulene (I), beta-carotene (III) thuộc nhóm carotenes; torularhodin (II) thuộc xanthophylls.

e Tính chất [4], [18], [19]

Carotenoid thường kết tinh ở dạng tinh thể Tinh thể carotenoid có nhiều dạng khác nhau và kích thướccủa chúng cũng rất khác nhau như dạng hình kim dài (lycopen, δ-carotene), hình khối lăng trụ đa diện(α-carotene), dạng hình thoi (β-carotene), kết tinh vô định hình (γ-carotene)

Nhiệt độ nóng chảy cao, khoảng 130 – 2200C

Độ hòa tan thay đổi tùy loại dung môi Tinh thể carotenoid không tan trong nước, tan tốt trong các dungmôi như chloroform, dichloromethane Hầu như tất cả carotenoid đều tan trong chất béo và các dung môi khôngphân cực

Các carotenoid tự do tạo màu kem, vàng, cam, hồng, đỏ tùy theo loại hợp chất, nguồn nguyên liệu, điềukiện nuôi trồng, thời tiết,… dạng caroteneoprotein tạo dãy màu từ xanh lá, tím, xanh dương và đen Khi đun sôi

sẽ chuyển sang màu đỏ cam do protein bị biến tính, phức hợp với carotenoid bị phá huỷ, màu carotenoid trở lạibình thường.

Do hệ thống nối đôi liên hợp nên carotenoid dễ bị oxy hóa mất màu, hoặc đồng phân hoá, hydro hóa tạomàu khác Các tác nhân ảnh hưởng đến độ bền màu là nhiệt độ, phản ứng oxy hóa trực tiếp hoặc gián tiếp, ionkim loại, ánh sáng, tác dụng của enzyme (peroxidase, lipxidase, lipperoxidase)…

2.3.1.2 Cơ chế sinh tổng hợp Carotenoids trong sinh vật [4],[17],[20]

Toàn bộ quá trình sinh tổng hợp sắc tố carotenoid của nấm men có thể chia thành 3 giai đoạn:

· Giai đoạn cảm ứng ánh sáng (tối thiểu 12 giờ)

· Giai đoạn tổng hợp các enzyme - giai đoạn này xảy ra trong tối

· Giai đoạn tổng hợp carotenoid phụ thuộc vào ánh sáng

Giai đoạn đầu tiên hình thành các tiền terpenoids gồm 5 carbon ban đầu Giai đoạn hai là hình thành các hợpchất C40 Giai đoạn cuối cùng là thay đổi chuỗi C40 trong hệ thống các carotenoid Có nhiều hệ enzyme khácnhau được sử dụng vào giai đoạn cuối của quá trình tổng hợp các sterol và carotenoid, chúng có chung con

đường là thông qua farnesyl pyrophosphate Giống Rhodotorula sp thông qua tổng hợp acid mevalonic tương tự

với con đường tổng hợp carotene của các vi sinh vật sinh sắc tố carotenoid khác (Scharf và Simpson, 1968)

Hình 2.6 Con đường tổng hợp carotenoid ở vi sinh vật do Simpson đề nghị [4]

Lycopene Lycopene Cyclase β-caroten

β-caroten hydroxylase

(crtZ)

Zeaxanthin

Phytoen Phytoene Dessaturas

BACTERIA, FUNGI

DMAP

GGPP Synthase

(crtE, al-3)

GGPP Phytoene Synthase

PLANTS,ALGAE,

DMAP QPP FPP

ζ -caroten Desaturase

lycopene

Lycopene Cyclase β-caroten

β-caroten hydroxylase

(crtR)

Zeaxanthin

Phytoen (phytoffuene Phytoene

(Nerosporene)

γ-caroten

Hình 2.7 Con đường tổng hợp carotenoid ở thực vật và vi sinh vật.

