Tìm hiểu về điều kiện thu nhận EPS từ vi khuẩn lactic

Ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học – công nghệ, con người ngày càng tiếp cận gần hơn, hiểu biết nhiều hơn đến thế giới sinh vật nói chung và hệ vi sinh vật nói riêng. Và, với những bước tiến của mình, các nhà khoa học đã nghiên cứu thành công rất nhiều những sản phẩm được sản xuất từ vi sinh vật, góp phần quan trọng trong nền công nghiệp sản xuất,công nghệ thực phẩm, trong y học, trong xử lý môi trường,....Và một trong những sản phẩm quan trọng đó là exopolysaccharides. Exopolysaccharide được tách chiết từ thực vật thường gặp nhiều khó khăn do chúng liên kết chặt chẽ với các thành phần có trong tế bào thực vật. Việc khai thác exopolysaccharide từ vi sinh vật thuận lợi hơn và lại được tìm thấy với số lượng lớn bởi các chủng vi khuẩn lactic Do sự đa dạng về thành phần, exopolysacchride đã được ứng dụng phong phú trong các ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm, đặc biệt được sử dụng để cải thiện kết cấu và tính thống nhất của các sản phẩm sữa lên men. Bên cạnh đó, expolysacchide còn được cho rằng là có các đặc tính có lợi sức khỏe như kháng u, chống loét, và các hoạt động kích thích miễn dịch… Việt Nam ta là nước có nhiều sản phẩm lên men nên nguồn vi khuẩn lactic đa dạng, lại thuộc vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, thuận lợi cho quá trình nuôi cấy, phát triển của các chủng vi sinh vật. Hàm lượng EPS được sinh tổng hợp phụ thuộc vào chủng vi sinh vật, điều kiện nuôi cấy. Chính vì vậy tôi quyết định chọn đề tài:“ Tìm hiểu về điều kiện thu nhận của EXOPLYSACCHARIDES (EPS) từ vi khuẩnlactic” để tạo tiền đề cho các nghiên cứu ứng dụng khác, giúp cải thiện, nâng cao chất lượng sản phẩm và đảm bảo cho sức khỏe của con người.

- Tài liệu tham khảo

1 Ngày giao nhiệm vụ: 28/09/2015

2 Ngày hoàn thành: 28/12/2015

Trưởng bộ môn CNSTHT

TS Nguyễn Văn Toản

Huế, ngày 28 tháng 12 năm 2015

Giáo viên hướng dẫn

Th.S TRẦN BẢO KHÁNH

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học – công nghệ, con người ngày càngtiếp cận gần hơn, hiểu biết nhiều hơn đến thế giới sinh vật nói chung và hệ vi sinhvật nói riêng Và, với những bước tiến của mình, các nhà khoa học đã nghiên cứuthành công rất nhiều những sản phẩm được sản xuất từ vi sinh vật, góp phần quantrọng trong nền công nghiệp sản xuất,công nghệ thực phẩm, trong y học, trong xử

lý môi trường, Và một trong những sản phẩm quan trọng đó làexopolysaccharides Exopolysaccharide được tách chiết từ thực vật thường gặpnhiều khó khăn do chúng liên kết chặt chẽ với các thành phần có trong tế bào thựcvật Việc khai thác exopolysaccharide từ vi sinh vật thuận lợi hơn và lại được tìmthấy với số lượng lớn bởi các chủng vi khuẩn lactic

Do sự đa dạng về thành phần, exopolysacchride đã được ứng dụng phongphú trong các ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm, đặc biệt được sử dụng

để cải thiện kết cấu và tính thống nhất của các sản phẩm sữa lên men Bên cạnh đó,expolysacchide còn được cho rằng là có các đặc tính có lợi sức khỏe như kháng u,chống loét, và các hoạt động kích thích miễn dịch…

Việt Nam ta là nước có nhiều sản phẩm lên men nên nguồn vi khuẩn lactic

đa dạng, lại thuộc vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, thuận lợi cho quá trình nuôi cấy,phát triển của các chủng vi sinh vật Hàm lượng EPS được sinh tổng hợp phụ thuộcvào chủng vi sinh vật, điều kiện nuôi cấy Chính vì vậy tôi quyết định chọn đề tài:“

Tìm hiểu về điều kiện thu nhận của EXOPLYSACCHARIDES (EPS) từ vi khuẩnlactic” để tạo tiền đề cho các nghiên cứu ứng dụng khác, giúp cải thiện,

nâng cao chất lượng sản phẩm và đảm bảo cho sức khỏe của con người

PHẦN 1 : TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTIC

1.1Vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacillaceae Các chủng vi khuẩn thuộc

nhóm này có đặc điểm sinh thái khác nhau nhưng đặc tính sinh lý tương đối giống nhau Tất cả đều có đặc điểm có đặc điểm chung là vi khuẩn Gram

dương, không tạo bào tử, không di động, hô hấp tùy tiện ( kị khí và hiếu khí )

và không chứa các men hô hấp như xitoccrom và catalaza Chúng thu nhận năng lượng nhờ quá trình phân giải hydrat cacbon và sinh ra axit lactic, sinh sảnbằng hình thức phân đôi tế bào

Nhóm vi khuẩn lactic bao gồm nhiều giống khác nhau: Streptococcus,

Pediococcus, Lactobacillus, Leuconostoc Ngày nay người ta bổ sung vào

nhóm vi khuẩn lactic những chủng vi khuẩn thuộc giống Bifidobacterium.

