kojic của nấm mốc Aspergillus oryzae
Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon trong môi trường lên men đến khả năng sinh acid kojic của Aspergillus oryzae
Mục tiêu: Đánh giá khả năng sinh acid kojic của Aspergillus oryzae trong các
môi trường lên men chứa các nguồn carbon khác nhau và lựa chọn nguồn carbon thích hợp để sản xuất acid kojic.
Tiến hành: Nhân giống Aspergillus oryzae trong bình nón 250 ml có chứa 50
ml môi trường với 4 môi trường nhân giống chứa các nguồn carbon khác nhau tại bảng
3.1 dưới đây, điều kiện hô hấp hiếu khí (tốc độ lắc 150 vòng/ phút) ở 30oC trong 2 – 3
ngày. Kết thúc thời gian nhân giống, ly tâm thu lấy sinh khối.
Lấy sinh khối từ môi trường nhân giống, lên men Aspergillus oryzae trong bình nón
250 ml có chứa 100 ml môi trường với 4 môi trường lên men AG, AS, AM, AT; điều
kiện hô hấp hiếu khí (tốc độ lắc 150 vòng/ phút) ở 30oC trong 12 ngày. Trong đó AG,
AS, AM, AT là các môi trường lên men chứa nguồn carbon khác nhau lần lượt là: glucose, saccarose, maltose và tinh bột. Các môi trường này được sử dụng để so sánh
khả năng sinh tổng hợp acid kojic từ quá trình lên men nấm mốc Aspergillus oryzae khi
thay đổi nguồn carbon trong môi trường nuôi cấy.
Kết thúc thời gian lên men, tiến hành tách chiết và tinh chế thu acid kojic, đồng thời định lượng đường trong các mẫu dịch lọc. Xác định hàm lượng đường glucose, maltose ban đầu và còn lại đối với môi trường lên men AG và AM theo phương pháp 2.3.6; xác định hàm lượng đường saccarose, tinh bột ban đầu và còn lại đối với môi trường lên men AS và AT theo phương pháp 2.3.7.
18
Bảng 3.1. Môi trường lên men thu acid kojic từ quá trình lên men A. oryzae với các nguồn carbon khác nhau
Thành phần Khối lượng (g/100ml) AG AS AM AT Glucose 10,0 0 0 0 Saccarose 0 10,0 0 0 Maltose 0 0 10,0 0 Tinh bột 0 0 0 10,0 Pepton 0,3 0,3 0,3 0,3 KH2PO4 0,1 0,1 0,1 0,1 MgSO4.7H2O 0,05 0,05 0,05 0,05
Nước RO Vừa đủ Vừa đủ Vừa đủ Vừa đủ
pH 5,5 5,5 5,5 5,5
Kết quả thực nghiệm và bàn luận:
Về cảm quan ban đầu, đối với hai môi trường lên men AG và AS, có thể nhận thấy dịch lên men trong, hạt sinh khối trắng, hình cầu tương đối đồng đều, trên thành bình có một vòng sinh khối mỏng. Môi trường AM có dịch lên men đục, hạt sinh khối hơi vàng, không đều, còn môi trường lên men AT có dịch lên men màu trắng sữa, hạt sinh khối sinh ra rất ít và nhỏ (hình 3.1). Như vậy, trong môi trường lên men sử dụng glucose và
saccarose, nấm mốc Aspergillus oryzae có khả năng sinh trưởng, phát triển tốt hơn môi
19
Hình 3.1. Hình ảnh sinh khối của Aspergillus oryzae với các môi trường nuôi cấy AG, AS, AM, AT sau 12 ngày lên men
Sau khi kết tinh, nhận thấy môi trường AG và AS thu được acid kojic dưới dạng tinh
thể (hình 3.2), cho phản ứng tạo màu đỏ đặc trưng khi định tính bằng FeCl3 (hình 3.3),
còn môi trường AM và AT sau khi chiết không thu được sản phẩm.