[16]

Theo Hornero-Mendez

D và Britton G (2002 )

có ít nhất 700 loạicarotenoid đã được mô tảtheo 2 con đường sinhtổng hợp đã được biết.Phần lớn là c á c carotenoid do các loài thực vật và

vi sinh tổng hợp theo con đường C40 Như vậy có nhiều chứng cứ chắcchắn rằng sự hình thành carotenoid trong nấm mentheo kiểu chuỗi từ nhiều tiền chất bão hòa Tuynhiên kết quả về sự hình thành vòng chưa rõ Nhưng nhìn

c h u n g , quá trình sinh tổng hợp carotenoids trong sinh vật

· Sinh tổng hợp tiền chất isoprenoid (IPP)

· Sinh tổng hợp carotenoids từ tiền chất IPP

2.3.2 Giới thiệu về β-Carotene

2.3.2.1 Giới thiệu về β-Carotene [19]

Định nghĩa

Beta-carotene là một phân tử cân đối được cấu tạo do 1 chuỗi prolene và 2 vòng β -ionone ở 2 đầu, khithuỷ phân cho 2 phân tử vitamin A Chuỗi liên kết dài sẽ tạo ra màu cam cho beta-carotene

Hình 2.8 Cấu trúc phân tử Betacaroten [18]

Hình 2.9 Cấu trúc phân tử Betacaroten trong không gian 3D [21]

2.3.2.2 Tính chất [4], [18]

Beta-carotene là đồng phân quan trọng của hydrocacbon carotene Tên gọi khác: Natural Extracts(carotenes), Natural β-carotene, carotenesnatural; CI Food Orange 5, mixed carotenes, INS No 160a(ii); CI(1975) No 75130; CI (1975) No 40800 (β-Carotene), : b,b-Carotene,

Phân nhóm: thuộc nhóm Carotenoid

Công thức phân tử: C40H56 (β-Carotene)

Khối lượng phân tử: M = 536,88 (β-Carotene)

Nhiệt độ nóng chảy: 1830C

Độ hoà tan: beta-carotene có độ hòa tan rất khác nhau như sau:

+ Tan tốt trong chloroform, benzen, CS2.

+ Tan trung bình trong ether, petroleum ether, dầu thực vật.

+ Tan hạn chế trong methanol, ethanol.

+ Không tan trong nước, acid, hợp chất alkane.

Tinh thể beta-carotene có dạng hình lăng trụ 6 mặt màu tím đậm nếu kết tinh từ dung môibenzen-methanol, nếu kết tinh từ dung môi petroleum ether có dạng lá hình thoi gần như vuông, màu đỏ Dung

dịch beta-carotene loãng có màu vàng Beta-carotene có độ hấp thu cực đại trong chloroform tại bước sóng497nm và 466nm Vì có 2 vòng β- ionone ở 2 đầu nên β - carotene có hoạt tính provitamin A mạnh nhất.

Beta-caroten là một chất chống oxi hoá vì vậy mà nó có thể được dùng để chống lại một số bệnh ung thư

và căn bệnh khác Beta-caroten là một chất tự nhiên hiện diện trong những trái cây và rau quả màu vàng xanh.Trong cơ thể, beta-caroten nằm trong vitamin A và nó được sử dụng như là một chất bổ sung của vitamin A đểngăn chăn hoặc điều trị những chứng thiếu hụt vitamin A

Beta-carotene tự nhiên gồm hai dạng đồng phân Một đồng phân quan trọng là 9 – cis beta – carotene,đồng phân còn lại là all – trans beta – carotene Các đồng phân này đều có công thức phân tử giống nhau nhưngcách sắp xếp của chúng trong không gian ba chiều lại khác nhau Các đồng phân như vậy thường có những đặctính sinh hóa học rất khác biệt Hợp chất 9 – cis beta – carotene là thành phần chống oxi hóa chủ yếu củabeta-carotene Trong khi đó, loại beta-carotene tổng hợp chỉ chứa loại đồng phân all – trans beta – carotene cókhả năng chống oxi hóa rất thấp