1.2 Đặc đểm hình thái

Tùy thuộc vào hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hình cầu và hình que Kích thước của chúng thay đổi tùy từng loài

- Giống Streptococcus có dạng hình tròn hoặc hình ovan, đường kính tế

bào 0,5-1µm Sau khi phân chia theo một phương chúng thường xếp riêng biệt, cặpđôi hoặc chuỗi ngắn

- Giống Leuconostoc có hình dạng hơi dài hoặc hình ovan, đường kính từ

0,5-0,8µm và chiều dài khoảng 1,6µm trong một số điều kiện chúng cũng có dạng hơi tròn, chiều dài khoảng 1-3 µm Sau khi phân chia chúng thường sắp xếp thành chuỗi, không tạo thành đám tập trung

- Giống Lactobacillus có dạng hình que Tùy vào điều kiện của môi trường sống

mà hình dạng của chúng thay đổi từ hình que ngắn đến dài Sắp xếp thành chuỗi hay đứng riêng lẽ

- Giống Pedicoccus là những tứ cầu khuẩn hoặc song cầu khuẩn Có hoạt

tính thủy phân protein rất yếu

- giống Bifidobacterium là những trực khuẩn, khi mới phân lập có thể

phân nhánh dạng chữ Y, V và tập hợp thành khối Sau nhiều lần cấy truyền chúng trở thành dạng trực khuẩn dạng thẳng hoặc hơi uốn cong

Vi khuẩn lactic có đặc điểm chung là vi khuẩn Gram dương, thử nghiệm oxydase

và catalase âm tính, hình que hay hình cầu, không tạo bào tử, không di động, kỵ khí tùy nghi và lên men carbohydrate tạo sản phẩm chính cuối cùng là acid lactic (Abee và ctv, 1999) Ngoài ra, nó còn sản sinh ra acid acetic, ethanol, các hợp chất

thơm, bacteriocin, exopolysaccharide và một số enzyme quan trọng khác (De Vuyst và Leroy, 2007).

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển

1.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy

Nhiệt độ nuôi cấy ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic, nhìn chung thì ở 37oC là điều kiện tối ưu để cho vi khuẩn sinh trưởng phát triển tốt nhất Nuôi để thu EPS thì nhiệt độ thích hợp từ 40-45oC, mà nhiệt độ tối ưu là

43oC Đó là điều kiên tốt nhất ,tối ưu nhất để cho vi khuẩn sinh trưởng và phát triển1.3.2 Ảnh hưởng của PH môi trường dịch nuôi cấy pH

pH cũng ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic, nó chỉ sinhtrưởng tốt trong môi trường có độ ph thấp (3-4) và ở môi trường pH cao hơn (5-7) tốc độ sinh trưởng của chúng chậm, nhưng chúng vẫn tồn tại Còn nuôi vi khuẩn đểsản sinh EPS thì pH tốt nhất là từ (6,5-7)

1.3.3 Ảnh hưởng của muối vô cơ

Để đảm bảo sinh trưởng và phát triển đầy đủ, các vi khuẩn còn cần đến rấtnhiều chất vô cơ như đồng, sắt, natri, kali, photpho, iot, lưu huỳnh, magie và đặcbiệt là mangan [2]

1.3.4 Nước

Nói chung, vi khuẩn cần một hoạt động của nước khá cao (0.9 hoặc cao hơn) để tồn tại Có một vài loài có thể chịu đựng được hoạt động dưới nước thấp hơn so với điều này, nhưng thông thường các loại nấm men và nấm sẽ chiếm ưu thế trên thực phẩm có hoạt độ nước thấp hơn

1.3.5 Oxygen

Đối với vi khuẩn lên men là vi khuẩn kỵ khí, thì chúng rất cần cung cấp oxy cho các hoạt động trao đổi chất Một số chủng, đặc biệt là lactobacilli, là vi khuẩn hiếu khí Trong quá trình lên men hiếu khí, sự có mặt của oxy là một trong những yếu

tố hạn chế Nó quyết định loại và số lượng sản phẩm sinh học thu được, số lượng chất nền và tiêu thụ năng lượng giải phóng từ phản ứng

