Khảo sát hoạt tính Enzyme Amylase từ 3 chủng Trichoderma

Khảo sát hoạt tính Enzyme Amylase từ 3 chủng Trichoderma

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***OOO*** KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HOẠT TÍNH HỆ ENZYME AMYLASE TỪ CHỦNG TRICHODERMA NGÀNH HỌC: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NIÊN KHÓA: 2002-2006 SINH VIÊN THỰC HIỆN: NGUYỄN NHƢ HIẾN Thành phố Hồ Chí Minh tháng 8/2006 LỜI CẢM TẠ Em xin chân thành cảm tạ:  Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Mơn Cơng Nghệ Sinh Học, tất quý thầy cô truyền đạt kiến thức cho em suốt trình học trƣờng  Ths Vƣơng thị Việt Hoa hết lòng hƣớng dẫn, giúp đỡ em suốt thời gian thực tập tốt nghiệp  Cơ Trƣơng Phƣớc Thiên Hồng tận tình giúp đỡ em trình nhận thực đề tài  Ban Giám Đốc Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh - Trƣờng Đại Học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh  Ban chủ nhiệm, Thầy Cô khoa Công Nghệ Thực Phẩm  Các Anh Chị Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em thời gian thực tập tốt nghiệp  Các bạn bè lớp công nghệ sinh học khóa 28 chia sẻ tơi vui buồn thời gian học nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ thời gian thực tập  Các bạn bè ngồi lớp động viên, giúp đỡ tơi suốt trình học tập thực tập tốt nghiệp Sinh viên thực Nguyễn nhƣ Hiến TÓM TẮT  Đề tài “KHẢO SÁT HOẠT TÍNH HỆ ENZYME AMYLASE TỪ CHỦNG TRICHODERMA” thực sinh viên Nguyễn nhƣ Hiến, lớp DH02SHKhoa CNSH-Trƣờng Đại Học Nông Lâm dƣới hƣớng dẫn Th.s Vƣơng Thị Việt Hoa  Thời gian địa điểm: Đề tài đƣợc thực từ tháng 3/2006 đến tháng 6/2006, Tại Phòng Vi Sinh - khoa Công Nghệ Thực Phẩm - trƣờng Đại Học Nông Lâm  Đề tài đƣợc thực đối tƣợng vi nấm Trichoderm sp gồm chủng D13, D14, D16 Chúng vi nấm phân bố rộng rãi đất, có nhiều hệ enzyme (cellulase, amylase…) Do đó, tiến hành khảo sát đánh giá hoạt lực hệ enzyme amylase chủng (đƣợc cung cấp phịng thí nghiệm trƣờng Đại Học Khoa Học Tự Nhiên), để từ bổ sung vào ứng dụng: công nghệ thực phẩm, công nghệ dệt, xử lý môi trƣờng…đáng ý lĩnh vực bổ sung vào thức ăn gia súc dạng phân bón sinh học  Những kết đạt đƣợc Chọn đƣợc chủng Trichoderma có hoạt tính hệ enzyme amylase phân giải cao Khảo sát đƣợc yếu tố ảnh hƣởng đến hệ enzyme amylase tách chiết từ môi trƣờng nuôi cấy (thời gian, nhiệt độ, pH) MỤC LỤC NỘI DUNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ Tóm tắt Mục lục Danh sách hình Danh sách bảng Danh sách biểu đồ I MỞ ĐẦU II Tổng quan tài liệu 10 2.1 Giới thiệu tinh bột 10 2.2 Quá trình thuỷ phân tinh bột 10 2.3 Giới thiệu nấm Trichoderma 17 2.3.1 Phân loại-Đặc điểm hình thái 17 2.3.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá 18 III VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 19 3.1 Vật liệu 19 3.2 Phƣơng pháp 21 3.2.1 Phƣơng pháp định tính sơ định lƣợng hoạt độ enzyme amylase cách đo đƣờng kính vịng phân giải 21 3.2.2 Phƣơng pháp nuôi cấy Trichoderma tách chiết hệ enzyme amylase từ môi trƣờng nuôi cấy 22 3.2.3 Phƣơng pháp khảo sát động học hệ enzyme amylase 22 3.2.4 Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng pH đối vối enzyme amylase 23 3.2.5 Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ đối vối enzyme amylase 24 3.2.6 Phƣơng phàp xác định hoạt tính hệ enzyme amylase.