2.3.2.3 Sinh tổng hợp β-Carotene [18]

Hiện nay, có hai chu trình sinh tổng hợp β-Carotene được biết đến nhiều nhất, cả hai chu trình này đều là

sự kết hợp đối xứng của các mạch cacbon

· Chu trình sinh tổng hợp β-Carotene do Badische Anilin- & Soda-Fabrik đề xuất

Ở chu trình này sự sinh tổng hợp β-Carotene được Badische Anilin- & Soda- Fabrik giải thích dựa trên sựkết hợp của hai phân tử hữu cơ đều có mạch cacbon bằng 20: C20 + C20

Quá trình sinh tổng hợp β-Carotene được Badische Anilin- & Soda-Fabrik đề xuất

BASF Synthesis

Hình 2.10 Sinh tổng hợp β-Carotene do Badische Anilin- & Soda-Fabrik đề xuất [18]

Trong phản ứng kết hợp này, hai chất xúc tác là CH3OH và KOH đã xúc tác sự kết hợp của hai mạchcacbon hình thành nên β-Carotene

· Chu trình Sinh tổng hợp β-Carotene do F Hoffman-La Roche & Co Ltd dựa trên phản ứng củaInhoffen: C19 + C2 + C19

Phản ứng kết hợp được dựa trên sự kết hợp của của ba phân tử có mạch cacbon khác nhau Quá trình tổnghợp β-Carotene do F Hoffman-La Roche & Co Ltd

Roche synthesis

Hình 2.11 Sinh tổng hợp β-Carotene do công ty F Hoffman-La Roche & Co Ltd [18]

Trong phản ứng tổng hợp này, hợp chất có mạch 2 cacbon đóng vai trò như cầu nối, kết hợp hai phân tử cómạch 19 cacbon, từ đó tổng hợp nên β-Carotene Quy trình sinh tổng hợp này đang được hãng Roche sử dụngtrong sản xuất β-Carotene

2.3.2.4 Sinh tổng hợp Vitamin A

Beta-caroten còn được gọi là tiền vitamin A, bởi vì nó là một trong những tiền thân quan trọng nhất củavitamin A trong chế độ ăn uống của con người Nếu ta so sánh 2 phân tử sẽ thấy rằng vitamin A (retinol) là ½phân tử beta-caroten.

Hình 2.12 Cấu trúc Vitamin A [19]

Sự sinh tổng hợp vitamin A từ β-Carotene:

Hình 2.13 Sinh tổng hợp vitamin A từ β-Carotene [4]

Khi vào cơ thể beta-carotene chuyển hóa thành vitamin A Beta-carotene bị phân cắt ở giữa mạch carbontrung tâm thành 2 phân tử retinal bằng enzyme 15,15’-dioxygenase Retinal tiếp tục được chuyển hóa bởi enzymthành retinol Retinol tạo thành có thể được hấp thu trực tiếp từ thức ăn vào thành ruột hay sẽ được vận chuyểnnhờ liên kết với protein đến các cơ quan cần thiết hoặc đến gan là nơi tích luỹ vitamin Ngoài ra beta-carotenecũng có thể được chuyển hóa thành những chất khác.

2.3.2.5 Sinh tổng hợp Carotenoids ở nấm men

Hiện nay, nấm men đang được tập trung nghiên cứu khả năng sinh tổng carotenoids của chúng Một phần

là do nấm men ít gây độc và có thể là thức ăn bổ sung cho con người và động vật

Một vài chủng nấm men đã được phân loại dựa trên khả năng và đặc tính sinh carotenoids của chúng Córất nhiều loại carotenoid được tổng hợp từ nấm men, trong đó chủ yếu: carotene, torulene, lycopene,astaxanthin, torularhodin, … Quá trình sinh tổng hợp carotenoid của nấm men cũng trải qua hai giai đoạn để tạo

ra các sản phẩm carotenoid khác nhau là:

· Sinh tổng hợp IPP

· Sinh tổng hợp carotenoids từ IPP

2.3.2.6 Tầm quan trọng của β-Carotene đối với sức khoẻ con người

β-Carotene còn được biết đến là tiền vitamin A Khi hấp thụ vào cơ thể nó được chuyển thành vitamin Avới tỷ lệ 1mcg beta-caroten thì được 0,167mcg vitamin Nhưng ngoài những tác dụng như vitamin A, nó còn làmột nguồn cung cấp vitamin A an toàn, không hề gây độc tính quá liều như vitamin A và điều đặc biệt làbetacaroten khử các gốc tự do tốt hơn vitamin A rất nhiều

