Khảo sát hoạt tính enzyme protease trích ly từ aspergillus oryzae trên môi trường rắn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG LUẬN VĂN TÓT NGHIỆP Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THựC PHẨM KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME PROTEASE TRÍCH LY T ASPERGILLUSORYZAE TRÊN MÔI TRƯỜNG RẮN Sinh viên thưc hiên Giáo viên hướng Huỳnh Thị Phương Thảo MSSV: LT10039 Lớp: CNTP dân TS Nguyễn NĂM Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học cần Thơ Luận văn đính kèm theo đây, với đề tựa “KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME PROTEASE TRÍCH LY TỪ ASPERGILLUS ORYZAE TRÊN MÔI TRƯỜNG RẮN”, “HUỲNH THỊ PHƯƠNG THẢO” thực báo cáo, hội đồng chấm luận văn thông qua Giáo viên hướng dẫn Giáo viên phản biện TS NGUYỄN CÔNG HÀ Giáo viên phản biện Cần Tho, ngày tháng năm Chủ tịch hội đồng Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học cần Thơ LỜI CẢM ƠN Qua ba học kì học tập trường Đại học cần Thơ em quý thầy cô trường Đại học cần Thơ, đặc biệt thầy cô môn Công nghệ Thực phẩm - Khoa Nông nghiệp Sinh học ứng dụng tạo điều kiện thuận lợi truyền thụ kiến thức quỷ báu, tạo sở khoa học vững cho em suốt thời gian học tập Sau hoàn thành chương trình học trường, em thầy Nguyễn Công Hà tận tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho em trình thực luận văn tốt nghiệp Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học trường Đại học cần Thơ cung cấp nguồn nấm mốc cho em thực đề tài Đặc biệt cảm ơn thầy Nguyễn Văn Thành nhiệt tình giúp đỡ em Em xin chân thành cảm ơn! Cần Thơ, ngày 15 tháng năm 2012 Sinh viện thực HUỲNH THỊ PHƯƠNG THẢO Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học cần Thơ TÓM TẮT Protease enzyme sử dụng nhiều số ngành sản xuất chế biến thực phâm, sản xuất chất tây rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp giả thành chế pham enzyme thương mại cao Vì đề tài thực với mục đích dùng nấm mốc đê làm dồi nguồn enzyme giảm giá thành chế pham enzyme thương mại Quả trình nghiên cứu tiến hành xác định động học enzyme nhằm phục vụ cho nhũng nghiên cứu ứng dụng vào sản xuất thực phâm Sau dựa vào nguồn enzyme ứng dụng vào việc thuỷphân da cá tra đê sản xuất collagen Kêt nghiên cứu đề tài cho thấy có thê tiến hành thu enzyme có hoạt tính cao thành phần môi trường thích họp đê tạo enzyme protease thuỷ phân môi tmòng acid 70% cám : 25% trấu : 5% gelatin pH môi trường Đong thời có tương tác pH nhiệt độ xử lý lên hoạt tính hệ enzyme protease dịch chiết Enzyme thê hoạt tính toi ưu nhiệt độ 45°c pH = 5,5 Động học enzyme protease có Vmax = 1,2548pmol/phút Km = 0,3932% Khả thuỷ phân enzyme protease dịch acid protein ứng với thời gian thuỷ phân 50 phút với thê tích dung dịch enzyme lml, pH dung dịch 3,2 nhiệt độ thuỷphân 45°c Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 MỤC LỤC Trường Đại học cần Thơ Luận văn tôt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học cần Thơ DANH SÁCH BẢNG DANH SÁCH HÌNH CHƯƠNG ĐẶT VÁN ĐÈ 1.1 ĐẶT VẤN ĐÊ Ngày nay, với phát triển mạnh mẽ Công nghệ Sinh học, chế phẩm enzyme Luận văn sản tốt xuất ngày Đại cànghọc nhiều sử dụngTrường hầu Đại học cần Thơ nghiệp nămvà 2012 hết lĩnh vực như: chế biến thực phấm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế Đặc biệt ngành thực phấm, ứng dụng kỳ thuật sinh học tạo nên tiến đáng kinh ngạc việc sản xuất sản phấm gia tăng hiệu suất sản phẩm truyền thống Hàng năm lượng enzyme sản xuất giới đạt 300.000 với giá trị 500 triệu USD phân phối lĩnh vực khác Công nghệ sản xuất enzyme đem lại lợi nhuận to lớn cho Việt Nam ứng dụng enzyme đế hỗ trợ cho trình sản xuất chế biến thực phâm trở nên phổ biến quen thuộc Bản chất enzyme chat protein Chúng tạo tế bào sống (thực vật, động vật vi sinh vật) chất xúc tác cho phản ứng sinh học Chức enzyme hoạt động sống xúc tác hình thành cắt đứt liên kết hóa học Do có ưu nhiều mặt nên vi sinh vật trở thành nguồn thu enzyme chủ đạo Tùy theo mục đích sử dụng mà người ta sản xuất nhiều dạng chế phâm enzyme khác enzyme thô, enzyme bán tinh khiết enzyme tinh khiết Sản xuất enzyme từ vi sinh vật so với từ thực vật động vật có nhiều ưu điếm như: - Tốc độ sản sinh vi sinh vật mạnh - Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính cao - Vi sinh vật thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp - Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme rẻ tiền dễ kiếm - Vi sinh vật sinh tổng hợp lúc nhiều loại enzyme khác Protease enzyme sử dụng nhiều số ngành sản xuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm phomat, làm mềm thịt ), sản xuất chất tây rửa, công nghiệp thuộc da, y tế, nông nghiệp Việc gia tăng sử dụng vi sinh vật nguồn cung cap protease cải thiện đáng kể hiệu sản xuất sản phẩm tạo nhiều Tuy nhiên giá thành chế phẩm enzyme cao, hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzyme công nghiệp đời sống Với thuận lợi cần thiết enzyme, đề tài thực khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp enzyme protease từ Aspergillus oryzcte môi trường rắn Bởi ứng dụng ngày rộng rãi protease việc sản xuất enzyme góp phần đưa công nghệ enzyme ngày phát triển, góp phần hạ giá thành chế phẩm enzyme tạo Luậnenzyme văn tốt nghiệpthực Đạitế, học 2012 điều kiện mở rộng sản xuất cảinăm thiện quy trìnhTrường sản Đại học cần Thơ xuất, cải thiện điều kiện lao động nâng cao chất lượng sản phẩm 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN cứu Đe tài nghiên cứu nhằm khảo sát hoạt tính enzyme protease trích ly từ Aspergillus oryzcie môi trường rắn với mục tiêu sau: - Ánh hưởng thành phần môi trường pH môi trường khác đến trình sinh tổng họp enzyme protease - Ánh hưởng nhiệt độ pH lên hoạt tính xúc tác phản ứng thuỷ phân enzyme protease Ánh hưởng nồng độ chất lên hoạt tính xúc tác phản ứng thuỷ phân enzyme protease - - protein Khảo sát khả thuỷ phân enzyme protease dung dịch acid CHƯƠNG LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU Enzyme protease phân bố thực vật, động vật, vi sinh vật Tuy nhiên nguồn enzyme vi sinh vật phong phú nhất, có hầu hết vi sinh vật vi khuẩn, nấm mốc xạ khuẩn Có thể nói vi sinh vật nguồn nguyên liệu thích hợp đế sản xuất enzyme quy mô lớn dùng công nghiệp đời sống 2.1 Sơ LƯỢC VỀ ENZYME PROTEASE 2.1.1 Giói thiệu Protease enzyme thuộc nhóm hydrolase xúc tác cho trình thủy phân liên kết peptid (-CO-NH-) phân tử protein, polypeptid đến sản phẩm cuối acid amin Ngoài ra, nhiều protease có khả thủy phân liên kết este vận chuyên acid amin Proteases H VN — CH U-Ỉ2 CO- NH- ÇH- co - NH- CHCOOH ° I Ienzyme protease thủyIAmino Hình 1: Mô hình phân phân tử protein Polypept Ri R2 RX Acid Protease cần thiết cho sinh vật sống, đa dạng chức từ mức độ tếHVNbào, cơCHquanCOOH đến the nên phân bố rộng rãi nhiều đối +H N- CH- CO NHCHCOOH I ‘ Ị I đến thực vật (đu đủ, tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm mốc xạ khuẩn) R| R-> Rx dứa ) động vật (gan, dày bê ) So với protease động vật thực vật, protease vi sinh vật có đặc điểm khác biệt Trước hết hệ protease vi sinh vật hệ thống phức tạp bao gồm nhiều enzyme giống cấu trúc, khối lượng hình dạng phân tử nên khó tách dạng tinh đồng Hầu hết protease phân cat protein liên kết đặc hiệu, sử dụng enzyme theo