(a) (b)
Hình 3.2. Hình ảnh acid kojic kết tinh từ dịch lên men của A. oryzae trong môi trường nuôi cấy AG (a) và AS (b)
20
Hình 3.3. Hình ảnh phản ứng của acid kojic (hòa tan trong ethanol) với sắt (III) clorid 3%
Lượng acid kojic thu được trong môi trường lên men sử dụng glucose làm nguồn carbon là lớn nhất (0,48 g), hơn khoảng 1,5 lần môi trường trường lên men sử dụng saccarose (0,33 g) (bảng 3.2).
Bảng 3.2. Khả năng sinh acid kojic của Aspergillus oryzae khi thay đổi nguồn carbon trong môi trường lên men
Môi trường lên men
Lượng acid kojic thu được
(g)
Lượng đường tiêu thụ (g)
Tỉ lệ đường tiêu thụ (%)
Hiệu suất sinh acid kojic (%)
AG 0,48 6,94 78,68 6,92
AS 0,33 6,46 69,99 5,11
AM 0 2,63 28,71 0
AT 0 0,69 7,26 0
Khi so sánh hiệu suất sinh acid kojic (tính theo lượng đường tiêu thụ) giữa các môi trường (hình 3.4), kết quả cũng cho thấy rằng môi trường lên men sử dụng glucose cho hiệu suất cao nhất (6,92%), hơn khoảng 1,4 lần môi trường lên men sử dụng saccarose (5,11%). Với môi trường lên men sử dụng maltose và tinh bột, hiệu suất sinh acid kojic bằng 0. Điều này thể hiện rằng các môi trường lên men sử dụng maltose và tinh bột không phù hợp cho mục đích sinh tổng hợp acid kojic. Môi trường lên men dùng glucose làm nguồn carbon là môi trường lên men phù hợp nhất cho mục đích sinh tổng hợp acid
21
kojic, sau đó đến môi trường lên men sử dụng saccarose. Nguyên nhân có thể do glucose có cấu trúc tương tự như acid kojic và trong thời gian lên men, acid kojic được hình thành trực tiếp từ glucose mà không có sự phân tách chuỗi carbon thành các mảnh nhỏ hơn [40]. Tại nguồn carbon là saccarose thì lượng acid kojic thu được ít hơn, điều này có thể do saccarose phải trải qua quá trình phân cắt đường đôi thành đường đơn nhờ các
các enzym sinh ra từ Aspergillus oryzae, rồi sau đó mới được chuyển thành acid kojic.
Ở môi trường sử dụng maltose và tinh bột làm nguồn carbon không thu được acid kojic
có thể do Aspergillus oryzae không có các enzym để phân cắt liên kết glycosid trong
phân tử maltose và tinh bột.
Hình 3.4. Biểu đồ so sánh hiệu suất sinh acid kojic của Aspergillus oryzae khi thay đổi nguồn carbon trong môi trường
Ngoài ra, các số liệu về lượng đường tiêu thụ cho thấy môi trường lên men sử dụng glucose và saccarose có lượng đường tiêu thụ lần lượt là 6,94 g và 6,46 g, nhiều hơn đáng kể so với môi trường lên men sử dụng maltose và tinh bột (2,63 g và 0,69 g). Khi so sánh tỉ lệ đường tiêu thụ giữa các môi trường (hình 3.5), kết quả cũng cho thấy môi trường lên men sử dụng glucose có tỉ lệ đường tiêu thụ đạt giá trị cao nhất (78,68%),
6,92 5,11 0 0 0 2 4 6 8 10 AG AS AM AT Hiệu suất sinh acid kojic
(%)
22
nhiều hơn 1,12 lần so với môi trường lên men sử dụng saccarose (69,99%); nhiều hơn 2,74 lần so với môi trường lên men sử dụng maltose (28,71%). Môi trường lên men sử dụng tinh bột thì tỉ lệ đường tiêu thụ hầu như không đáng kể (7,26%). Do đó, có thể nhận thấy rằng kết quả về lượng đường tiêu thụ và tỉ lệ đường tiêu thụ cũng phù hợp với
kết quả lượng acid kojic và sinh khối thu được từ quá trình lên men Asperigillus oryzae
trong các môi trường chứa các nguồn carbon khác nhau.
Hình 3.5. Biểu đồ so sánh tỉ lệ đường tiêu thụ của Aspergillus oryzae khi thay đổi nguồn carbon trong môi trường lên men
Hassan và cộng sự đã công bố glucose 10% là nguồn carbon tối ưu cho quá trình lên
men chủng Aspergillus oryzae var. effusus NRC14 để sản xuất acid kojic với lượng acid
kojic thu được là 49,0 g/l, tiếp theo là saccarose 10% (38,0 g/l), với nguồn carbon là maltose 10% thì lại không sinh ra acid kojic [24]. Theo Kitada và cộng sự, sự tổng hợp
acid kojic từ quá trình lên men chủng Aspergillus oryzae tốt nhất khi sử dụng nguồn
carbon là glucose 10%, theo sau là saccarose 10%; tuy nhiên với môi trường lên men sử dụng tinh bột 3% là nguồn carbon thì không thu được acid kojic [30]. Ở Việt Nam, nhóm tác giả Trương Phương đã tiến hành lựa chọn điều kiện lên men phù hợp cho quá trình
78,68 69,99 28,71 7,26 0 20 40 60 80 100 AG AS AM AT Tỉ lệ đường tiêu thụ (%)
23
sinh tổng hợp acid kojic từ lên men chủng Aspergillus oryzae 4F là glucose với nồng độ
10% [7]. Trong đề tài “Khảo sát khả năng sinh acid kojic của nấm mốc Aspergillus
oryzae” của dược sĩ Nguyễn Thị Huyền, tác giả cũng đã khảo sát nồng độ glucose thích
hợp nhất cho quá trình lên men Aspergillus oryzae để sản xuất acid kojic là 10% [3].
Như vậy kết quả của đề tài phù hợp với kết quả của một số nghiên cứu trước đó.
Sau quá trình thực nghiệm, đề tài đã lựa chọn được nguồn carbon thích hợp cho quá
trình lên men sinh acid kojic của Aspergillus oryzae là glucose.
Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ trong môi trường lên men đến khả năng sinh acid kojic của Aspergillus oryzae
Mục tiêu: Đánh giá khả năng sinh acid kojic của Aspergillus oryzae trong các
môi trường lên men chứa các nguồn nitơ khác nhau và lựa chọn nguồn nitơ thích hợp để sản xuất acid kojic.
Tiến hành: Nhân giống Aspergillus oryzae trong bình nón 250 ml có chứa 50
ml môi trường với 4 môi trường nhân giống chứa các nguồn nitơ khác nhau tại bảng 3.3
dưới đây, điều kiện hô hấp hiếu khí (tốc độ lắc 150 vòng/ phút) ở 30oC trong 2 – 3 ngày.
Kết thúc thời gian nhân giống, ly tâm thu lấy sinh khối.
Lấy sinh khối từ môi trường nhân giống, lên men Aspergillus oryzae trong bình nón
250 ml có chứa 100 ml môi trường với 4 môi trường lên men khác nhau GP, GC, GN,
GNC; điều kiện hô hấp hiếu khí (tốc độ lắc 150 vòng/ phút) ở 30oC trong 12 ngày. Trong
đó GP, GC, GN, GNC là các môi trường lên men chứa nguồn nitơ khác nhau lần lượt
là: pepton, cao nấm men, (NH4)2SO4 và (NH4)2SO4 kết hợp vs cao nấm men theo tỉ lệ
2:1. Các môi trường này được sử dụng để so sánh khả năng sinh tổng hợp acid kojic từ
quá trình lên men nấm mốc Aspergillus oryzae khi thay đổi nguồn nitơ trong môi trường
nuôi cấy.