Các chế phẩm beta-caroten có hàng loạt tác dụng có lợi cho sức khoẻ Phải kể đến những tác dụng như:khả năng hoạt hóa một số tế bào miễn dịch của cơ thể, beta-caroten có thể giảm tổn thương DNA, bảo vệ datránh tác hại của ánh nắng mặt trời, hạ thấp nguy cơ mắc một số bệnh ung thư, góp phần làm giảm nồng độcholesterol trong máu cũng như một số bệnh tim mạch liên quan

Tia cực tím (Ultraviolet: UV) trong ánh nắng mặt trời tạo ra rất nhiều gốc tự do gây tổn thương tê bào da.Các vitamin và các dưỡng chất có khả năng chống oxy hóa thường tập trung rất nhiều ở da, như beta-caroten

Phân tử vitamin A khi oxy hóa gốc aldehyt của nó sẽ hình thành nên một chất mới có tên là opsin, là chấttham gia vào cấu tạo của mắt Do đó, β-Carotene có ảnh hưởng tốt đến thị lực của con người

Ngoài ra, β-Carotene còn có tham gia quá trình sinh tổng hợp glycoprotein, chất mà nếu thiếu hụt trong cơthể sẽ dẫn đến sự phát triển không bình thường của xương

β-Carotene còn được tìm thấy trong huyết tương người Các nghiên cứu về sức khỏe y học đã cho thấynhững người có lượng β-carotene đưa vào cơ thể cao và có một lượng lớn β-carotene trong huyết tương thì cókhả năng giảm thiểu các mối nguy hiểm của bệnh ung thư phổi

β-Carotene còn có khả năng ngăn ngừa bệnh tim, dựa trên khả năng của β-carotene là có thể kìm chế các

chất LDL (Low Density Lipoprotein ) cholesterol gây hại Theo một nghiên cứu được công bố trên tờ

AmericanJournal of Clinical Nutrition, các chuyên gia đã tính toán rằng phụ nữ sử dụng ít nhất 5.37mg

(8.950IU) beta-carotene mỗi ngày có thể chống lại sự oxy hóa LDL

Có khả năng ngăn ngừa ung thư là một trong những đặc tính quan trọng nhất của β-Carotene Khả năngngăn ngừa bệnh ung thư của β-Carotene còn phải dựa trên sự kết hợp của β-Carotene với các carotenoids khácnhư lycopene và các chất chống oxy hóa như vitamin C, vitamin E

Ngoài ra trên thế giới còn có những công trình đang nghiên cứu về beta-caroten như các phát hiện chothấy beta-caroten có thể là một vũ khí quan trọng trong việc né tránh được các vấn đề về trí nhớ mà có thể làđiềm báo của căn bệnh Alzheimer’s và các chứng bệnh mất trí nhớ khác

2.4 Lên men bán rắn [10],[14]

2.4.1 Khái quát về lên men bán rắn (SSF)

Lên men trên môi trường bán rắn hay lên men trên cơ chất rắn (SSF) là một quá trình trong đó sự sinhtrưởng của vi sinh vật và sự hình thành sản phẩm diễn ra trên bề mặt của nguyên liệu hầu như không có mặtnước tự do, cơ chất chứa ẩm dưới dạng hấp phụ trong mạng chất rắn

Lên men trên môi trường bán rắn đã được sử dụng từ rất lâu trước khi các quá trình sinh hóa và vi sinh cóliên quan được tìm hiểu Năm 2600 trước công nguyên người Ai Cập đã sớm sử dụng SSF để làm ra bánh mì,

sự chuẩn bị Koji cho nước tương đậu nành và sản xuất miso cách đây 1000 năm ở Nhật Bản và Đông Nam Á đãchứng minh sự ứng dụng SSF trong đời sống từ rất lâu Ngày nay SSF đang được quan tâm trở lại một cáchmạnh mẽ trên toàn thế giới và được sử dụng rộng rãi nhằm gia tăng giá trị cho các sản phẩm từ các nguồnnguyên liệu rẻ tiền, các phế liệu nông nghiệp và các chất thải công nghiệp