1.3.6 Các chất dinh dưỡng

Tất cả các vi khuẩn cần một nguồn dinh dưỡng cho sự trao đổi chất Các vi khuẩn lên men cần carbohydrates - một trong hai loại đường đơn như glucose và fructose hoặc carbohydrate phức tạp như tinh bột hoặc cellulose Các yêu cầu về năng lượng của vi sinh vật là rất cao Hạn chế dùng các chất nền có sẵn có thể kiểm tra

sự phát triển của họ

1.4 Khả năng sinh các hợp chất có chức năng sinh học

1.4.1 Các hợp chất kháng khuẩn được sản xuất bởi vi khuẩn Lactid

Các hoạt động bảo quản của môi trường trong các hệ thống thực phẩm và nước giảikhát là do sự kết hợp của một loạt các chất chuyển hóa kháng khuẩn sản sinh trong quá trình lên men Chúng bao gồm nhiều axit hữu cơ như axit lactic, acetic acid propionic và sản xuất là sản phẩm cuối cùng mà cung cấp một môi trường có tính axit không thuận lợi cho sự phát triển của nhiều vi khuẩn gây bệnh và gây hư hỏng các vi sinh vật Axit thường được cho là gây kháng khuẩn nó ảnh hưởng bởi sự ức chế vận chuyển tích cực, giảm pH trong tế bào và ức chế một loạt các chức năng chuyển hóa, ức chế cả vi khuẩn gram dương và gram âm cũng như nấm men Một

ví dụ là axit propionic sản xuất bởi vi khuẩn axit propionic, mà đã hình thành cơ sởcho một số sản phẩm hoạt động kháng khuẩn của nó chống lại vi sinh vật như nấm men và nấm mốc

1.4.2 Bacteriocins từ vi khuẩn Lactic

Bacteriocins được ribosomally tổng hợp chất kháng khuẩn, được sản xuất bởi nhiều

loài vi khuẩn khác nhau trong đó có nhiều chủng của các vi khuẩn axit lactic

[13] Một số bacteriocins sản xuất bởi vi khuẩn axit lactic, như nisin, ức chế không chỉ liên quan chặt chẽ mà còn có hiệu quả chống lại các tác nhân gây bệnh truyền qua thực phẩm và nhiều người khác, gram dương vi sinh vật gây hư hỏng [14] Vì

lý do này, bacteriocins đã thu hút được sự quan tâm đáng kể để sử dụng làm chất bảo quản thực phẩm tự nhiên trong những năm gần đây, điều này đã dẫn đến việc phát hiện một nguồn tiềm năng của các chất ức chế protein

Một lợi thế của bacteriocins hơn kháng sinh truyền thống là các enzym tiêu hóa phá hủy chúng Bacteriocin chủng sản xuất có thể được sử dụng như là một phần của, hoặc hỗ trợ cho những môi trường cho thực phẩm lên men trong để cải thiện

an toàn và chất lượng

Ngoài axit, thì vi khuẩn lactic có thể sản xuất một loạt các chất chuyển hóa kháng sinh khác như ethanol từ đường heterofermentative, H2O2 sản xuất trong quá trình tăng trưởng hiếu khí và diacetyl được tạo ra từ pyruvate dư thừa tới từ citrate [9] Đặc biệt, H2O2 có thể có một tác dụng oxy hóa mạnh mẽ trên lipid màng tế bào

và protein tế bào và được được sản xuất sử dụng các enzym như oxidoreductases protein flavor NADH peroxidase, NADH oxidase và glycerophosphate oxidase [10] Rõ ràng, mỗi hợp chất kháng sinh được sản xuất trong quá trình lên men cungcấp một trở ngại thêm cho mầm bệnh và vi khuẩn gây hư hỏng để khắc phục trước khi nó có thể tồn tại và / hoặc sinh sôi nảy nở trong một thực phẩm hoặc nước giải khát, từ thời điểm sản xuất đến thời điểm tiêu thụ Vì bất kỳ vi sinh vật có thể sản xuất một số chất ức chế tiềm năng kháng khuẩn của nó được xác định bởi các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn không mong muốn

Gần đây hơn, các kháng sinh đầu tiên được sản xuất bởi một loại vi khuẩn acid lactic được phát hiện [11] là Reuterocyclin là một điện tích âm, chất đối kháng cao

kỵ nước

1.5 Vai trò , chức năng của vi khuẩn lactic:

Những ứng dụng của vi khuẩn lactic

Nhờ khả năng tạo ra axit lactic từ các nguồn cacbonhidrat khác nhau mà các chủng

vi khuẩn lactic đã được ứng dụng trong nhiều ngành sản xuất và chế biến

1.5.1 Những ứng dụng trong công nghệ thực phẩm

Vi khuẩn axit lactic được sinh vật công nghiệp quan trọng đối với khả năng lên men được công nhận của họ cũng như sức khỏe của họ và lợi ích dinh dưỡng Loài được sử

dụng cho quá trình lên men thực phẩm thuộc về các chi Lactococcus, Streptococcus,

Pediococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, và mới công nhận Carnobacterium Những

sinh vật này đã được phân lập từ các loại ngũ cốc, màu xanh lá cây, sữa và các sản phẩm thịt, rau quả lên men, và các bề mặt niêm mạc của động vật

Khi sử dụng để làm chậm sự hư hỏng và bảo quản thực phẩm thông qua quá trình lên men tự nhiên, họ đã tìm thấy ứng dụng thương mại như môi trường trong sữa, bánh, thịt, rau, và cồn ,nước giải khát công nghiệp Họ sản xuất các hợp chất khác nhau như các axit hữu cơ, diacetyl, hydrogen peroxide, và bacteriocins hoặc protein diệt khuẩn trong quá trình lên men lactic Không chỉ là các thành phần mong muốn cho các hiệu ứng của họ về hương vị thực phẩm, mùi, màu sắc và kết cấu, nhưng họ cũng