Kết thúc thời gian lên men, tiến hành tách chiết và tinh chế thu acid kojic, đồng thời định lượng glucose trong các mẫu dịch lọc theo phương pháp 2.3.6.
24
Bảng 3.3. Môi trường lên men thu acid kojic từ quá trình lên men A. oryzae với các nguồn nitơ khác nhau
Thành phần Khối lượng (g/100ml) GP GC GN GNC Glucose 10,0 10,0 10,0 10,0 Pepton 0,3 0 0 0 Cao nấm men 0 0,3 0 0 (NH4)2SO4 0 0 0,3 0 (NH4)2SO4 + CNM (tỉ lệ 2:1) 0 0 0 0,3 KH2PO4 0,1 0,1 0,1 0,1 MgSO4.7H2O 0,05 0,05 0,05 0,05
Nước RO Vừa đủ Vừa đủ Vừa đủ Vừa đủ
pH 5,5 5,5 5,5 5,5
Kết quả thực nghiệm và bàn luận:
Cả 4 môi trường lên men thu được có cảm quan dịch lên men trong, hạt sinh khối trắng, hình cầu tương đối đồng đều, trên thành bình có 1 vòng sinh khối mỏng. Tuy nhiên dễ dàng nhận thấy cả môi trường GP và GC đều có số lượng hạt sinh khối nhiều hơn đáng kể so với môi trường GN và GNC (hình 3.6). Như vậy, trong môi trường lên
men sử dụng pepton và cao nấm men, nấm mốc Aspergillus oryzae có khả năng sinh
trưởng, phát triển tốt hơn môi trường sử dụng (NH4)2SO4 và (NH4)2SO4 kết hợp với cao
25
Hình 3.6. Hình ảnh sinh khối của Aspergillus oryzae với các môi trường nuôi cấy GP, GC, GN, GNC sau 12 ngày lên men
Sau khi kết tinh, nhận thấy rằng môi trường lên men GP và GC có khả năng tạo ra acid kojic (hình 3.7), còn môi trường GN và GNC sau khi chiết không thu được sản phẩm.
(a) (b)
Hình 3.7. Hình ảnh acid kojic kết tinh từ dịch lên men A. oryzae trong môi trường nuôi cấy GC (a) và GP (b)
26
Lượng acid kojic thu được trong môi trường lên men sử dụng pepton làm nguồn nitơ là lớn nhất (0,49 g), hơn khoảng 1,9 lần môi trường lên men sử dụng cao nấm men (0,26 g) (bảng 3.4).
Bảng 3.4. Khả năng sinh acid kojic của Aspergillus oryzae khi thay đổi nguồn nitơ trong môi trường lên men
Môi trường lên men
Lượng acid kojic thu được (g)
Lượng glucose tiêu thụ (g)
Tỉ lệ glucose tiêu thụ (%)
Hiệu suất sinh acid kojic (%)
GP 0,49 7,30 77,33 6,71
GC 0,26 6,24 68,12 4,16
GN 0 3,04 33,41 0
GNC 0 3,52 38,14 0
Khi so sánh hiệu suất sinh acid kojic (tính theo lượng glucose tiêu thụ) giữa các môi trường (hình 3.8), kết quả cũng cho thấy rằng môi trường lên men GP cho hiệu suất cao nhất (6,71%), hơn khoảng 1,6 lần môi trường lên men GC (4,16%). Với môi trường lên men GN và GNC, hiệu suất sinh acid kojic bằng 0. Điều này thể hiện các môi trường
lên men sử dụng (NH4)2SO4 và (NH4)2SO4 kết hợp với cao nấm men (2:1) làm nguồn
nitơ không phù hợp cho mục đích sinh tổng hợp acid kojic. Môi trường lên men sử dụng pepton làm nguồn nitơ là môi trường lên men phù hợp nhất trong mục đích sinh tổng hợp acid kojic, sau đó đến môi trường lên men dùng cao nấm men. Nguyên nhân có thể do pepton, cao nấm men có chứa các acid amin tự do và các acid amin này góp phần thúc đẩy cho sự phát triển của các enzym liên quan đến quá trình sinh tổng hợp acid kojic như: glucose-6-phosphat dehydrogenase, hexokinase, và gluconat dehydrogenase
[10], [11]. Hơn nữa, việc sử dụng NH4+ làm nguồn carbon có thể gây ức chế các enzym
liên quan đến quá trình sinh tổng hợp acid kojic [39]. Ngoài ra, có thể do pepton và cao nấm men có chứa các acid amin tự do khác nhau nên có sự khác biệt giữa lượng acid kojic thu được của môi trường lên men sử dụng pepton so với môi trường lên men sử dụng cao nấm men làm nguồn nitơ.