chiều phản ứng tổng hợp để tống hợp liên kết peptid định trước Yeu tố tăng cường trình tổng hợp bao gồm pH, nhóm carboxyl nhóm amin lựa chọn đế bảo vệ khả kết tủa sản phấm Protein Bảng 10: Hàm lượng tyrosine sau trình thuỷ phân Thò'i gian thuỷ phân (phút) Tyrosine (pmol/phút) 0,698d 10 0,784c 20 2012 Trường Đại học cần Thơ 30 Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 0,912b 40 0,966b 50 049a 053a 60 Kêt thê hàm lưọng protein theo đơn vị (mg/ml) Các chữ khác cột biểu thị khác biệt có V nghĩa mặt thống kê độ tin cậv 95% Lượng tyrosine sinh trình thuỷ phân nghiệm thức khác biệt có ý nghĩa độ tin cậy 95% Nghiệm thức F5 F6 khác biệt so với nghiệm thức Fl, F2, F3, F4 độ tin cậy 95% có hàm lượng tyrosine sinh cao trình thuỷ phân Nhưng nghiệm thức F3 F4 khác biệt ý nghĩa Nghiệm thức F1 có hàm lượng tyrosine thấp Từ bảng 10 hình 29 cho thấy thời gian thuỷ phân dài hàm lượng tyrosine sinh nhiều, lượng tyrosine sinh tỷ lệ thuận với thời gian thuỷ phân Khi tăng thời gian thuỷ phân từ 10 -ỉ- 40 phút lượng tyrosine tăng lên cách nhanh chóng, thời gian thuỷ phân từ 40 -ỉ- 60 phút lượng tyrosine tăng tăng chậm thời gian đầu trình thuỷ phân Do trình xử lý nhiệt môi trường ẩm, sợi collagen bị co ngắn lại Có thể thấy thí nghiệm hàm lượng tyrosine sinh cao thời gian thuỷ phân 60 phút (l,049pmol/phút) Như vậy, đế tiết kiệm chi phí cho trình thuỷ phân ta chọn thời gian thuỷ phân thích hợp 50 phút CHƯƠNG KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 5.1 KÉT LUẬN Chế phẩm enzyme protease thu sau nuôi cấy chế phẩm dạng thô Trong trình nuôi cay Aspergillus oryzae đế thu chế phẩm protease, điều kiện nuôi cấy không thích hợp cho phát triển nấm mốc làm giảm khả tổng họp hoạt tính enzyme protease hay kéo dài thời gian nuôi cấy làm giảm năngLuận suất sản Qua thời khảo2012 sát, kết choTrường thấy Đại học cần Thơ văn xuất tốt nghiệp Đại gian học năm đế nuôi cay Aspergillus oryzae sản xuất enzyme protease đạt hoạt tính tổng cao điều kiện môi trường bao gồm: - Thành phần môi trường gồm 70% cám : 25% trấu : 5% gelatin bố sung làm co chất cảm ứng, sau trùng tiến hành cấy giống Aspergillus oryzae vào nuôi thòi gian 42 giò, điều kiện độ ẩm 55%, pH = 5, nhiệt độ nuôi cấy 30°c - Có tương tác qua lại pH nhiệt độ môi trường xử lý lên hoạt tính hệ enzyme protease dịch chiết Hệ enzyme protease thể hoạt tính cao khoảng pH dung dịch đệm -T 5,5 với nhiệt độ 45°c - Hệ enzyme protease khảo sát với chất casein điều kiện tối thích (nhiệt độ 45°c pH = 5,5) enzyme cho hoạt tính cao nồng độ casein 0,8%, vmax = l,2548pmol/phút Km = 0,3932% - Enzyme protease khả thuỷ phân dung dịch acid protein tot thời gian 50 phút với lml dung dịch enzyme nhiệt độ thuỷ phân 45 °c 5.2 KIẾN NGHỊ Do thời gian nghiên cứu ngắn nên chế phẩm enzyme thu chế phẩm thô, chưa có điều kiện úng dụng vào thực tế Những nghiên cứu đề nghị sau: - Khảo sát mật số nấm mốc thời gian nuôi cấy ảnh hưởng đến trình sinh tổng họp enzyme protease - Nghiên cứu sinh tống hợp enzyme nguồn vật liệu khác như: cám ngô, cám mì, bã củ cải, bột đậu nành - khác Nghiên cúư sản xuất enzyme protease từ vi khuấn nấm mốc khác Khảo sát khả thuỷ phân ezyme nồng độ enzyme TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi Thị Quỳnh Hoa 2010 Bài giảng Vi sinh Thực phẩm, khoa Nông nghiệp Sinh học ứng dụng, trường Đại học cần Thơ Lê Ngọc Tú cộng 1998 Hóa sinh học công nghiệp Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Lê Ngọc Tú cộng 2003 Hoá học Thực phẩm Nhà xuất Khoa học Kỳ thuật Hà Nội Lương Đức Phẩm 2004 Công nghệ vi sinh vật Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học