( Phƣơng pháp Heinkel ) 24 IV KẾT QUẢ 28 4.1 Kết đếm số lƣợng bào tử buồng đếm hồng cầu 28 4.2 Kết định tính sơ định lƣợng hoạt độ enzyme amylase cách đo đƣờng kính vịng phân giải 29 4.3 Kết khảo sát động học enzyme amylase 31 4.4 Kết khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ enzyme amylase chủng D13 39 4.5 Kết khảo sát ảnh hƣởng pH enzyme amylase chủng D13 41 V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43 VI TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 PHỤ LỤC 45 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc bậc Enzyme Amylase 14 Hình 2.2 Quá trình thủy phân Amylose 15 Hình 2.3 Quá trình thủy phân Amylopectin Glycogen 16 Hình 2.4 Khuẩn ty quan sinh bào tử Trichoderma 18 Hình 2.5 Trichoderma harzianum KRL – AG2 phát triển môi trƣờng PGA 18 DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1 Dung dịch đệm Mc Hvaice 23 Bảng 3.2 Các dung dịch đệm pH – 6,5 23 Bảng 3.3 Bảng xác định hoạt tính enzyme amylase 26 Bảng 3.4 Nồng độ dung dịch tinh bột 26 Bảng 3.5 Các dung dịch đồ thị tiêu chuẩn 27 Bảng 4.1 Kết đếm số lƣợng bào tử buồng đếm hồng cầu 28 Bảng 4.2 Kết đo đƣờng kính vịng phân giải sau 66 29 Bảng 4.3 Kết đo đƣờng kính vịng phân giải sau 84 30 Bảng 4.4 Kết đo OD đồ thị tiêu chuẩn 31 Bảng 4.5 Hoạt độ Enzyme Amylase chủng D13 theo thời gian nuôi cấy 32 Bảng 4.6 Hoạt độ Enzyme Amylase chủng D14 theo thời gian nuôi cấy 34 Bảng 4.7 Hoạt độ Enzyme Amylase chủng D16 theo thời gian nuôi cấy 36 Bảng 4.8 Ảnh hƣởng nhiệt độ Enzyme Amylase chủng D13 39 Bảng 4.9 Ảnh hƣởng pH Enzyme Amylase chủng D13 41 DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ Đồ thị 4.1 Kết đo đƣờng kính vịng phân giải sau 66 29 Đồ thị 4.2 Kết đo đƣờng kính vịng phân giải sau 84 30 Đồ thị 4.3 Đƣờng chuẩn 31 Đồ thị 4.4 Hoạt độ Enzyme Amylase chủng D13 theo thời gian nuôi cấy 33 Đồ thị 4.5 Hoạt độ Enzyme Amylase chủng D14 theo thời gian nuôi cấy 35 Đồ thị 4.6 Hoạt độ Enzyme Amylase chủng D16 theo thời gian nuôi cấy 37 Đồ thị 4.7 Hoạt độ Enzyme Amylase chủng D13, D14, D16 38 Đồ thị 4.8 Ảnh hƣởng nhiệt độ Enzyme Amylase chủng D13 40 Đồ thị 4.9 Ảnh hƣởng pH Enzyme Amylase chủng D13 42 PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Do áp lực kinh tế, việc tận dụng hiệu nguồn thức ăn có hàm lƣợng dinh dƣỡng thấp cho gia cầm ngày gia tăng Mặt khác, quy định sản xuất thức ăn gia súc khơng cho phép sử dụng hố chất hay thuốc khích thích nhằm tăng trƣởng gia súc, nâng cao suất vật nuôi Một phƣơng pháp phổ biến đƣợc khuyến khích sử dụng rộng rãi để giải vấn đề bổ sung hệ enzyme thủy phân vào thức ăn gia súc nhằm tăng cƣờng tiêu hoá hấp thu chất dinh dƣỡng khó tiêu, loại bỏ nhân tố kháng dinh dƣỡng Một nguồn enzyme đáng ý hệ enzyme từ vi nấm Trichoderma sp vi nấm có nguồn enzyme phong phú, có hoạt lực mạnh đƣợc sử dụng nhiều mục đích khác nhau, chúng đƣợc ứng dụng lĩnh vực