27
Hình 3.8. Biểu đồ so sánh hiệu suất sinh acid kojic của Aspergillus oryzae khi thay đổi nguồn nitơ trong môi trường
Ngoài ra, các số liệu về lượng glucose tiêu thụ cho thấy môi trường lên men sử dụng pepton và cao nấm men có lượng glucose tiêu thụ lần lượt là 7,30 g và 6,24 g, nhiều hơn
đáng kể so với môi trường sử dụng (NH4)2SO4 và (NH4)2SO4 kết hợp với cao nấm men
(2:1) (3,04 g và 3,52 g). Khi so sánh tỉ lệ glucose tiêu thụ giữa các môi trường (hình 3.9), kết quả cũng cho thấy môi trường lên men sử dụng pepton có tỉ lệ glucose tiêu thụ đạt giá trị cao nhất (77,33%), nhiều hơn 1,14 lần so với môi trường lên men sử dụng cao nấm men (68,12%); nhiều hơn khoảng 2 lần so với môi trường lên men sử dụng
(NH4)2SO4 hay (NH4)2SO4 kết hợp với cao nấm men (2:1). Do đó, có thể nhận thấy rằng
kết quả về lượng glucose tiêu thụ và tỉ lệ glucose tiêu thụ cũng phù hợp với kết quả
lượng acid kojic và sinh khối thu được từ quá trình lên men Asperigillus oryzae trong
các môi trường chứa các nguồn nitơ khác nhau. 6,71 4,16 0 0 0 2 4 6 8 10 GP GC GN GNC Hiệu suất sinh acid kojic
(%)
28
Hình 3.9. Biểu đồ so sánh tỉ lệ glucose tiêu thụ của Aspergillus oryzae khi thay đổi nguồn nitơ trong môi trường lên men
Theo Kitada và cộng sự (1967) với nghiên cứu về quá trình lên men Aspergillus
oryzae để sản xuất acid kojic, khi sử dụng cao nấm men và pepton làm nguồn nitơ thì lượng tế bào và acid kojic thu được là nhiều nhất, còn khi sử dụng các nguồn nitơ vô cơ thì sự phát triển của vi sinh vật cũng như lượng acid kojic thu được rất thấp [30]. Trong cùng nghiên cứu, tác giả cũng cho rằng pepton là nguồn nitơ thích hợp nhất cho quá
trình lên men sinh tổng hợp acid kojic. Mohamad đã báo cáo rằngmôi trường lên men
chứa 100 g/L glucose (đóng vai trò là nguồn carbon) và pepton với nồng độ 1-5 g/L hoặc cao nấm men với nồng độ 0,5-2,5 g/L (đóng vai trò là nguồn nitơ) được sử dụng nhiều nhất cho quá trình lên men sản xuất acid kojic [36]. Như vậy, kết quả đạt được của đề tài cũng phù hợp với kết quả của các nghiên cứu trước đó.
Sau quá trình thực nghiệm, đề tài đã lựa chọn được nguồn nitơ thích hợp cho quá
trình lên men sinh acid kojic của Aspergillus oryzae là pepton.
68,12 77,33 33,41 38,14 0 20 40 60 80 100 GC GP GN GNC Tỉ lệ glucose tiêu thụ (%)
29