cần Thơ Nguyễn Công Hà 2010 Giáo trình kỹ thuật thực phẩm III, Khoa Nông Nghiệp Sinh học ứng dụng, Trường Đại học cần Thơ Nguyễn Đức Lượng 2002 Công nghệ vi sinh tập Vi sinh vật học công nghiệp Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Lượng 2004 Công nghệ enzyme Đại học quốc gia Thành Hồ Chí Minh Nguyễn Văn Mùi 2001 Thực hành hoá sinh học Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Tiếng Anh Bradford, M.M., 1976 A rapid and sensitive mocrogram quantities of protein utilizing the priciple of protein dye biding Anal Biochem 72, 248 - 254 Brown, J R (1975), Structure of Bovine Serum Albumin Fed Proc 34; 591 591 Jarun Chutmanop, Sinsupha Chuichulcherm, Yusuf Chisti and Penjit Srinophakun 2008 Protease production by Aspergillus oryzae in solid-state fermentation using agroindustrial substrates Journal of Chemical Technology and Biotechnology 83:1012-1018 Kunitz M., 1947 Determination of proteolytic activity by the casein digestion method J Gen Physiol 30, 291 Prabjeet Singh, Soottawat Benjakul, Sajid Maqsood and Hideki Kishimura 2011 Isolation and characterisation of collagen extracted from the skin of striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus) Food Chemical 124 Một số địa chi’ website http://baigiang.violet.vn/present/same/entry id/3232177 http://www.casein.com/products.htm PHỤ LỤC 1: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 1.1 XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME BẰNG PHƯƠNG PHÁP KUNITZ (Nguồn: Kunitz (1947), cỉtied by Fernander et al, 2003) 1.1.1 Nguyên tắc Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học cần Thơ Phương pháp đo hoạt tính dựa vào phản ứng thủy phân chat protein (casein) enzyme có dung dịch Phản úng thủy phân kết thúc thời điểm định bang trichloroacetic acid (TCA) Sản phẩm tạo thành xác định dựa vào độ hấp thụ ánh sáng sản phẩm acid am in sinh (chủ yếu tyrosine) đo bước sóng 280nm Đơn vị hoạt tính enzyme protease qua đơn vị tyrosine (TU: tyrosine unit) ITU lượng sản phẩm sinh tương đương với số ỊLimol tyrosine thuỷ phân casein enzyme có lml dung dịch thời gian phút điều kiện nhiệt độ pH môi trường định Hoạt tính riêng enzyme: số đơn vị hoạt tính có lmg protein (TU/mg) Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị hóa chất Dung dịch đệm Mcllvain: cân 35,85g Na 2HP04.12H20 hòa tan 500ml nước cất; cân 5,525g acid citric hòa tan 250ml nước cất Trộn 88,25ml acid với 41 l,75ml muối điều chỉnh pH = 1.1.2 1.1.2.1 HC1 0,2N Chất hoạt hóa cysteine 0,02M: cân 0,242g cysteine hòa tan với 100ml Dung dịch trichloroacetic acid (TCA) 15%: cân 15g TCA hòa tan với nước cất, sau dùng nước cất định mức đến lOOml Casein ỉ %: hòa tan lg casein với 100ml dung dịch đệm Mcllvain, pH = Dung dịch đun cách thủy nhiệt độ 95°c khoảng hòa tan hoàn toàn Sau bảo quản 4°c và trước sử dụng phải ủ ấm dung dịch 37°c khoảng 30 phút Các bước tiến hành Tiến hành hai mẫu thí nghiệm song song, có mẫu đối chứng Các bước thực theo sơ đồ sau: 1.1.2.2 Mẩu đối chứng Mẩu Đơn vị hoạt tính enzyme lml dung dịch enzyme tính theo 200pl cysteine 0,02M 200pl cysteine 0,02M công thức sau: 700pl đệm Mcllvain pH 700|Lil đệm Mcllvain v = =7 x* * Luận văn tốt nghiệp Đại học nămpH 2012 Trường Đại học cần Thơ T T x V e x I0'3 i Trong đó: ủ 37°c, 20 phút ủ 37°c, 20 phút TU:ihoạt tính enzyme (TU/ml) I Bổ sung 3000pl TCA 15% BỔ sung 3000pl casein X: nồng độ tyrosine (pmol/ml) 1% ị : thể37°c tích tổng dung dịch phản ứng (4ml) ị Lắc ủ 10vhhphút, Lắc Ü 10 phút, 37°c i gian phản ứng (10 phút) T: thời Bổ sung 3000jul casein 1% ị VE: thể tích enzyme (lOOpl) k: hệ số pha