ức chế vi khuẩn không mong muốn Do đó, vi khuẩn acid lactic và các sản phẩm của họ cho lên men các loại thực phẩm đặc biệt hương vị, kết cấu, và hương liệu trong khi ngăn chặn sự hư hỏng, kéo dài thời hạn sử dụng, và ức chế vi sinh vật gây bệnh.Trong công nghệ thực phẩm, việc sử dụng quá trình lên men lactic không chỉ nhằm mục đích bảo quản mà còn nhằm đưa ra thị trường các loại thực phẩm có

tính chất và hương vị mong muốn Các ứng dụng chủ yếu gồm

1.5.1.1 Chế biến các sản phẩm sữa

Ngoài khả năng lên men làm cho sữa không bị hư hỏng, các chủng vi

khuẩn lactic còn có nhiều khả năng đặc biệt khác Nhờ đó mà người ta đã sản xuất hàng loạt các sản phẩm từ nguồn nguyên liệu sữa ban đầu Như lợi dụng khả năng làm đông tụ sữa của vi khuẩn Streptococcus lactic để sản xuất sữa chua hay khả

năng tạo ra các mùi vị, tạo các chất thơm của chủng Leuconostoc để sản xuất bơ,

phomat…

1.5 1.2 Sản xuất bánh mỳ đen

Đây là loại bánh mỳ có chất lượng cao bên cạnh quá trình lên men bởi

nấm men tạo rượu etylic và CO2

Người ta còn sử dụng quá trình lên men của vi khuẩn lactic để tạo vị chua và hương thơm đặc trưng cho sản phẩm

1.5.1.3 Ủ thức ăn gia súc

Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến trong các trang trại chăn nuôi

Thức ăn khi ủ không những giảm được sự tổn thất giá trị dinh dưỡng mà còn bổ sung nhiều loại vitamin do vi sinmh vật tổng hợp Phương pháp này dựa vào sự chuyển hóa đường có sẵn trong nguyên liệu của vi khuẩn lactic

Để khối ủ chua thức ăn gia súc có chất lượng tốt, người ta thường sử dụng

vi khuẩn lactic thuần khiết như:Lactobacillus plantarm, Thermobacterium

cerealle.

1.5.1.4 Muối chua rau quả

Cũng như ủ chua thức ăn gia súc, vấn đề muối chua rau quả cũng nhằm

thực hiện hai mục đích:

- Bảo quản nguyên liệu

- Làm tăng giá trị dinh dưỡng và giá trị cảm quan

Đây là phương pháp vừa chế biến vừa bảo quản rau quả rất phổ biến, được

sử dụng nhiều trong gia đình cũng như trong kĩ nghệ đồ hộp Hiện nay có nhiều sản phẩm muối chua được sản xuất và sử dụng rộng rãi như dưa cải muối chua, dưa chuột muối chua

1.5.1.5 Sản xuất axit lactic và muối lactat

Ngoài việc ứng dụng trong các sản phẩm lên men, người ta còn sử dụng các chủng

lactic như Lactobacterium coaglulans và Lactobacillus delbrueckii để sản xuất ra

một lượng lớn axit lactic và muối lactat dùng làm chất phụ gia thực phẩm

1.5.2 Ứng dụng trong y dược

Vi khuẩn lactic được sử dụng trong y học để chữa bệnh đường ruột dung trong

phẫu thuật chỉnh hình, nha khoa,bệnh phụ khoa…

1.5.3 Ứng dụng trong nông nghiệp và môi trường

Vi khuẩn lactic có khả năng hạn chế sự phát triển của Fusarium, loại nấm gây bệnhquan trọng trong nông nghiệp Nấm Fusarium khi phát triển sẽ làm cây yếu đi và

đây là cơ hội gây bệnh cho cây trồng

Chế phẩm EM hay chế phẩm vi sinh hữu hiệu nó bao gồm 80 chủng vi sinh trong

đó có sự góp phần của vi khuẩn lactic Hiệu quả của chế phẩm này là cải tạo đất,

tang năng suất cây trồng và giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường

2.1 Giới thiệu chung về EPS

Ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học – công nghệ, con người ngày càng tiếp cận gần hơn, hiểu biết nhiều hơn đến thế giới sinh vật nói chung và hệ vi sinh vật nói

riêng Và, với những bước tiến của mình, các nhà khoa học đã nghiên cứu thành

công rất nhiều những sản phẩm được sản xuất từ vi sinh vật, góp phần quan trọng

trong nền công nghiệp sản xuất, trong y học, trong xử lý môi trường, Và một

trong những sản phẩm quan trọng đó là exopolysaccharides

polysaccharide cấu trúc và polysaccharide ngoại bào hay còn gọi làexopolysaccharide (EPS) và được biết đến như một chất nhờn (Sutherland, 1972)Exopolysaccharide thường bao gồm các monosacarit và một số nhóm thể khôngcacbohydrate (như acetate, pyruvate, succinate, và photphate) EPS thiết lập chứcnăng, toàn bộ cấu trúc và được coi là thành phần cơ bản quyết định tính chất lý hóacủa một màng sinh học.