Các quá trình và sản phẩm lên men SSF được nghiên cứu từ 1920-1940 bao gồm sản xuất acid Gluconic,acid citric, và các loại enzyme Giữa năm 1940-1950 công nghệ lên men đã phát triển một cách nhanh chóng vàcho ra đời những sản phẩm đầu tiên của cả phương pháp lên men trong lòng dung dịch và lên men trên môitrường bán rắn như kháng sinh, penicillin, …Từ năm 1980, lên men SSF đã phát triển trên nhiều khía cạnh mởrộng việc sử dụng trên nhiều loại vi sinh vật khác nhau, sử dụng phế liệu như một loại cơ chất rẻ tiền, dễ kiếm

và phần nào giảm chất gây ô nhiễm môi trường, khám phá các sản phẩm mới

2.4.1.1 Các loại vi sinh vật sử dụng trong lên men bán rắn

Vi khuẩn, nấm men, nấm mốc đếu sinh trưởng và phát triển được trên cơ chất rắn Nấm men được dùngtrong sản xuất cồn công nghiệp, cồn thực phẩm, thức ăn gia súc,… Vi khuẩn được dùng trong sản xuất phântrộn (composting), và các quá trình công nghệ thực phẩm khác

2.4.1.2 Các cơ chất thường dùng trong lên men bán rắn

Cơ chất chính trong SSF là các nguyên liệu thô, phụ phẩm rẻ tiền của ngành nông nghiệp và những phếliệu của các ngành công nghiệp khác, thường có cấu trúc đa phân tử (cung cấp nguồn hidrocacbon và nănglượng) như các nguyên liệu chứa tinh bột: gạo, lúa mì, gạc ngô, xenluloza, các phế liệu ngành công nghiệpthực phẩm: cám, cám mì, sắn, tấm, củ cải đường, bã mía, cùi bắp, vỏ cam, trấu, mạc cưa, bã sắn, ….và cácnguyên liệu như lignoxenluloza, các chất thải giàu pectin cũng được dùng trong SSF để sản xuất ra nhiều sảnphẩm có giá trị cao

2.4.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy bề mặt [15]

Nhìn chung khi lên men bán rắn, cũng như các quá trình lên men khác các thông số chính cần được kiểmsoát bao gồm: các dưỡng chất cần cung cấp, hàm ẩm, nhiệt độ, pH và độ thoáng khí

· Các dưỡng chất cần phải cung cấp

Trong SSF do tốc độ khuếch tán cơ chất hạn chế nên cũng hạn chế sự tiếp xúc giữa vi sinh vật và cơ chất.Một chỉ số quan trọng trong dinh dưỡng quyết định sự sinh trưởng của SSF là tỷ số C/N Tùy từng loài vi sinhvật mà có chỉ số C/N thích hợp khác nhau, chính vì vậy khi thay đổi chỉ số C/N cũng sẽ làm ảnh hưởng đáng kểđến thành phần dinh dưỡng cũng như khả năng sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật nuôi cấy trên môitrường SSF Trong hầu hết các hệ thống SSF, Cacbon có nguồn gốc từ các nguyên liệu tinh bột và xenluloza tựnhiên, trong khi nguồn nitơ thường được bổ sung vào Nguồn nitơ vô cơ thường được bổ sung nhất là NH4Cl,(NH4)2SO4, NH4NO3, D.A.P, urê, … Trong khi nguồn nitơ hữu cơ là bánh dầu đậu nành, bã đậu nành, dịchchiết nấm men, pepton