Bổ sung 3000pl TCA ị 15% loãng Ổn định 4°c, 10 phút Nồng độ tyrosine (X) công thức xác định ị dựa vào đường ị Ón định 4°c, 10 chuẩn Tyrosine Lọc phút - Xây dựng đường chuẩn Tyrosine ^ ịđược pha dung dịch HC1 0,2N ị Tyrosine Đo độ hấp thụ 280nm Lọc 1.1.2.3 Tính toán kết ị Đo độ hấp thụ Chuẩn bị dãy ống nghiệm chứa dung dịch tyrosine chuẩn với nồng độ tăng dần tử 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; l,2|umol/ml Thí nghiệm lặp lại lần Lắc ống nghiệm máy Vortex Sau tiến hành đo OD Luận280nm văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học cần Thơ ống nghiệm bước sóng Tyrosi ne 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 1, (gmol/ ml) OD 0,22 0,36 0,46 0,69 0,92 1,1 1,3 0,12 (280n 24 28 m) Từ kết đo OD, ta thiết lập mối quan hệ độ hấp thụ nồng độ Tyrosine dung dịch Hình 1: đưòmg chuẩn Tyrosine 1.2 PHÂN TÍCH PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD Nguyên tắc Hàm lượng protein xác định dựa phản ứng tạo màu protein có dung dịch với thuốc thử Coomassie Brilliant Blue Cường độ màu hỗn họp phản ứng bước sóng 595nm tỷ lệ thuận với hàm lượng protein phạm vi định Biết mật độ quang dung dịch protein nghiên cứu với thuốc thử Coomassie Brilliant Blue, dựa vào đường chuẩn protein tinh khiết Bovine Serum Albumin (BSA) với thuốc thử tính lượng protein mẫu nghiên cứu 1.2.1 1.2.2 Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị hoá chất Chuẩn bị thuốc thử cách hoà tan lOOmg Coomassie Brilliant Blue G- 1.2.2.1 Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học cần Thơ 250 vào 50ml ethanol (96%, v/v) Sau thêm vào 100ml H3PO4 (85%, w/v) dẫn nước cất đến lít 1.2.2.2 Các bước tiến hành thí nghiệm Bật máy Spectrophotometer cho khởi động 10 phút Dùng micropippet lấy xác 20|il mẫu cho vào cuvette nhựa loại lml Thêm vào lml thuốc nhuộm màu, trộn ủ nhiệt độ phòng thời gian 15 phút Đo độ hấp thụ bước sóng 595nm Đối chiếu với đường chuân ta xác định hàm lượng protein có mẫu - Xây dựng đường chuẩn protein Chuẩn bị dãy ống nghiệm chứa dung dịch BSA chuẩn với nồng độ tăng dần từ 0,03; 0,12; 0,18; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 lmg/ml Tiến hành xác định hàm lượng protein dung dịch nói phương pháp Bradford Thí nghiệm lặp lại lần Ghi nhận giá trị OD dung dịch nói bước sóng 595nm BSA OD 0,03 0,030 0,12 0,101 0,123 0,18 0,3 0,180 0,4 0,279 0,5 0,6 0,374 0,454 0,7 0,8 0,528 0,588 0,9 0,631 0,700 Từ kết đo OD, ta thiết lập mối quan hệ độ hấp thụ nồng độ BSA dung dịch Nồng độ BSA Hình 2: đường chuẩn PHỤ LỤC 2: KÉT QUẢ THỐNG KÊ Thí nghiệm 1.1 Hoạt tính protease (TU/ml) c 1n 12- Analysis Summary Dependent variable: Hoat Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học cần Thơ tinh protease Factors: Thanh phan MT pH Selection variable: Thanh phan MT Number of complete cases: 72 Analysis of Variance for HT Protease - Type III Sums of Squares Mean FPSum of Source Df Squar Rati Valu Squares e o e MAIN EFFECTS A:TP moi 1.01135 0.505 109 0.00 truong 674 15 00 B: pH 1.28398 0.427 92.3 0.00 995 00 INTERACTION S AB 0.691756 0.115 24.8 0.00 293 00 0.004 RESIDUAL 0.277968 60 6328 TOTAL 3.26506 71 (CORRECTED) Multiple for HT TP Range Tests Protease mo truong Method: 95.0 percent LSD TP moi Cou LS Homogeneou truong nt Mean s Groups 24 0.6255 X 24 0.7515 X 24 0.915 X 1-2 *0.126 0.0393031 3Cont *-0.1635 0.0393031 Diffe + /3 *-0.2895 0.0393031 Multiple Range Tests for HT Protease by pH Method: 95.0 percent LSD pH Count LS Homog Groups Mean eneou 0.64266 18 X 0.64733 X 18 0.79733 X 18 0.96866 X 18 Contr Difference +/- Limits ast 3-4 *-0.154667 0.0453833 3-5 *-0.326 0.0453833 