nhƣ: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dệt, xử lý môi trƣờng… đáng ý lĩnh vực bổ sung vào thức ăn gia súc dạng phân bón sinh học Enzyme amylase enzym thủy phân tinh bột thông qua việc xúc tác thủy giải liên kết glucosid tinh bột Enzyme amylase đƣợc nghiên cứu khảo sát cách có hệ thống đặc điểm đƣợc phân lập tách chiết từ nhiều nguồn khác nhƣ: từ thực vật ( từ mầm mạch, mầm đậu tƣơng …), từ vi sinh vật (vi khuẩn Bacillus subtilis, nấm Aspegillus oryzae …) Góp phần vào định hƣớng nêu trên, đƣợc ủng hộ Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học khoa Công Nghệ Thực Phẩm tiến hành thực đề tài: “Khảo sát hoạt tính hệ enzyme amylase từ chủng nấm Trichoderma sp” 1.2 MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI Chọn chủng Trichoderma sp có hoạt tính hệ enzym amylase phân giải cao Khảo sát hoạt tính hệ enzym amylase tách chiết từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma 10 PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu tinh bột Tinh bột sản phẩm quang hợp thực vật, chất dự trữ quan trọng tích lũy cũ, quả, hạt( lúa: 60-80%; ngơ: 65-75%; khoai tây: 12-20% …) Trong thực vật tinh bột tồn dƣới dạng hạt tinh bột, đƣờng kính 0,002-0,15 mm Các loại thực vật khác chứa hạt tinh bột có hình dạng kích thƣớc khác Tinh bột đƣợc tổng hợp thực vật gồm thành phần chủ yếu:  Amylose - polysaccharide tan nƣớc, cho phản ứng màu xanh với Iod Amylose có cấu tạo hố học chuỗi dài khơng phân nhánh gốc α – D - glucopyranose nối với lien kết α -1,4 glycoside Phân tử Amylose có trọng lƣợng khoảng 20000 - 50000, có dạng hình xoắn vòng chứa phân tử glucose  Amylopectin polymer mạch nhánh chứa đơn vị đƣờng đơn nối với lien kết α -1,4 glycoside α -1,6 glycoside Amylopectin cho màu tím đỏ với Iod Trọng lƣợng phân tử thƣờng vài triệu Đa số dạng tinh bột chứa từ 15 - 25% Amylose 75 - 85% Amylopectin 2.2 Quá trình thủy phân tinh bột 2.2.1 Giới thiệu enzyme Enzyme chất xúc tác sinh học, có chất protein Nó cho phép phản ứng cần thiết cho sống sinh sản tế bào diễn với tốc độ cao với tính chất đặc thù khơng tạo sản phẩm phụ nhƣ phản ứng thơng thƣờng Enzyme có tế bào sinh vật, không xúc tác cho phản ứng thể sống mà xúc tác cho phản ứng ngồi tế bào( invitro) a) Tính chất hóa - lý enzyme có chất protein nên chúng có tính chất nhƣ protein  Khi hòa tan nƣớc, enzyme cho dung dịch keo với tính chất đặc trƣng nhƣ khuếch tán kém, áp suất thẩn thấu thấp, độ nhớt cao…  Enzyme có tính lƣỡng cực ... ? ?Khảo sát hoạt tính hệ enzyme amylase từ chủng nấm Trichoderma sp” 1.2 MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI Chọn chủng Trichoderma sp có hoạt tính hệ enzym amylase phân giải cao Khảo sát hoạt tính hệ enzym amylase. .. 31 Đồ thị 4.4 Hoạt độ Enzyme Amylase chủng D 13 theo thời gian nuôi cấy 33 Đồ thị 4.5 Hoạt độ Enzyme Amylase chủng D14 theo thời gian nuôi cấy 35 Đồ thị 4.6 Hoạt độ Enzyme Amylase chủng. .. hệ enzyme amylase từ môi trƣờng nuôi cấy 22 3. 2 .3 Phƣơng pháp khảo sát động học hệ enzyme amylase 22 3. 2.4 Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng pH đối vối enzyme amylase 23 3.2.5