Do sự đa dạng, phong phú trong thành phần, exopolysaccharides đã được ứng dụngphong phú trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm EPS của vi sinh vật cung cấp đặc tính gần giống như chất gôm hiện đang sử dụng Hơn nữa, một tiến bộ đáng kể đã được thực hiện trong việc phát hiện và phát triển các EPS

vi sinh vật mới có ý nghĩa trong công nghiệp

2.3 Quá trình sinh tổng hợp EPS bởi vi khuẩn lactic (LAB) :

EPS từ LAB được chia thành hai lớp, homo và hetero-EPS Homo-EPS được cấu tạo từ một loại monosaccharide, trong khi hetero-EPS bao gồm các đơn vị lặp đi lặp lại thường xuyên của các gốc thuốc 3-8 carbohydrate khác nhau được tổng hợp

từ bên trong tế bào tiền thân nucleotide đường Sinh tổng hợp các homo-EPS và hetero-EPS là khác nhau

Homo-EPS được làm từ sucrose sử dụng glucansucrase hoặc levansucrase , thành phần hóa học của homo-EPS, bao gồm một loại duy nhất của monosaccharide (α-D-glucans, β-D-glucans, fructans, và những người khác đại diện bởi polygalactan)

Và sự tổng hợp của hetero-EPS bao gồm bốn bước chính, vận chuyển đường, tổng hợp nucleotide đường, lặp đi lặp lại tổng hợp đơn vị, và trùng hợp của các đơn vị lặp lại , và thành phần hóa học hetero-EPS, bao gồm các loại khác nhau của

monosacarit , chủ yếu là D-glucose, D-galactose, L-rhamnose, và các dẫn xuất của

họ

Hai nhóm quan trọng của homo-EPS được sản xuất bởi LAB;

- α-glucans, chủ yếu gồm các dư lượng glucose α-1,6- và α-1,3-liên kết, cụ thể

là dextrans, được sản xuất bởi Leuconostoc mesenteroides

dextranicum subsp.mesenteroide s và Leuconostoc mesenteroides subsp

mutans và sản xuất bởi Streptococcus mutans vàStreptococcus sobrinus;

- fructans, chủ yếu gồm các phân tử fructose β-2,6-liên kết, như Levan sản

xuất bởi Streptococcus salivarius

2.3.1 QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP HOMO EPS

Sinh tổng hợp EPS của vi khuẩn là một quá trình phức tạp liên quan đến số lượng lớn các enzyme và các protein điều hòa Các gen mã hóa các protein cần thiết cho

sự tổng hợp EPS là các plasmid xứ trong các chủng LAB mesophilic

như Lactococcus và chromosomally nằm trong các chủng Streptococcus ưa nhiệt

và Lactobacilli

EPS Homo được tổng hợp bên ngoài các tế bào bằng cách glycosyltransferaza cụ thể (GTF) hoặc fructosyltransferase (FTF) enzyme (glucansucrases thường được đặt tên hoặc fructan-sucrases) Homo-EPS sản xuất LAB cũng sử dụng enzyme GTF ngoại bào để tổng hợp cao phân tử khối lượng α-glucans từ sucrose Quá trìnhnày sử dụng sucrose như một chất cụ thể, và năng lượng cần thiết cho quá trình này xuất phát từ quá trình thủy phân sucrose Không có yêu cầu năng lượng cho EPS-sản xuất khác hơn cho sinh tổng hợp enzyme vì EPS tổng hợp bởi GTF hoặc FTF không liên quan đến quá trình vận chuyển tích cực hoặc sử dụng tiền chất carbohydrate kích hoạt Do đó, một lượng lớn sucrose có thể dễ dàng được chuyển

đổi để EPS Lb sanfranciscensis sản xuất lên đến 40 g / l Levan và 25 g / l

1-kestose trong tăng trưởng trong sự hiện diện của 160 g / l sucrose

Phản ứng tổng hợp Glucan được xúc tác bởi GTF có thể được viết như sau (Hình 1).:

sucrose + H 2 O → glucose + fructose

sucrose + acceptor carbohydrate → oligosaccharide + fructose

sucrose + glucan (n) → glucan (n + 1) + fructose

Hình 1 :Cơ chê tổng hợp dextran

2.3.2.QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP HETERO – EPS

EPS-hetero không được tổng hợp bởi các enzyme ngoại bào, nhưng thay vào đó làtổng hợp của một chuỗi phức tạp của các tương tác liên quan đến các enzyme trong

tế bào EPS được thực hiện bằng cách trùng hợp của các đơn vị lặp đi lặp lại, và các đơn vị này lặp đi lặp lại được xây dựng bởi một loạt các bổ sung các nucleotideđường ở màng tế bào chất Đường là nguyên liệu khởi đầu cho chuỗi tổng hợpCác con đường sinh hóa hàng đầu để tổng hợp exopolysaccharide được khá

dễ hiểu và có thể được chia thành bốn bước khác nhau:

Đó là sự vận chuyển đường, sự kết hợp gốc đường với nucleotide, sự tổng hợp các đơn vị trên và cuối cùng là sự polymer hóa các đơn vị đó tạo thành hetero-EPS

Đa số các EPS là heteropolysaccharides (HePSs) chứa chuỗi dài lặp lại tiểu đơn vị của hai hoặc nhiều monosaccharit Nhưng chúng thường được sản xuất với số lượng nhỏ chỉ có 2 g/l Ngược lại homopolysaccharides (HoPSs) ít hơn, nhưng chúng có thể được tạo ra với số lượng lớn thích hợp cho nhu cầu thương mại,

chẳng hạn như dextran bởi Leuconostoc mesenteroides, Streptococcus mutan, Gluconobacter oxydan; Levan bởi chủng Lactobacillus reuteri 121; và fructan bởi Lactobacillus sanfranciscensis LTH2590 (Geal-Schutten et al, 1998; De Vuyst và Degeest, 1999; Hijum et al, 2001; Korakli et al, 2002; Naessens et al, 2005)

Một loạt các enzyme trong tế bào tham gia vào quá trình sinh tổng hợp tổng thể, đều có chức năng chuyên biệt trong quá trình này Các men này đã được chia thành

bốn nhóm bởi Sutherland rộng tương ứng với bốn bước tổng hợp

exopolysaccharide: Nhóm I, các enzym chuyển hóa chất nền ban đầu; Nhóm II, enzym tổng hợp và nucleotide đường; Nhóm III, transferases hình thành các đơn vịmonosaccharide; Nhóm IV, translocases / polymerase tổng hợp các phân tử

exopolysaccharide

Các bước ban đầu của sự tổng hợp exopolysaccharide là kích hoạt của

monosacarit thông qua hình thành các nucleotide đường, và điều này xảy ra

trong tế bào Các enzym Nhóm I là các enzym thường được sử dụng trong

một loạt các quá trình trao đổi chất trong tế bào Các enzyme đầu tiên,

hexokinase, phosphoryl hóa đường, ví dụ: glucose (GLC) thành

glucose-6-phosphate (6-P) Tiếp theo là chuyển đổi phosphoglucomutase

GLC-6-P thành glucose-1-phosphate (GLC-1-P)

Enzyme Nhóm II cũng nằm trong tế bào Uridine diphosphate-glucose

pyrophosphorylase (pyrophosphorylase UDP-glucose) xúc tác cho sự

chuyển đổi của GLC-1- P để tổng hợp uridine diphosphate-glucose

(UDP-GLC) Bước này rất quan trọng bởi vì UDP-GLC là tiền thân chính cho

exopolysaccharide sinh tổng hợp

Các bước tiếp theo của sự tổng hợp exopolysaccharide là lắp ráp của các

đơn vị lặp lại thông qua việc bổ sung các loại đường để isoprenoid lipid

Các enzym Nhóm III nằm trong tế bào màng periplasmic các men này,

được gọi là transferases glycosyl hỗ trợ lắp ráp của các loại đường Họ

chuyển UDP-GLC, UDP- Gal, và / hoặc UDP-GLC UA để hình thành các

đơn vị mà được gắn vào một gốc glycosyl lipid phosphate trong màng tế

bào lặp đi lặp lại

Tiếp theo là trùng hợp, được xúc tác bởi các enzym Nhóm IV trong màng

tế bào Những translocases và polymerase thực hiện các bước trùng hợp,

kết hợp phức nucleotide đường để hình thành các đại phân tử

polysaccharide

Cuối cùng, các phân tử exopolysaccharide sau đó được bài tiết qua màng tế

bào chất và vách tế bào vào môi trường ngoại bào

2.4 Vai trò, chức năng của exopolysaccharides

Exopolysaccharide này (EPS) sản xuất bởi vi khuẩn acid lactic (LAB) là chủ đề của một số ngày càng tăng của các nghiên cứu LAB là những sinh vật cấp thực phẩm, sở hữu (GRAS) tình trạng chung công nhận an toàn, và có thể sản xuất đó làkhả năng hữu dụng như chất phụ gia an toàn để cải thiện kết cấu và độ nhớt của

sản phẩm sữa lên men tự nhiên Hơn nữa, nó đã được gợi ý rằng một số sản xuất bởi vi khuẩn axit lactic có thể đem lại lợi ích sức khỏe cho người tiêu dùng (Tallon

et al., 2003).Trong ngành công nghiệp thực phẩm được sử dụng làm chất ổn định, chất nhũ hoá, đại lý keo [1] Trong việc thu các chất dinh dưỡng, chống ăn mòn [2] EPS được tổng hợp bởi các vi khuẩn nhạy cảm với phân hủy sinh học trong tự nhiên, do đó ít ô nhiễm môi trường hơn so với các polyme tổng hợp [3]