3-6 0.0453833 0.00466667 *4-5 0.0453833 0.17133 4-6 *0.15 0.0453833 *0.3213 0.0453833 33 1.2 Hoạt tính riêng (TU/mg) Analysis Summary Dependent variable: Hoat tinh rieng Factors: Thanh Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học cần Thơ phan MT pH Selection variable: Thanh phan MT Number of complete cases: 72 Analysis of Variance for HT Rieng - Type III Sums of Squares FPSum of Df Mean Source Rati Valu Squares Square o e MAIN EFFECTS A: TP moi 0.8569 0.428451 49.9 0.00 truong 02 00 B: pH 0.6074 0.202491 23.6 0.00 74 00 INTERACTION S AB 0.2857 5.56 0.00 56 0.0476259 01 0.5144 60 RESIDUAL 11 0.00857352 TOTAL 2.2645 71 (CORRECTED) Multiple f HT b T moi truong Range Tests o Rien y P r g Method: L 95.0 S LS TP moi Homogeneous truong Mean Groups 0.93 24 X 0167 1.12 24 X 362 24 1.18 X 654 Contrast Difference +/- Limits 0.05 1-2 *0.193458 3466 1-3 *-0.0629167 0.053 4668 2-3 *-0.256375 0.05 3466 Multiple f HT b p Range Tests o Rien y H r g Method: L 95.0 S LS pH Count Homogeneous Mean Groups 0.98 18 X 8556 1.02 X 18 756 X 1.07 18 X 18 1.23 X 033 Contrast Difference +/- Limits 0.06 3-4 -0.0464444 1738 0.06 3-5 *-0.202778 1738 3-6 0.039 0.061 7382 0.061 4-5 *-0.156333 7382 0.061 4-6 *0.0854444 7382 5-6 *0.241778 0.061 7382 Thí nghiệm 2: Hoạt tính protease (TU/ml) Analysis Summary Dependent variable: Hoat tinh protease Factors: Nhie t pH Selection variable: Nhiet Number of complete 180 Đại học năm 2012 Luậncases: văn tốt nghiệp Trường Đại học cần Thơ Analysis of Variance for HT Protease - Type III Sums of Squares FPSum of Mean Source Df Rati Valu Squares Square o e MAIN EFFECTS A: pH 0.171098 0.0342 4.67 0.00 197 05 B:Nhiet 38.9898 9.7474 1329 0.00 32 00 INTERACTION S AB 5.60731 0.2803 38.2 0.00 20 65 00 0.0073 RESIDUAL 1.0999 150 3264 TOTAL 45.8681 179 (CORRECTED) Multiple for HT by Range Tests Protease Nhie Homog Met 95.0 percent LSD Count LS Mean eneou Groups hod s : 0.2456 55 36 X 67 0.5116 35 36 X 67 50 36 0.899 X 40 36 1.1843 X 45 36 1.5523 X Con Differenc +/- Limits tra e st 35 *0.0398805 0.67266 35 *0.0398805 l.04067 35 *0.0398805 0.38733 35 *0.266 0.0398805 40 *-0.368 0.0398805 40 *0.2853 0.0398805 33 40 *0.9386 0.0398805 67 45 *0.6533 0.0398805 33 45 *1.3066 0.0398805 50 *0.6533 0.0398805 33 Mul Range Tests for HT Protease tip by pH Metho LSD d: perc pH 95 Coun LS Mean Homogeneous Groups t 30 0.8384 X 6.5 30 0.8512 XX 4.5 30 0.874 XX 30 0.8828 X 30 0.8904 X 5.5 30 0.9348 X Contr Difference +/- Limits ast -0.0356 0.0436869 4.5 4-5 *-0.0444 0.0436869 *-0.0964 0.0436869 5.5 4-6 *-0.052 0.043686 0.043686 - 6.5 -0.0128 0.043686 4.5 - -0.0088 *0.043686 4.5 - 5.5 0.0608 4.5 - -0.0164 0.043686 0.043686 4.5 - 6.5 0.0228 Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học cần Thơ - 5.5 *-0.052 0.043686 0.043686 5-6 -0.0076 - 6.5 0.0316 0.043686 0.043686 5.5 - *0.0444 0.043686 5.5 - 6.5 *0.0836 0.043686 - 6.5 0.0392 Multiple Regression Analysis Dependent : HT variable: Protease Standard T Parameter Estima Error Stat Pte isti Value 0.000 CONSTANT 0.880529 26.380 29.9 1.0636 0.027 39.1 0.000 Nhiet 1359 957 1.6099 7.47 0.000 pH 0.215361 57 Nhiet 0.000 0.000 do*Nhiet 0.0104 27902 37.6 0.018 0.026 pH*pH 0.0419 7176 2.23 Nhiet 0.001 0.000 do*pH 0.0257 93315 13.3 of Varia Analysis nce FSum of Df Mean PSource Rati Value Squares Square o Model 41.6009 8.32017 339.26 0.000 Residual 4.26725 174 0.0245244 Total 45.8681 179 (Corr.) R-squared = 90.6967 percent R-squared (adjusted for d.f.) = 90.4294 percent Standard Error of Est = 0.156603 Mean absolute error = 0.117593 Durbin-Watson statistic = 0.70065 Thí