· Hàm ẩm

Hàm ẩm của cơ chất là một thông số rất quan trọng quyết định đến sự thành công của quá trình lên men,

có thể được theo dõi qua chỉ số hoạt tính của nước (aw) Đa số các vi khuẩn sinh trưởng ở mức aw cao trong khinấm sợi và một số các nấm men sinh trưởng ở mức aw thấp và một số sinh trưởng ở mức độ aw trung bình Tuynhiên khi mức độ aw quá cao làm giảm độ xâm nhập vào khoảng không nội bào, khả năng khuếch tán oxy thấp,

giảm sự trao đổi khí, giảm bề mặt cơ chất và tăng nguy cơ nhiễm tạp khuẩn Ngược lại khi aw thấp dẫn đếngiảm sự trương nở cơ chất và giảm sự sinh trưởng của vi sinh vật.

· Nhiệt độ

Nhiệt độ là một trong những thông số có ảnh hưởng đến các quá trình SSF, do mỗi tế bào có một nhiệt độtối ưu riêng để sinh trưởng và phát triển Trong SSF một lượng lớn nhiệt được trao đổi và điều này có liên quanchặt chẽ đến hoạt tính trao đổi chất của vi sinh vật Kiểm soát nhiệt độ đối với SSF còn nhiều khó khăn đặc biệt

là khi SSF quy mô lớn, khi nồng độ cơ chất cao sự tăng nhiệt trên một đơn vị thể tích là lớn hơn nhiều so vớilên men trên môi trường lỏng

· pH ban đầu

Mặc dù pH là một yếu tố cần quan tâm, nhưng việc điều khiển và kiểm soát pH trong SSF là không đơngiản Việc tạo ra các điện cực để đo pH của chất rắn ẩm khi không có sự hiện diện của nước tự do rất khó khăn.Tuy nhiên dung dịch đệm tốt sẽ giúp ổn định pH trong suốt quá trình lên men Điểm thuận lợi này được khaithác trong việc điều chỉnh pH của chất rắn thông qua việc sử dụng nước ở mức pH mong muốn làm chất tạo độ

ẩm cho môi trường

· Nhu cầu oxy

Năm 1992, Han và Mudgett nhận thấy rằng mức cân bằng của oxy và CO2 trong không khí có ý nghĩa rất lớnđến sự tạo thành sắc tố và cũng ít nhiều ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của nấm khi nuôi trên môi trường bánrắn Trong điều kiện thiếu oxy, có sự tạo thành nhiều ethanol, CO2 và lượng sắc tố được tạo ra ít hơn.[15]

Cơ chế truyền oxy không khí cho các vi sinh vật hiếu khí vẫn chưa rõ ràng, nhưng chúng thường có khảnăng tồn tại do hòa tan trong màng nước xung quanh bề mặt hạt cơ chất Sự thông khí không chỉ cung cấp oxy

mà còn tăng cường việc loại trừ CO2 và tăng cường việc trao đổi nhiệt trong quá trình lên men

2.4.2 Các ứng dụng và yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi bán rắn với nấm men Rhodotorula sp

Các công bố về khả năng lên men bán rắn của giống nấm men Rhodotorula không nhiều Tuy nhiên theo

các tài liệu thu được bước đầu cho thấy giống nấm men này có khả năng lên men bán rắn Nghiên cứu gần nhất

là của Jacob (1991) đã thành công khi lên men bán rắn nấm men Rhodotorula gracilis trên môi trường cơ chất

là cám mì có bổ sung dinh dưỡng Theo Jacob nấm men dầu Rh gracilis có khả năng hình thành lượng sinh

khối cao hơn (13,7g/l) và chất béo (20,3%) trên môi trường nghèo nitrogen, rẻ tiền và mang lại hiệu quả kinh tếcao đó là rỉ đường không chứa dịch chiết nấm men bằng phương pháp lên men chìm Tuy nhiên khi tiến hànhlên men bán rắn trên cơ chất cám mì có bổ sung các nguồn dinh dưỡng khác nhau có ảnh hưởng đến lượng sinhkhối, protein tạo thành, sự hình thành dầu, sự hiện diện của các acid béo và tỷ lệ giữa acid béo bão hòa và