Việc sử dụng EPS-sản xuất LAB có thể dẫn đến các sản phẩm an toàn và tự nhiên với giảm sử dụng cssshất ổn định (Duboc và Mollet, 2001) Độ nhớt của sản phẩm sữa lên men tự nhiên Hơn nữa, nó đã được gợi ý rằng một số sản xuất bởi vi khuẩnaxit lactic có thể đem lại lợi ích sức khỏe cho người tiêu dùng (Tallon et al., 2003).Exopolysaccharides Capsular có thể bảo vệ vi khuẩn gây bệnh và góp phần vào khả năng lây bệnh nhân tạo của chúng Phần đính kèm của vi khuẩn cố định nitơ ở

rễ cây và các phần tử trong đất, có ý nghĩa quan trọng đối với vùng xung quanh trong đất của vùng rễ và lây nhiễm của thực vật, có thể được trung gian bởi

exopolysaccharides Một ví dụ cho việc sử dụng công nghiệp của

exopolysaccharides là ứng dụng dextran trong bánh mì panettone và các ngành công nghiệp bánh Exopolysaccharides cũng có một vai trò quan trọng trong các bệnh nhiễm trùng nội nha

Exopolysaccharide này (EPS) là rất quan trọng về kinh tế vì nó có thể truyền đạt tác dụng chức năng với thực phẩm và ảnh hưởng có lợi cho sức khỏe

Tương tự như này, tại một trong những thí nghiệm in vitro, Lebeer et al cho rằng

EPS của L rhamnosus GG tạo thành một lá chắn bảo vệ chống lại các yếu tố miễn

dịch bẩm sinh trong ruột Các chủng đột biến (không có đặc điểm sản xuất EPS)

là nhạy cảm hơn đối với các phân tử bảo vệ vật chủ bẩm sinh, chẳng hạn như

LL-37 peptide kháng khuẩn và bổ sung các yếu tố Điều này cho thấy rằng EPS tạo thành một lá chắn bảo vệ cho LGG chống lại những phân tử trong đường ruột.EPS đóng một vai trò quan trọng trong kết cấu, cảm giác miệng, nhận thức

vị giác và sự ổn định của các sản phẩm sữa nên đã được sử dụng rộng rãi trongviệc sản xuất các sản phẩm sữa lên men ở Bắc Âu, Đông Âu và châu Á (De Vuyst

et al., 2001, Ruas-Madiedo, 2002 & 2003) [24].

Trong các nghiên cứu trước đó, các EPS trung tính đã được tìm thấy với số

lượng lớn bởi các chủng Lactobacillus fermentum, có độ nhớt ở mức độ cao , là

một ứng cử viên nặng ký trong việc sản xuất EPS như một chất phụ gia để tăng độdẻo của thực phẩm [16]

2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh EPS

EPS được sinh tổng hợp từ các chủng của vi khuẩn (ở đây ta đang tìm hiểu

về vi khuẩn lactic), mà vi khuẩn lactic lại có nhiều chủng thuộc các giống khácnhau Vì vậy, các chủng khác nhau sẽ có một quá trình sinh tổng hợp EPS khácnhau.

2.5.1 Thành phần môi trường:

Môi trường phát triển và các thông số môi trường đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men của EPS Các nghiên cứu cho thấy rằng các thành phần môi trường có thể ảnh hưởng đến tỷ lệ cụ thể của tổng hợp EPS, kích thước phân tử củaEPS, mức độ của các phân nhánh và thành phần của nó

Một số nghiên cứu đã báo cáo rằng sản lượng của EPS được sản xuất bởi các vi khuẩn axit lactic có thể bị ảnh hưởng bởi thay đổi các thành phần môi trường (Van Den Berg et al, 1995; Gamar et al 1997,; Grobben et al., 1997)

2.5.1.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Thành phần carbohydrate của môi trường ảnh hưởng đến năng suất của EPS nhưngkhông ảnh hưởng đến cấu trúc hóa học của chúng Nó cũng ảnh hưởng đến độ nhớtcủa EPS do sự không đồng nhất trong các trọng lượng phân tử [10]

Glucose là nguồn carbon hiệu quả nhất cho việc sản xuất EPS, trong khi fructose

và sucrose đều không phải là nguồn carbon hiệu quả

Ảnh hưởng của nguồn carbon vào sản xuất EPS đã được nghiên cứu bằng cách bổ sung trong sữa tách kem với 2% (w / v) của các loại đường khác nhau (glucose, lactose, galactose và fructose)

Ảnh hưởng của nguồn carbon trên tăng trưởng và EPS sản xuất bởi LAB đã được báo cáo là phụ thuộc vào chủng cụ thể, các loại đường, và các tính chất của các tế bào chuyển hóa carbohydrate (24) Trước đây, glucose, lactose, và galactose đượctìm thấy là nguồn carbon thích hợp cho EPS vi khuẩn phát triển

Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nguồn carbon vào sản xuất EPS của B3 chủng,G12 và W22, glucose được bổ sung vào MRS và M17 ở nồng độ 5, 10, 15, 20, 25,30 g / L

Các loại nguồn carbon có một ảnh hưởng rất lớn trên EPS suất và cũng có thể ảnh

hưởng đến các thành phần của EPS L delbrueckii subsp bulgaricus NCFB 2772

sản xuất nhiều hơn ba lần EPS với glucose hơn với fructose như một nguồn đường

và các loại EPS được sản xuất bởi sinh vật này đã bị ảnh hưởng bởi các nguồn đường là tốt (Grobben et al., 1997) Grobben et al (1996) cho rằng, quy định của

con đường sinh tổng hợp trong EPS L bulgaricus NCFB 2772 có thể là phụ thuộc

vào các nguồn carbohydrate Cerning et al (1994) báo cáo rằng L casei CG11 đã

có thể sản xuất EPS trong sự hiện diện của các loại đường khác nhau (glucose, galactose, lactose, sucrose, maltose, melibiose); Tuy nhiên, các nguồn carbon hiệu quả nhất là glucose Nồng độ đường đã có một ảnh hưởng đáng kể về sản xuất EPS Ví dụ, tăng nồng độ glucose dẫn đến tăng sản xuất EPS.