nghiệm 3.1 Hoạt tính protease (TU/ml) Analysis Summary Dependent variable: Hoat tinh protease Factor: Nong casein Selection variable: Nong casein Number of observations: 54 Number of levels: ANOVA Table for Hoat tinh protease by Nong casein Analysis of Variance Source Sum of D Mean FPSquares f Square Rati Value Between 0.21716 0.000 1.73729 4.14 groups Within 2.36213 0.05249 groups 17 Total 4.09941 (Corr.) Range Multiple Tests for 3HT Protease by Nong casein Method: 95.0 percent LSD Nong casein Count Mean Homogeneous Groups Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học cần Thơ 0.2 Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 3.2 Kết chương trình SAS 9.1 xác định phương trình Michaelis - Menten Trường Đại học cần Thơ data Nitoíoocmo n; input conc act; cards; proc nlin data=Nitofoocmon method=marquardt maxiter=1000; parms vmax=0.01 to 0.2 by 0.01 Km=0 to 50 by 0.01; văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học cần Thơ Model act=vmax* Luận (cone/ (conc+Km)); Output out=Nitofoocraon p=predict r=residu; run; goptions reset=all gunit=cm horigin= cm hsize=ll cm vorigin=l cm vsize=9 cm; Titlel h=0.45 f=simulate 'Do thi Michaelis-Menten-Protease'; symboll V=triangle c=black h=0.4 >none; symbol2 V=none c=black h=0.3 I=join; axisl LABEL = (F=simulate '[Nong not specified for this NOTE: (%)') An H=0.35 intercept co chat casein] order=0 was to 1.4 by 0.2 VALUE = (F=simulate H=0.35); axis2 LABEL = (a=90 F=simulate H=0.35 'Tyrosine (micromol/phut)') order=0 to 1.2 by 0.2 VALUE = (F=simulate H=0.35); proc gplot data=Nitofoocmon; plot act*conc/ frame haxis=axisl vaxis=axis2; plot2 predict*conc/ haxis=axisl vaxis=axis2 noaxis nolegend; run; Approximate Correlation Matrix vmax Km vmax 1.0000000 0.9544153 Km 0.9544153 1.0000000 Thí nghiệm 4.1 Hàm lượng protein (mg/ml) Analysis Summary Dependent variable: HL Protein Factor: TG Thuy phan Number of observations: 36 Number of levels: ANOVA Table for HL Protein by TG Thuy phan Analysis of Variance Source Sum of D Mean FPSquares f Squar Ratio Value Between 0.164 0.032 24.40 0.000 groups 361 8722 Within 0.040410 0.001 groups 34702 Total 0.204 (Corr.) 772 Multipl Te for HL by Thuy e Range st Protein TG phan s Method: LSD 95.0 TG Thuy Co Mean Homog Groups phan un eneou 0.081 50 X 6667 0.088 60 X 40 0.108 X 833 X 0.138 30 667 [...]... ml sang ịil Bố trí thí nghiệm 3.2.2.1 Thí nghiệm 1: khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường và pH môi trường đến kliủ năng sinh tổng họp enzyme protease - Mục đích: nuôi Aspergillus oryzae ở các thành phần môi trường và pH môi trường khác nhau Từ đó xác định thành phần môi trường và pH môi trường 3.2.2 - thích hợp đế nấm sợi sinh tống hợp enzyme protease mạnh nhất Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được... Chuấn bị dung dịch enzyme từ nghiệm tối ưu ở thí nghiệm 1 Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme protease trên co chất là casein Tiến hành thí nghiệm như trên, mỗi mẫu đều tiến hành xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp Kunitz (phụ lục) 3.2.2.3 Thí nghiệm 3: khảo sát ảnh hưởng nồng độ cơ chất lên hoạt tính enzyme protease - Mục đích: xác định động học của enzyme, tìm ra vmax... Thu nhận chế phẩm enzyme thô ị Đo hoạt tính enzyme Hình 19: Quy trình thí nghiệm sản xuất enzyme protease Dựa vào độ hấp thụ của mẫu đối chúng và mẫu phân tích xác định được hoạt tính enzyme và hàm lượng protein từ đó tìm ra hoạt độ riêng cao nhất, lấy sử dụng làm nguồn enzyme cho các thí nghiệm sau 3.2.22 Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ lên hoạt