Ngoài ra, Sanchez et al (2006) nhận thấy rằng sản lượng của EPS được sản xuất

bởi L pentosus LPS26 bị ảnh hưởng đáng kể bởi các nguồn carbon như glucose

Gancel và Novel (1994) tìm thấy một mối tương quan giữa nguồn tối ưu carbon

(glucose hoặc fructose) và sản xuất nhiều hơn EPS bởi một chủng công nghiệp S thermophilus S22.

Một bài báo khác thu thập có kết quả: hiệu quả của việc bổ sung trong sữa tách

kem với nguồn carbon trên sự tăng trưởng và EPS sản xuất bởi L fermentum F6

được điều tra khi các chủng đã được cấy ở 37 ° C và tại pH ban đầu là 6,5 đối với

48 h Bổ sung 2% (w / v) của glucose, fructose, galactose hoặc lactose trong sữa không béo dẫn đến mức độ khác nhau của sự gia tăng trong sự tăng trưởng của vi khuẩn và EPS sản xuất, với glucose cho hầu hết các sinh khối (2,69 × 108 cfu / ml

ở 24h) và hầu hết EPS sản xuất Tính hiệu quả của các loại đường về sản xuất EPS

là theo thứ tự của glucose (33.05 mg / l ở 32 h), fructose (16.40 mg / l ở 40 h), lactose (13,94 mg / l ở 48 h) và galactose (12.50 mg / l ở 32 h)

2.5.1.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Ảnh hưởng của nguồn nito vào sản xuất EPS đã được nghiên cứu bằng cách bổ sung trong sữa tách kem với 0,5 hoặc 1,0% (w / v) cô đặc whey proteinnăng suất của EPS trong các hợp chất nitơ hữu cơ cao hơn so với trong hợp chất vô cơExopolysaccharide sản xuất vi sinh vật có thể sử dụng một loạt các nguồn

nitơ, bao gồm amoni, nitrat, nitrit, và các axit amin Theo Sutherland, muối

amoni và các axit amin là phổ biến nhất Sản lượng EPS được biết là khác

nhau dựa trên các chất nền nitơ sử dụng Thay đổi các nguồn nitơ ban đầu

cũng đã được hiển thị để ảnh hưởng đến kích thước phân tử vật liệu

exopolysaccharide hình thành

2.5.1.3 Tỷ lệ Carbon / Nitơ

Trong khi carbon và nitơ đều cần thiết cho sự trao đổi chất của tế bào bình

thường, tỷ lệ này trong đó chúng xảy ra ảnh hưởng sản xuất

polysaccharide Nhiều nghiên cứu đã tìm thấy rằng sản xuất EPS được ưa

chuộng trong những điều kiện hạn chế nitơ (cao tỷ lệ carbon / nitrogen

(16,18, 26, 28, 29, 32, 73, 90) Dưới điều kiện nitơ-giới hạn như vậy, bất kỳ

loại đường dư thừa còn lại có thể được sử dụng đặc biệt cho tổng hợp

polysaccharide Corpe báo cáo rằng sản lượng exopolysaccharide được tối

đa khi tỷ lệ carbon để nitơ là vào thứ tự của 10: 1 Mặc dù ảnh hưởng của

các thông số môi trường vào sản xuất EPS vẫn còn được tranh cãi, tác động

của hạn chế nitơ để tối đa hoá EPS sản lượng là một trong những điều kiện

được thỏa thuận vững chắc

2.5.1.4 Các chất dinh dưỡng khác

Trong khi chất carbon và nitơ là những thành phần chính cần thiết cho sự

tăng trưởng của vi khuẩn và tổng hợp exopolysaccharide, một loạt các chất

dinh dưỡng khác cần thiết là tốt, thường là các nguyên tố vi lượng Các

dưỡng chất này bao gồm, nhưng không giới hạn, kali, magiê, canxi và

phosphate Vitamin bổ sung có thể được bổ sung vào môi trường phát triển

để bổ sung tăng trưởng và exopolysaccharide sản xuất Một số nghiên cứu

đã tìm thấy rằng hạn chế của các chất dinh dưỡng không có độ cứng

carbon, như nitơ (như đã thảo luận trước đó), phosphate, hoặc lưu huỳnh,

tăng cường sản xuất exopolysaccharide

2.5.1.5 O 2

Đối với vi khuẩn hiếu khí, oxy là điều cần thiết cho sự tăng trưởng, và tầm