tỉnh của enzyme protease - Mục đích:... protease acid, protease trung tính và protease kiềm - Protease acid: loại protease này được thu nhận từ nấm mốc màu đen như: Aspergillus niger, Aspergillus axvamori, Aspergillus saitoi pH hoạt động của protease nấm mốc này là 2,5 -T 3,0 - Protease trung tính: loại này có ở rất nhiều loại nấm mốc khác nhau, chủ yếu là ớ các loại nấm mốc có màu vàng như: Aspergillus oryzae, Aspergillus flcivus, Aspergillus. .. cấy nấm sợi đê thu nhận enzyme vào khoảng 36 -r 60 giờ Phưong pháp nuôi cấy bề mặt Đe nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae sản xuất enzyme protease ta lựa chọn phương pháp nuôi cấy bề mặt với môi trường rắn Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường hay trên bề mặt vật liệu rắn, xốp, ẩm Thông thường, môi trường dạng rắn vói nguyên liệu chính... phẩm enzyme Chế phẩm này được gọi là chế phẩm enzyme thô (vì ngoài thành phần enzyme ra chúng còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường và nước có trong môi trường) Người ta thường sấy khô chế phẩm enzyme đến một độ ẩm thấp để đảm bảo cho chế phẩm enzyme thô không mất hoạt tính nhanh 2.5.5 Thu nhận chế pham enzyme protease thô Ket thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzyme. .. phát triển thành từng đám gọi là hệ sợi nấm hay khuẩn ty Hình 8: Nấm mốc Aspergillus oryzae sau khi ủ 4 ngày Hình 9: Nấm mốc Aspergillus oryzae qua kính hiổn vỉ x Điều kiện phát triển Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành bào tử: 45% Độ ấm môi trường tối ưu cho sự hình thành enzyme: 55 -7- 58% Độ ẩm không khí: 85 95% pH môi trường: 5,5 + 6,5 Nhiệt độ nuôi cấy: 27 -ỉ30°c 2.5.2 Môi trường nuôi cấy... ta hoàn toàn không cần điều chỉnh pH Môi trường bán rắn là môi trường tĩnh nên sự thay đổi pH ớ một vùng nào đó ít khi ảnh hưởng đến toàn bộ khối môi trường 2.5.4.2 Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 - Trường Đại học cần Thơ Thời gian nuôi nấm sợi thu nhận enzyme vào khoảng 36 ^ 60 giờ Điều này còn phụ thuộc vào chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và điều kiện môi trường cũng như phụ thuộc vào điệu kiện... 2012 Trường Đại học cần Thơ nhất định Tiến hành chọn nồng độ enzyme cần thiết đê trong một thời gian nhất định sẽ thu được sự biến đối nhất định về cơ chất hay sản phâm Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học cần Thơ 2.4.2 Đơn vị hoạt độ của enzyme Khả năng xúc tác của enzyme được xác định thông qua hoạt độ hoạt động của enzyme Hoạt độ hoạt động của enzyme được xác định thông qua đơn vị hoạt. .. Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học cần Thơ Aspergillus oryzae là khoảng 28 -T 32°c Nhiệt độ do nấm mốc tởa ra môi trường có thể lên đến 40°c hoặc cao hoư cần giữ cho nhiệt độ môi trường không xuống dưới 27°c và không quá 36°c Thích họp cho Aspergillus oryzae phát triển là môi trường acid yếu 5,5 -r 6,5 Các môi trường tự nhiên từ cám, đậu, ngô thường có sẵn pH ở khoảng này nên không cần ... nhằm khảo sát hoạt tính enzyme protease trích ly từ Aspergillus oryzcie môi trường rắn với mục tiêu sau: - Ánh hưởng thành phần môi trường pH môi trường khác đến trình sinh tổng họp enzyme protease. .. nghiệp Đại học năm 2012 Trường Đại học cần Thơ Luận văn đính kèm theo đây, với đề tựa “KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME PROTEASE TRÍCH LY TỪ ASPERGILLUS ORYZAE TRÊN MÔI TRƯỜNG RẮN”, “HUỲNH THỊ PHƯƠNG... B3 có hoạt tính enzyme trung bình cao (0,969TƯ/ml) BI có hoạt tính enzyme trung bình thấp (0,643TU/ml) Hình 22 thê hoạt tính enzyme tăng theo thành phần môi trường pH môi trường Hoạt tính enzyme